Een vloeibare fase Affiniteit Capture test met behulp van magnetische korrels aan eiwit-eiwit interactie te bestuderen: het poliovirus-Nanobody Voorbeeld

Samenvatting

In dit artikel wordt een eenvoudige, kwantitatieve, vloeibare fase affiniteit capture assay gepresenteerd. Het is een betrouwbare techniek op de interactie tussen het magnetische kralen en gemerkte eiwitten (bijv. nanobodies) enerzijds en de affiniteit tussen het gemerkte eiwit en een tweede, gemerkt eiwit (bijv. poliovirus) anderzijds.

Samenvatting

In dit artikel wordt een eenvoudige, kwantitatieve, vloeibare fase affiniteit capture assay gepresenteerd. Op voorwaarde dat een eiwit kan worden gelabeld en een ander eiwit gelabeld, kan deze methode worden toegepast voor het onderzoek van eiwit-eiwit interacties. Het is gebaseerd op enerzijds op het inzicht gemerkte eiwit door kobalt beklede magnetische kralen en anderzijds op de interactie tussen het gelabelde eiwit en een tweede specifieke eiwit dat wordt aangeduid. Eerst worden de etiketten en gemerkte eiwitten gemengd en geïncubeerd bij kamertemperatuur. De magnetische kralen, dat het label herkennen toegevoegd en de gebonden fractie van gemerkt eiwit wordt gescheiden van de ongebonden fractie met magneten. De hoeveelheid gemerkte eiwitten die opgenomen kan worden bepaald op indirecte wijze door meting van het signaal van de gemerkte eiwitten bleven in de ongebonden fractie. De beschreven vloeibare fase affiniteit test is zeer nuttig wanneer conformationele conversie gevoelige eiwitten zijn kontAyed. De ontwikkeling en toepassing van de test is aangetoond voor de interactie tussen poliovirus en het poliovirus herkennen van nanobodies ^1. Aangezien poliovirus gevoelig conformationele conversie ² wanneer gehecht aan een vaste ondergrond (ongepubliceerde resultaten), is het gebruik van ELISA beperkt en een vloeistoffase systeem derhalve de voorkeur. Een voorbeeld van een vloeibare fase systeem vaak gebruikt in polioresearch ^3,4 de micro proteïne-A-immunoprecipitatie test ^5. Hoewel deze test heeft bewezen de toepasbaarheid, het vereist een Fc-structuur, die afwezig is in de nanobodies ^6,7. Echter, zoals een andere mogelijkheid, kunnen deze interessante en stabiele enkel-domein antilichamen ⁸ gemakkelijk worden gemanipuleerd met verschillende tags. De gebruikte (His) _6-tag affiniteit voor tweewaardige ionen zoals nikkel of kobalt, die gemakkelijk op hun beurt worden aangebracht op magnetische korrels toont. Hiervoor werden deze eenvoudige kwantitatieveaffiniteit capture assay op basis van kobalt gecoate magnetische kralen. Poliovirus werd gelabeld met ³⁵ S om ongehinderd interactie met de Nanobodies mogelijk te maken en een kwantitatieve detectie mogelijk. De methode is eenvoudig uit te voeren en kunnen worden tegen lage kosten, die verder wordt ondersteund door de mogelijkheid effectief regenereren van de magnetische korrels.

Protocol

Het principe (A) en een overzicht van de werkwijze (B) worden weergegeven in Figuur 1.

1. Voorbereiding van de buffer

1. Bereid Binding / wasbuffer door oplossen natriumdiwaterstoffosfaat (50 mM) en natriumchloride (300 mM) in water en de pH tot 8,0. Daarnaast voegen Tween 20 (0,01% (m / v) eindconcentratie), methionine (2% (m / v) eindconcentratie) en albumine (0,1% (m / v) eindconcentratie) en aan te passen aan het gewenste volume.

2. Voorbereiding van de magnetische beads

Bereid de magnetische korrels volgens de gebruiksaanwijzing. In het kort:

1. Resuspendeer de magnetische korrels met behulp van een vortex.
2. Transfer voor elk monster 10 ul van de geresuspendeerde magnetische kralen (40 mg / ml) in een buis.
3. Verzamel de magnetische korrels met behulp van een magneet, tot de bovenste is duidelijk (+ / - 30 sec) en verwijder het supernatant voorzichtig.
4. Was hetmagnetische kralen tweemaal: mengen van de korrels in 150 pi Binding / wasbuffer. Migreren de magnetische korrels aan een zijde van de buis met een magneet tot de bovenste duidelijk en verwijder de supernatant.
5. Gebruik 40 pl Binding / wasbuffer voor elk monster op de parels (10 mg / ml) mengen.

