Glaswol filters zijn gebruikt om virussen te water te concentreren door een aantal onderzoeksgroepen over de hele wereld. Hier laten we een eenvoudige aanpak voor het construeren van glaswol filters en demonstreren van de filters zijn ook effectief te concentreren op waterbasis virale, bacteriële en protozoa ziekteverwekkers.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Glaswol Filters voor Concentreren op waterbasis Virussen en Landbouw zoönotische pathogenen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De belangrijke eerste stap in de evaluatie pathogeen niveaus in vermoedelijk verontreinigde water is concentratie. Concentratie methoden zijn vaak specifiek voor een bepaalde ziekteverwekker groep, bijvoorbeeld US Environmental Protection Agency Method 1623 voor Giardia en Cryptosporidium 1, wat betekent dat meerdere methoden zijn vereist als de bemonstering programma is gericht op meer dan een pathogeen groep. Een ander nadeel van de huidige methoden is het materiaal kan gecompliceerd en duur, bijvoorbeeld de methode met de VIRADEL 1MDS filterpatroon voor het concentreren virussen 2. In dit artikel beschrijven we hoe u glaswol filters te construeren voor het concentreren van water ziekteverwekkers. Na elutie filter, het concentraat vatbaar is een tweede concentratiestap, zoals centrifugeren, gevolgd door pathogenen detectie en telling van culturele of moleculaire technieken. De filters hebben een aantal voordelen. De bouw is gemakkelijk en de filters kunnen worden gebouwd om eenny grootte om te voldoen aan specifieke eisen bemonstering. Het filter onderdelen zijn niet duur, waardoor het mogelijk is om een groot aantal monsters te verzamelen zonder ernstig impact van een project budget. Grote steekproef volumes (100s tot 1.000 s L) kan worden geconcentreerd afhankelijk van de snelheid van de verstopping van monster troebeling. De filters zijn zeer draagbaar en met een minimum aan apparatuur, zoals een pomp en flowmeter, kunnen ze worden uitgevoerd op het gebied voor het bemonsteren van afgewerkte drinkwater, oppervlaktewater, grondwater, en agrarische afvoer. Tenslotte glaswol filtratie effectief voor het concentreren van een aantal pathogeen type dat slechts een methode nodig. Hier doen we verslag van filter effectiviteit in zich te concentreren op waterbasis menselijke enterovirus, S almonella enterica, Cryptosporidium parvum, en aviaire influenza virus.
Protocol
1. Voorbereiden van de glaswol
- Voor en na het maken van elke partij van filters, steriliseren het werkgebied met 10% bleekwater oplossing.
- Trek handschoenen en een schort. Steriliseren emmer autoclaaf bij 121 ° C en 15 psi gedurende ten minste 20 minuten. Plaats de glaswol in de steriele emmer.
- Verzadig de glaswol met omgekeerde osmose water en laat inwerken gedurende 15 minuten.
- Tap het omgekeerde osmose water uit de emmer.
- Verzadig de glaswol met 1 M HCl en laat inwerken gedurende 15 minuten.
- Giet de 1 M HCl uit de emmer.
- Spoel het glas wol met omgekeerde osmose water.
- Meng goed.
- Controleer de pH met behulp van pH-papier en herhaal de omgekeerde osmose water spoelen tot een neutrale pH-waarde wordt bereikt.
- Giet het spoelwater.
- Verzadig de glaswol met 1 M NaOH en laat inwerken gedurende 15 minuten.
- Giet de 1 M NaOH uit de emmer.
- REPEAT de omgekeerde osmose spoelen tot een neutrale pH-waarde wordt bereikt.
- Giet het spoelwater.
- In plaats van een emmer kan een glaswol ring geconstrueerd, die vergelijkbaar ontwerp met een glazen pipet ring (Figuur 1).
- Geheel op de glaswol met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 6,8.
- Gebruik geprepareerd glaswol direct of op te slaan bij 4 ° C. Het kan worden opgeslagen voor maximaal twee weken. Voor het gebruik van, zorg ervoor dat de pH-neutraal is als het zal stijgen in de tijd. Als de pH niet neutraal, opnieuw wassen met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH 6,8).
