In dit artikel wordt een eenvoudige, kwantitatieve, vloeibare fase affiniteit capture assay gepresenteerd. Het is een betrouwbare techniek op de interactie tussen het magnetische kralen en gemerkte eiwitten (bijv. nanobodies) enerzijds en de affiniteit tussen het gemerkte eiwit en een tweede, gemerkt eiwit (bijv. poliovirus) anderzijds.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een vloeibare fase Affiniteit Capture test met behulp van magnetische korrels aan eiwit-eiwit interactie te bestuderen: het poliovirus-Nanobody Voorbeeld
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In dit artikel wordt een eenvoudige, kwantitatieve, vloeibare fase affiniteit capture assay gepresenteerd. Op voorwaarde dat een eiwit kan worden gelabeld en een ander eiwit gelabeld, kan deze methode worden toegepast voor het onderzoek van eiwit-eiwit interacties. Het is gebaseerd op enerzijds op het inzicht gemerkte eiwit door kobalt beklede magnetische kralen en anderzijds op de interactie tussen het gelabelde eiwit en een tweede specifieke eiwit dat wordt aangeduid. Eerst worden de etiketten en gemerkte eiwitten gemengd en geïncubeerd bij kamertemperatuur. De magnetische kralen, dat het label herkennen toegevoegd en de gebonden fractie van gemerkt eiwit wordt gescheiden van de ongebonden fractie met magneten. De hoeveelheid gemerkte eiwitten die opgenomen kan worden bepaald op indirecte wijze door meting van het signaal van de gemerkte eiwitten bleven in de ongebonden fractie. De beschreven vloeibare fase affiniteit test is zeer nuttig wanneer conformationele conversie gevoelige eiwitten zijn kontAyed. De ontwikkeling en toepassing van de test is aangetoond voor de interactie tussen poliovirus en het poliovirus herkennen van nanobodies 1. Aangezien poliovirus gevoelig conformationele conversie 2 wanneer gehecht aan een vaste ondergrond (ongepubliceerde resultaten), is het gebruik van ELISA beperkt en een vloeistoffase systeem derhalve de voorkeur. Een voorbeeld van een vloeibare fase systeem vaak gebruikt in polioresearch 3,4 de micro proteïne-A-immunoprecipitatie test 5. Hoewel deze test heeft bewezen de toepasbaarheid, het vereist een Fc-structuur, die afwezig is in de nanobodies 6,7. Echter, zoals een andere mogelijkheid, kunnen deze interessante en stabiele enkel-domein antilichamen 8 gemakkelijk worden gemanipuleerd met verschillende tags. De gebruikte (His) 6-tag affiniteit voor tweewaardige ionen zoals nikkel of kobalt, die gemakkelijk op hun beurt worden aangebracht op magnetische korrels toont. Hiervoor werden deze eenvoudige kwantitatieveaffiniteit capture assay op basis van kobalt gecoate magnetische kralen. Poliovirus werd gelabeld met 35 S om ongehinderd interactie met de Nanobodies mogelijk te maken en een kwantitatieve detectie mogelijk. De methode is eenvoudig uit te voeren en kunnen worden tegen lage kosten, die verder wordt ondersteund door de mogelijkheid effectief regenereren van de magnetische korrels.
Protocol
Het principe (A) en een overzicht van de werkwijze (B) worden weergegeven in Figuur 1.
1. Voorbereiding van de buffer
- Bereid Binding / wasbuffer door oplossen natriumdiwaterstoffosfaat (50 mM) en natriumchloride (300 mM) in water en de pH tot 8,0. Daarnaast voegen Tween 20 (0,01% (m / v) eindconcentratie), methionine (2% (m / v) eindconcentratie) en albumine (0,1% (m / v) eindconcentratie) en aan te passen aan het gewenste volume.
2. Voorbereiding van de magnetische beads
Bereid de magnetische korrels volgens de gebruiksaanwijzing. In het kort:
<....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In het protocol wordt de radioactiviteit van het antigeen interactie met de nanobody gedefinieerd als het verlies van radiogelabelde virus uit de supernatant. Daarom is de hoeveelheid neergeslagen radioactiviteit (= 100 - a%) (gebonden aan de magnetische korrels) worden geschat op een indirecte wijze de radioactiviteit in het supernatant (= a%). Anderzijds is het ook mogelijk om de radioactiviteit van het neergeslagen gebonden fractie van antigen te meten op directe wijze door elutie de immunocomplexen van de magnetisch.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Wij hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs danken de medewerkers van de afdeling Farmaceutische Biotechnologie en Moleculaire Biologie en in het bijzonder Monique De Pelsmacker voor de voorbereiding van de radioactief gemerkte virus. We zijn dankbaar voor Ellen Merckx en Hadewych Halewyck voor hun interessante opmerkingen en discussies en aan Gerrit De Bleeser voor zijn hulp in het lab. Dit werk werd financieel ondersteund door een OZR toekenning van de Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) en de World Health Organization (TSA 200.410.791). Lise Schotte is een predoctorale fellow van het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaander....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum Bedrijf Catalogus nummer Commentaar | |||
| Dynabeads His-tag Isolatie en Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetische kralen |
| Optiphase 'HiSafe' 2 | Perkin Elmer | 1200 - 436 | Scintillatievloeistof |
Referenties
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