3. Affiniteit Capture Assay

Opmerking: Om de (kosmische) achtergrond radioactiviteit (0% radioactiviteit) te meten, geen radioactief gemerkte virus wordt toegevoegd aan een controle monster 1. In plaats daarvan wordt hetzelfde volume Binding / wasbuffer toegevoegd.

Opmerking: 100% radioactiviteit bepaald door een controle monster 2 waaraan alle componenten toegevoegd behalve de nanobody. In plaats daarvan wordt hetzelfde volume Binding / wasbuffer toegevoegd.

1. Breng 2000 cpm ³⁵ S gelabeld (β-straling) poliovirus type 1 Sabin stam ⁹ verdund met Binding / wasbuffer 80 pi in een 96-wel microtiter plaat.
2. Voeg 10 & mu; l nanobody in de putjes aan.
3. Meng gedurende ongeveer 10 seconden met behulp van een shaker.
4. Laat de monsters geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
5. Voeg 40 ul van de gewassen magnetische korrels suspensie en incuberen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder continu schudden.
6. Scheid de hielen en de supernatant met een magneet en dragen de heldere supernatant in een buis.

4. Meting van de radioactiviteit

1. Breng 50 ul van het supernatant van stap 3.6 een kolf toe.
2. 3 ml scintillatievloeistof en meng. Meet de radioactiviteit in een β-scintillatieteller.

5. Recycling van Beads

1. Verzamel de gebruikte magnetische korrels in een buis en centrifugeer op 500 xg gedurende 2 minuten of totdat een heldere bovenstaande vloeistof wordt verkregen.
2. Verwijder het supernatant en resuspendeer de kralen in 6 ml 0,5 M NaOH.
3. Doe de suspensie in multiple buizen en incubeer in een ultrasoonbad gedurende 5 minuten.
4. Gebruik de magneten om de magnetische korrels te verzamelen en de supernatant te verwijderen.
5. Voeg 1 ml 2% SDS-oplossing voor elke buis en resuspendeer met behulp van een vortex. Kook gedurende 5 minuten.
6. Verzamel de kralen en verwijder het supernatant. Resuspenderen de korrels in 1 ml 0,2 M EDTA (pH = 7).
7. Incubeer de buizen in een ultrasoon bad gedurende 5 minuten en weer, de bovenstaande vloeistof.
8. Voeg 1 ml water aan elke buis en resuspendeer de kralen. Verzamel de kralen en verwijder het supernatant. Tweemaal Herhaal deze wasstap.
9. Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de kralen in 1 ml 10 mM CoCl _2-oplossing. Zet op een shaker voor 10 minuten.
10. Verwijder de supernatant met een magneet aan de parels te verzamelen en hersuspenderen in 1 ml Binding / wasbuffer.
11. Verwijder de supernatant en was de korrels twee keer met 1 ml 20% (v / v) ethanol
12. Resuspenderen de korrels in hun oorspronkelijke volume van 20% (v / v) ethanol op geregenereerde korrels verkregen in een concentratie van 40 mg / ml.

6. Interpretatie van de resultaten

1. Controle voorbeeld 1, waarin geen gelabeld virus werd toegevoegd, wordt gebruikt om te corrigeren voor de achtergrond radioactiviteit en de radioactiviteit 0% te stellen. Controle voorbeeld 2, die niet het nanobody en waarbij bijgevolg alle radiogelabelde virus blijft in de supernatant wordt ingesteld als 100% radioactiviteit waarde.
2. Het percentage van de radioactiviteit in het supernatant (= a%) is een maat voor de totale neerslag (= 100 - in%) van het radioactief gemerkte virus de nanobody.

7. Representatieve resultaten

Representatieve resultaten voor deze affiniteit vangen assay zijn weergegeven in de figuren 2, 3 en 4. In figuur 2 is de affiniteit van PVSS38C een nanobody specifiek voor poliovirus als aangegeven. De affiniteit van PVSS38C werd getest bij drie verschillende antigenen van poliovIrus: Native-antigeen (N-antigeen), Verwarmd-antigeen (H-antigeen) en 14S subeenheden. N-antigeen intacte virus dat infectieuze. Wanneer het virus wordt verwarmd (20 minuten bij 56 ° C) of aan een vast oppervlak (niet gepubliceerde resultaten), de conformatie van de capside, resulterend in een (gedeeltelijk) verlies van het virale RNA en capside-eiwit VP4 en lege capsiden worden gevormd die genoemd H-antigenen. 14S subeenheden zijn de montage tussenproducten. Deze antigenen worden herkend door verschillende sets van antilichamen na immunisatie ¹⁰ en bezit dus verschillende epitopen en antigene plaatsen. In de figuur is het percentage radioactiviteit in het supernatant wordt als functie van de concentratie van nanobody. Het blijkt dat de radioactiviteit in het supernatant van de monsters met radioactief gemerkte 14S subeenheden afneemt met toenemende concentraties van het nanobody PVSS38C. Dit kan vertaald worden als een toename van de hoeveelheid van poliovirus 14S subeenheden conaangesloten op de nanobody PVSS38C en indirect aan de magnetische korrels. Het vastleggen van titer (= de concentratie van Nanobody nodig is om 50% van de radioactief gemerkte virus vast te leggen) kan grafisch worden berekend als 0,099 nM. Geen affiniteit van PVSS38C de N-antigene H-antigene vorm van poliovirus waargenomen. Uit deze gegevens wordt geïnterpreteerd dat PVSS38C wordt interactie met een epitoop die uitsluitend aanwezig in de 14S-subeenheid en niet op de twee andere antigene vormen van poliovirus.