2. Montage van de glaswol Filter
- Boor een 11/16 inch gat in de PVC-caps en tik discussies, zodat de mannelijke adapter nylon beslag kan worden geschroefd in de doppen. Deze stap is alleen nodig voor het eerste samenstel. Daarna kan de doppen te jaren gebruikt. Breng Teflontape om de nylon fittingen draden en schroef de doppen.
- Verpak de PVC-buis met kleine stukjes glaswol. Gebruik een metalen zuiger, zoals een auto-motor klep, te strak in te pakken. Verpakking vereist geen grote kracht. Pak zodanig vast dat de glaswol op zijn plaats blijft en kanalen niet te vormen. Echter niet zo strak verpakt water niet kan stromen door de filter. Bij een juiste verpakt, moet een debiet van 4 tot 5 liter per minuut haalbaar wanneer het filter is aangesloten op water kranen met een druk tussen 40-60 psi. Voor de grootte van de PVC buis in dit protocol, ongeveer 85 gram gewassen en verpakt glaswol wordt gebruikt per pijp. Tarra de lege pvc-buizen op een top-loading balans en pak met gewassen glaswol tot aan de buis massa stijgt 85 gram.
- Plaats polypropyleen mesh in de PVC-kappen met mannelijke adapter aangesloten nylon fittingen.
- Hiervoor de teflon tape om de schroefdraad delen van de PVC buis.
- Schroef de PVC doppen op de PVC-pIPE en label een filter uiteinde de instroom en het andere uiteinde de uitstroomopening. Dit is belangrijk voor de later elutiestap. Welke einde is gelabeld instroom maakt niet uit.
- Druk 60 ml steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH = 6,8) in het filter met een catheter gekanteld spuit. Teveel naar buiten komen andere kant.
- Wrap eindigt strak met Parafilm voorkomen lekkage. Filters worden opgeslagen tot 30 dagen bij 4 ° C.
3. Sampling
- Steriliseer slangen worden gebruikt voor monsterneming door recirculeren of onder te dompelen items voor 30 minuten in 0,525% NaClO (dat wil zeggen, een 10% oplossing van standaard bleekmiddel). Volgt dat door het aftappen van de hypochloriet-oplossing en geneutraliseerd met 0,05% natriumthiosulfaat gemaakt door toevoeging van 25 ml van een 2% stock watervrij natriumthiosulfaatoplossing tot een liter omgekeerde osmose.
- Voor monster water met een pH groter dan 7,5, pH tussen 6,5 en 7,0 met HCl. HCl concentratie kan variëren van 0,25M tot en met 1 M. Vier liter 0,5 M HCl is over het algemeen voldoende voor twee 800 liter monsters, afhankelijk van de omgevingstemperatuur van het water pH en buffercapaciteit. Injecteer HCl tijdens bemonstering met een peristaltische pomp of venturi (figuur 2). Pas de snelheid van de pomp of de Venturi opening naar het doel pH te bereiken. Meet de pH op de monsterleiding uitlaat met een veld pH-meter.
- Gebruik een voorfilter als de glaswol filter verstopt uit water met een hoge troebelheid. (Specificaties voor het voorfilter en de behuizing in de lijst Materials online.) Doordat pathogenen worden bevestigd deeltjes gevangen door het voorfilter moet worden geëlueerd met de glaswol filter (zie hieronder).
- Stel het debiet tussen 2 en 4 liter / minuut. Typische monstervolumes zijn tussen de 200 en 1.500 liter.
- Maak de glaswol filter en op te slaan in een plastic steriele zak bij 4 ° C gedurende maximaal 48 uur.
4. Elutie
- Bevestig de glaswol filter om een ringstaan met het monster instroom eind naar beneden in een polypropyleen fles. Elueren tegenover de richting van monsterstroom.
- Druk 80 ml steriele 3% vleesextract in 0,05 M glycine met een pH van 9,5 in het filter.
- Wacht 15 minuten.
- Druk eens 80 ml steriele 3% vleesextract in 0,05 M glycine met een pH van 9,5 in het filter.
- Duw de lucht grondig het filter tot het schuim komt uit de filter inlaat.
- Stel de eluaat pH tussen 7,0 en 7,5 met 1 M HCl.
- Winkel eluaat bij 4 ° C gedurende 24 uur bij -20 ° C voor langere perioden.
