Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

Summary

Dit artikel beschrijft een optimale volgorde van de gebeurtenissen voor de multimodale beeldvorming van cellulaire grafts in knaagdier hersenen met behulp van: (i) in vivo bioluminescentie en magnetische resonantie beeldvorming, en (ii) post mortem histologische analyse. De combinatie van deze beeldvorming op een enkel dier laat cellulaire graft evaluatie met een hoge resolutie en gevoeligheid en specificiteit.

Abstract

In de afgelopen tien jaar heeft stamceltransplantatie kreeg steeds meer interesse als primaire of secundaire therapeutische modaliteit voor een verscheidenheid van ziekten, zowel in de preklinische en klinische studies. Echter, tot op heden de resultaten met betrekking tot functioneel resultaat en / of weefsel regeneratie volgende stamceltransplantatie zijn zeer divers. Over het algemeen wordt een klinisch voordeel waargenomen, zonder diepgaande kennis van het onderliggende mechanisme (s) ^1. Daarom hebben meerdere inspanningen geleid tot de ontwikkeling van verschillende moleculaire beeldvormende technieken om stamcellen enten met het uiteindelijke doel om nauwkeurig te evalueren overleven, het lot en de fysiologie van geënte stamcellen en / of hun micro-omgeving te bewaken. Veranderingen waargenomen in een of meer parameters bepaald door moleculaire beeldvorming kan worden gerelateerd aan de waargenomen klinisch effect. In deze context, onze studies richten zich op het gecombineerd gebruik van bioluminescentie (BLI), magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en histologische analysis om stamcel transplantatie te beoordelen.

BLI wordt vaak gebruikt om niet-invasief te voeren cel volgen en te controleren overleving van de cel in de tijd na de transplantatie ^2-7, op basis van een biochemische reactie waarbij cellen die de Luciferase-reporter-gen in staat zijn om licht volgende interactie uit te stoten met zijn substraat (bijv. D- luciferine) ^{8, 9.} MRI anderzijds een niet-invasieve techniek die klinisch toepassing ¹⁰ en kan worden gebruikt om nauwkeurig cellulaire grafts lokaliseren met zeer hoge resolutie ^11-15 hoewel de gevoeligheid sterk afhankelijk van het contrast gegenereerd na labeling cel met een MRI contrastmiddel . Tot slot, post-mortem histologische analyse is de methode bij uitstek om onderzoeksresultaten verkregen met niet-invasieve technieken met de hoogste resolutie en gevoeligheid te valideren. Bovendien eindpunt histologische analyse laat ons toe om uit te voeren gedetailleerde fenotypische analyse van geënte cellen en / of het omliggende weefsel, based op het gebruik van fluorescerende reporter eiwitten en / of direct cel labeling met specifieke antilichamen.

Samenvattend kunnen we hier visueel tonen de complementariteit van BLI, MRI en histologie aan verschillende stamcel-en / of milieu-gerelateerde kenmerken na stamcel transplantatie in het CZS van muizen te ontrafelen. Als voorbeeld beenmerg-afgeleide stromacellen, genetisch gemanipuleerd om de versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) en vuurvlieg luciferase (fluctuaties), en voorzien van blauw fluorescerende microscopisch kleine ijzeroxide deeltjes (MPIOs) drukken, worden geënt in de CNS van immuun-competente muizen en het resultaat zal worden gecontroleerd door BLI, MRI en histologie (figuur 1).

Protocol

1. Celpreparaat

1. Experimenten dient te worden gestart met behulp van ex vivo gekweekte stamcellen populaties genetisch gemanipuleerd om de Luciferase en eGFP reporter eiwitten uit te drukken. Hier gebruikt Luciferase / EGFP-expressie muizen beenmerg-afgeleide stromacellen (BMSC-Luc/eGFP) zoals eerder beschreven door Bergwerf et al.. ^{2, 5.}
2. Twee dagen voor cel etikettering plaat BMSC-Luc/eGFP cellen een dichtheid van 8 x 10 ⁵ cellen per T75 fles cultuur in 15 ml compleet medium expansie (CEM) aangevuld met 1 ug / ml Puromycine.
3. Laat cellen gedurende 48 uur toenemen bij 37 ° C en _5% CO2.
4. V....

Discussion

In dit rapport beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor de combinatie van drie elkaar aanvullende beeldvormende technieken (BLI, MRI en histologie) voor gedetailleerde karakterisering van cellulaire implantaten in het CZS van immuun-competente muizen. Een combinatie van reportergen etikettering van de cellen, op basis van genetische modificatie met de reporter genen Firefly luciferase en eGFP, en een direct cel etikettering met GB MPIO, leidt tot een nauwkeurige beoordeling van de stamcellen grafts in vivo.<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
IMDM	Lonza	BE12-722F	Onderdeel van de cel groeimedium CEM
Foetaal runderserum	Gibco	10270-106	Onderdeel van de cel groeimedium CEM
Paardenserum	Gibco	1605-122	Onderdeel van de cel groeimedium CEM
Penicilline-streptomycine	Gibco	15140	Onderdeel van de cel groeimedium CEM
Fungizone	Gibco	15290-018	Onderdeel van de cel groeimedium CEM
PBS	Gibco	14190
Puromycine	Invivogen	ant-pr-1
trypsine	Gibco	25300
GB MPIO	Bangs Laboratories	ME04F/7833
D-luciferine	Promega	E1601
Ketamine (Ketalar)	Pfizer
Xylazine (Rompun)	Bayer Gezondheidszorg
Isofluraan	Isoflo	05260-05
0,9% NaCl-oplossing	Baxter
paraformaldehyde	Merck	1.04005.1000
sucrose	Applichem	A1125
Micro-injectie pomp	KD wetenschappelijke	KDS100
Photon imager	Biospace Lab
9.4 Tesla MR-scanner	Bruker BioSpin	Biospec 94/20 USR
BX51 microscoop	Olympus	BX51
Mycrom HM cryostaat	Prosan	HM525
injectiespuit	Hamilton	7635-01
30 gauge naald	Hamilton	7762-03
Foto Vision software	Biospace Lab
M3vision software	Biospace Lab
Paravision 5.1 software	Bruker BioSpin
Amira 4.0-software	Visage Imaging