Om aan te tonen dat het verlies van radioactiviteit in de supernatant alleen door de specifieke affiniteit van het nanobody naar zijn antigenen dezelfde test uitgevoerd met NB1, een Nanobody die tegen de lrpB transcriptionele regulator van Sulfolobus sulfataricus en bekende geen interactie met een poliovirus antigen. Het resultaat van deze test is in figuur 3. Alle radiogelabelde virus blijft in de supernatanten blijkt dat er geen reactiviteitNB1 tegen de drie antigene vormen van poliovirus.

Reproduceerbaarheid van de resultaten werd getest door het experiment te herhalen voor een totaal van acht keer voor een bepaald nanobody (bijvoorbeeld PVSP29F) op verschillende dagen door verschillende personen. De resultaten worden getoond in Figuur 4. De gemiddelde waarde van percentage radioactiviteit in het supernatans werd berekend voor elk nanobody concentratie en wordt in overeenstemming met de standaardafwijking.

Figuur 1. Een overzicht van het principe (A) en de werkwijze (B) van de test. A. His-gelabelde nanobodies die specifiek herkennen een bepaalde poliovirus antigeen in staat zal zijn om te communiceren met de kobalt-gecoate magnetische korrels en zal neerslaan van de radioactief gelabelde virus. B. His-gelabelde Nanobodies worden toegevoegd aan radioactief gelabelde poliovirus en geïncubeerd. Kobalt-beklede magnetische kralentoegevoegd en magnetische scheiding van gebonden / ongebonden antigeen wordt uitgevoerd. De radioactiviteit van de supernatant wordt gemeten en de hoeveelheid opgevangen antigeen kan worden afgeleid.

Figuur 2. Magnetische kralen affiniteit vangst van verschillende poliovirus antigenen door nanobody PVSS38C. Het percentage radioactiviteit in het supernatant wordt als functie van de concentratie van PVSS38C. Voor een concentratie 14S-respons te vinden, die de interactie van PVSS38C met een epitoop uitsluitend aanwezig 14S. Geen significante interactie met N-, of H-antigeen kan worden gedetecteerd, hoewel een gering aspecifieke vastleggen zeer hoge concentraties opgemerkt.

Figuur 3. Magnetische kralen affiniteit vangst van verschillende poliovirus antigenen door nanobody NB1 . Het percentage radioactiviteit in het supernatant wordt als functie van de concentratie van NB1. NB1 is bekend geen interactie met poliovirus-antigeen of-subeenheid hebben. Aangezien 100% van de radioactiviteit in het supernatant, geen virus was niet specifiek gebonden aan NB1. Het verlies van radioactiviteit in figuur 2 is dus alleen door de specifieke affiniteit van het nanobody naar zijn antigenen.

Figuur 4. Reproduceerbaarheid van de test. De gemiddelde waarde van percentage radioactiviteit in het supernatant wordt als functie van de concentratie van nanobody. Het experiment werd herhaald acht keer op verschillende dagen en door verschillende personen. De standaarddeviatie wordt voorgesteld als verticale balken.

Discussie

In het protocol wordt de radioactiviteit van het antigeen interactie met de nanobody gedefinieerd als het verlies van radiogelabelde virus uit de supernatant. Daarom is de hoeveelheid neergeslagen radioactiviteit (= 100 - a%) (gebonden aan de magnetische korrels) worden geschat op een indirecte wijze de radioactiviteit in het supernatant (= a%). Anderzijds is het ook mogelijk om de radioactiviteit van het neergeslagen gebonden fractie van antigen te meten op directe wijze door elutie de immunocomplexen van de magnetisch...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dynabeads His-tag Isolatie en Pulldown	Invitrogen	101.03D	Magnetische kralen
Optiphase 'HiSafe' 2	Perkin Elmer	1200 - 436	Scintillatievloeistof