- Elueer het voorfilter indien aanwezig. Schroef de bovenkant van de behuizing cartridge en giet korting op alle resterende water in de behuizing terwijl de voorfilter op zijn plaats met een steriele handschoenen aan.
- Verwijder het voorfilter van de behuizing cartridge en zet het in een 15 "x 6" zip-lock zakje.
- Giet 200 ml van de steriele 3% rundvlees-extract in 0,05 M glycine met een pH van 9,5 in de zak en veilig afsluiten met de zip-lock.
- Keren de zakken voorfilter meerdere malen om het gehele oppervlak in contact komt met het vlees extract.
- Wacht 15 minuten, af en toe omkeren en het masseren van de zakken voorfilter.
- Open het zip-lock. Pak de zak rond het voorfilter goed uit te knijpen zo veel rundvlees extract mogelijk en trek de voorfilter met steriele handschoenen,.
- Giet het vlees extract eluaat in een polypropyleen fles.
- Stel de eluaat pH tussen 7,0 en 7,5 met 1M HCl.
- Winkel eluaat bij 4 ° C gedurende 24 uur bij -20 ° C voor langere perioden. De voorfilter eluaat kunnen afzonderlijk geanalyseerd pathogenen of in combinatie met de glaswol filter eluaat.
5. Representatieve resultaten
| Pathogeen | Troebelheid van het water-niveau (NTU) een | Hoeveelheid Seeded / L b, c, d | Herstel% ± 1 SD | Aantal onafhankelijke onderzoeken |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 0,5 | 500 | 81% ± 11 | 7 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 0,5 | 5000 | 67% ± 12 | 8 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 215 | 500 | 59% ± 32 | 7 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 215 | 5000 | 38% ± 22 | 6 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 447 | 500 | 56% ± 18 | 8 |
| Enterovirus-Poliovirus Sabin III | 447 | 5000 | 63% ± 37 | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 0,5 | 5 | 38% ± 14 | 7 |
| Cryptosporidium parvum | 0,5 | 50 | 53% ± 19 | 8 |
| Huilenptosporidium parvum | 215 | 5 | 40% ± 16 | 7 |
| Cryptosporidium parvum | 215 | 50 | 30% ± 6 | 6 |
| Cryptosporidium parvum | 447 | 5 | 33% ± 13 | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 447 | 50 | 28% ± 11 | 8 |
| Salmonella enterica | 0,5 | 5 | 29% ± 24 | 7 |
| Salmonella enterica | 0,5 | 500 | 56% ± 16 | 8 |
| Salmonella enterica | 215 | 5 | 32% ± 24 | 7 |
| Salmonella enterica | 215 | 500 | 34% ± 11 | 6 |
| Salmonella enterica | 447 | 5 | 34% ± 18 | 8 |
| Salmonella enterica | 447 | 500 | 31% ± 24 | 8 |
- Nefelometrische Troebelheid Unit
- Enterovirussen opgesomd door qPCR als genomische kopieën / L
- C. parvum opgesomd door immunofluorescentie als oöcysten
- S. enterica opgesomd door cultuur als kolonie-vormende-eenheden
Tabel 1. Glaswol concentratie met verschillende water troebelingen en pathogeen dichtheden.
| Pathogeen | Watermonster Woonplaats | Bedrag Seeded / L een | % Reco zeer |
| Aviaire Influenza H5N2 | Sundi Lake, Anchorage Borough | 2500 | 42,9% |
| Aviaire Influenza H5N2 | Minto Flats, Fairbanks North Star Borough | 2500 | 36,7% |
| Aviaire Influenza H5N2 | Portage Valley, Anchorage Borough | 2500 | 7,8% |
| Aviaire Influenza H5N2 | Potter Marsh, Anchorage Borough | 2500 | 41,5% |
| Aviaire Influenza H5N2 | Willow Lake, Yukon-Koyukuk Borough | 2500 | 15,5% |
- Gemeten naar qPCR als genomische kopieën / L
Tabel 2. Glaswol concentratie van aviaire influenza virus met behulp van water uit vijf locaties in Alaska.
les/ftp_upload/3930/3930fig1.jpg "alt =" Figuur 1 "/>
Figuur 1. Schema van glaswol wasmachine. Dit kan in plaats van een emmer worden gebruikt, bespaart u tijd uit te spoelen. Het concept is vergelijkbaar met een glazen pipet wasmachine.
Figuur 2. Glaswol filtratie met zuur injectie door peristaltische pomp. Let op de "T"-connector waar de pompslang zuur introduceert in het monster lijn tussen de waterkraan en glaswol filter. pH aanpassing noodzakelijk indien het bemonsterde water een pH> 7,5.
Glaswol filters effectief concentratie pathogenen water met een groot aantal vertroebeling en pathogeen dichtheden (Tabel 1). Om dit te testen, werd 20 liter chloorvrij leidingwater vermengd met gedroogde slib leemgrond (0, 1,27, of 2,75 g / L) om het gewenste niveau van troebelheid te bereiken en vervolgens ingezaaid met ziekteverwekkers in verschillende dichtheden. Het waterwerd door een glaswol filter werd de geconcentreerde pathogenen in het eluaat opgenoemd en deze waarde de teller in het percentage herstel berekening. De hoeveelheid pathogenen geënt in het water, dat wil zeggen de noemer van het percentage herstel berekening werd bepaald door eerst zaaien ziekteverwekkers in een negatieve eluaat dan sommen de ziekteverwekkers. De negatieve eluaat werd voorbereid door het passeren van een ongeplaatste 20 liter monster door een filter en het elueren. Het kwantificeren van de gezaaid pathogenen in een negatieve eluaat voorkomt verschillen in de ziekteverwekker opsomming die zou kunnen voortvloeien uit matrix verschillen ontstaan door de glaswol filter. Het belang van deze stap bij het kwantificeren van ziekteverwekkers door qPCR wordt besproken in Lambertini et al.. 3. Een 20 liter negatieve controle monster werd geconcentreerd via glaswol filtratie om vast te stellen waren er geen inheemse ziekteverwekkers aanwezig zijn, dat het percentage herstelberekening kon beschamen. Een 10 micrometer nominale poriegrootte voorfilter wzoals gebruikt bij de troebelheid niveau was ≥ 215 NTU.
Poliovirus werd gekwantificeerd door real-time qPCR hand van een tweede concentratie en nucleïnezuur extractie procedures en primers en probe beschreven in Lambertini et al.. 3. Cryptosporidium parvum werd gekwantificeerd in de laatste geconcentreerde monstervolume (FCSV) gemaakt door de secundaire concentratie procedure voor het poliovirus . Oöcysten werden gevisualiseerd door immunofluorescentie (MeriFluor Cryptosporidium en Giardia Detection Kit, Meridian Life Science, Inc, Cincinnati, OH). Salmonella enterica werd gekwantificeerd in de FCSV door platen op XLD agar (Remel, Lenexa, KS) en het tellen van kolonievormende- eenheden.
Glaswol filters effectief concentratie aviaire (tabel 2). Laagpathogene aviaire influenza virus (H5N2) werd gezaaid in water van verschillende locaties in Alaska en het percentage herstel berekend zoals beschreven Above. Secundaire concentratie nucleïnezuur procedures werden uitgevoerd zoals voor poliovirus, het virus werd gekwantificeerd door qPCR met de primers en probe beschreven in Spackman et al. 4.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Glaswol filters zijn gebruikt door verschillende onderzoeksteams 3,5,6 voor de menselijke enterische virussen concentreren van een verscheidenheid van waterbronnen, zoals afgewerkt drinkwater 7, het grondwater 8,9, het oppervlaktewater 10, zeewater 11, afvalwater 12 en agrarische afvoer 13. Hier beschrijven we de filters zijn ook effectief te concentreren aviaire influenza-virus en de bacteriële en protozoa pathogenen Salmonella enterica
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij danken William T. Eckert voor het vertellen van de video. De ontwikkeling van de glaswol protocol maakte deel uit van de Wisconsin water en gezondheid Trial voor Enteric's (WAHTER Study), gefinancierd door de Amerikaanse EPA STAR Grant R831630. Alaska monsters werden verzameld door A. Reeves, A. Ramey, en B. Meixell met financiële steun van USGS. Elk gebruik van de handel, product of bedrijf namen is voor beschrijvende doeleinden en impliceert geen goedkeuring door de Amerikaanse overheid.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens of item | Vennootschap | Catalogusnummer | |
| Zoutzuur | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Natriumhydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing Natriumchloride Kaliumfosfaat-dibasisch Kaliumfosfaat-monobasisch | Fisher Scientific Fisher Scientific Fisher Scientific | BP358-212 BP363-500 BP362-500 | |
| Natriumhypochloriet dat wil zeggen, bleekwater | De Clorox Co | ||
| Natriumthiosulfaat, watervrij | Fisher Scientific | S 475-212 | |
| Beef extract, gedroogd | Becton, Dickinson and Company | 211520 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G46-500 | |
| Geoliede sodocalcic glaswol Of R-11 unfaced glasvezelisolatie | Isover ref = "http://www.jm.com" target = "_blank"> Johns Manville | Bourre 725 QN | |
| Polypropyleen mesh | Industriële Netting | xN4510 | |
| 2 "x4" Sch 80 PVC-buizen met schroefdraad tepel | Grainger | 6MW35 | |
| 2 "Sch 40 PVC dop | Grainger | 5WDW3 | |
| Man adapter nylon fitting (1/2 "x 1/2") | VS Plastic Corp | 62178 | |
| Voorbeeld flessen eluaat-1 liter | Fisher Scientific | 03 tot 313-4F | |
| 60 ml spuit | "Http://www.fishersci.com" target = "_blank"> Fisher Scientific | NC9661991 | |
| pH-strips | Whatman papier | 2614 991 | |
| Voorfilter, Polypropyleen, 10 inch cartridge, 10 pm | McMaster-Carr | 4411K75 | |
| Voorfilter behuizing | Cole Parmer- | S-29820-10 |
Referenties
- US Environmental Protection Agency. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. EPA 815-R-05-002. , (2012).
- Cashdollar, J. L., Dahling, D. R. Evaluation of a method to re-use electropositive cartridge filters for concentrating viruses from tap and river water. J. Virol. Methods. 132, 13-17 (2006).
- Lambertini, E. Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2990-2996 (2008).
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcription PCR assay for Type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Environment Agency. Optimisation of a new method for detection of viruses in groundwater. Report No. NC/99/40. , Environment Agency, National Groundwater and Contaminated Land Centre. West Midlands, United Kingdom. (2000).
- Vilaginés, P., Sarrette, B., Husson, G., Vilaginés, R. Glass wool for virus concentration at ambient water pH level. Water Sci. Technol. 27, 299-306 (1993).
- Vivier, J. C., Ehlers, M. M., Grabow, W. O. Detection of enteroviruses in treated drinking water. Water Res. 38, 2699-2705 (2004).
- Powell, K. L. Enteric virus detection in groundwater using a glass wool trap. In: Groundwater: Past Achievements and Future Challenges. Sililo, O. , Balkema, Rotterdam. 813-816 (2000).
- Hunt, R. J., Borchardt, M. A., Richards, K. D., Spencer, S. K. Assessment of sewer source contamination of drinking water wells using tracers and human enteric viruses. Environ. Sci. Technol. 44, 7956-7963 (2010).
- van Heerden, J., Ehlers, M. M., Heim, A., Grabow, W. O. Prevalence, quantification and typing of adenoviruses detected in river and treated drinking water in South Africa. J. Appl. Microbiol. 99, 234-242 (2005).
- Vilaginés, P. Round robin investigation of glass wool method for poliovirus recovery from drinking water and sea water. Water Sci. Technol. 35, 445-449 (1997).
- Gantzer, C., Senouci, S., Maul, A., Levi, Y., Schwartzbrod, L. Enterovirus genomes in wastewater: concentration on glass wool and glass powder and detection by RT-PCR. J. Virol. Methods. 65, 265-271 (1997).
- Pathogen losses in surface water runoff from dairy manure applied to corn fields. Borchardt, M. A., Jokela, W. E., Spencer, S. K. American Society for Microbiology General Meeting, New Orleans, LA, , (2011).
- Deboosere, N. Development and validation of a concentration method for the detection of influenza A viruses from large volumes of surface water. Appl. Environ. Microbiol. 77, 3802-3808 (2011).
- Lambertini, E. Virus contamination from operation and maintenance practices in small drinking water distribution systems. J. Water Health. 9, 799-812 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
