Methodenartikel

In vitro Elektroporatie van de Tweede Rhombic Lip van Midgestation muizenembryo's

10K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/3983

⸱

3 augustus 2012

 ,  ,  , 
1Biology Department, University of Illinois at Springfield

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie beschrijft de ontwikkeling van een In vitro Electroporatie techniek die het mogelijk maakt voor de manipulatie van genexpressie in de onderste lip van ruitvormige midgestation embryo's.

Samenvatting

De ruitvormige lip is een embryonale neuroepithelium in de achterhersenen op het knooppunt tussen de neurale buis en het dak zelf van het vierde ventrikel (beoordeeld in 1). De ruitvormige lip kan worden onderverdeeld in de bovenste ruitvormige lip (URL), die rhombomere 1 (R1) omvat en genereert neuronen van het cerebellum en de onderste ruitvormige lip (LRL) die aanleiding geeft tot diverse neuronale hersenstam lijnen 2-4. LRL derivaten omvatten de auditieve neuronen van de slakkenhuis kernen en die van de precerebellar kernen die betrokken zijn bij de regulering evenwicht motorbesturing 5-8. Neurogenese van de LRL optreedt over een grote tijdelijke venster dat embryonale dagen (E) 9.5-16.5 5, 9 omvat. Verschillende neuronale lijnen komen uit de LRL als postmitotische cellen (of zijn geboren) in verschillende ontwikkelings-dagen tijdens deze neurogene venster.

Elektroporatie van genexpressie constructen kunnen worden gebruiktmanipuleren genexpressie in LRL voorlopers en kan mogelijk veranderen het lot van de neuronen uit deze regio 10-12. Het veranderen van genexpressie van LRL voorlopercellen in de muis via de in de baarmoeder elektroporatie is zeer succesvol gebleken voor het manipuleren van lineages geboren op embryonale dag E12.5 of later 10, 12-14. In utero electroporations voorafgaand aan E12.5 zijn vooral succesvol vanwege de letaliteit geassocieerd met aanprikken van de vierde ventrikel dak zelf, een noodzakelijke stap in het leveren van exogene DNA dat wordt geëlektroporeerd in de LRL. Echter, veel LRL afgeleid lijnen komen voort uit de LRL eerder dan E12.5 9. Deze eerder geboren lijnen zijn de neuronen die de laterale reticulaire omvatten, externe cuneate, en inferieure olivaris kernen van de precerebellar systeem met als functie het input van het ruggenmerg en de hersenschors verbinden met de kleine hersenen 5. Om uitdrukking in de LRL te manipulerenvan embryo's jonger dan E12.5, ontwikkelden we een in vitro systeem waarin embryo's worden in de cultuur geplaatst na elektroporatie.

Deze studie geeft een efficiënte en effectieve methode voor het manipuleren van de genexpressie van LRL voorlopercellen op E11.5. Embryo's geëlektroporeerd met groen fluorescerend eiwit (GFP) verdreven uit de over het algemeen actieve CAG promotor reproduceerbaar uitgedrukt GFP na 24 uur van de cultuur. Een cruciaal aspect van deze test is dat de genexpressie wordt alleen gewijzigd als gevolg van de expressie van het exogene gen en niet omwille van secundaire effecten die het gevolg zijn van de elektroporatie en het kweken technieken. Er werd vastgesteld dat de endogene genexpressie patronen ongestoord blijft geëlektroporeerde en gekweekte embryo's. Deze test kan worden gebruikt om het lot van cellen die uit de LRL van embryo's jonger dan E12.5 door de introductie van plasmiden voor overexpressie te wijzigen of knock down (door middel van RNAi) van verschillende pro-neurale transcriptiefactoren.

Protocol

1. Preparaten Voor elektroporatie

  1. Amplify het DNA voor elektroporatie met een maxi prep (Prime-It of Qiagen). De concentratie van de DNA moet minimaal 1 mg / ml voor een efficiënte opname zijn.
  2. Verwijder 495 pi van DNA en meng met 5 pi 0,01% Fast Green in een X PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) in een microcentrifugebuisje.

2. Embryonale Harvest

  1. Stel getimede paringen van CD-1 muizen (Harlan). Controleer op de aanwezigheid van vaginale stekkers en beschouwen de datum waarop een vaginale plug wordt waargenomen als embryonale dag (E) 0,5. Embryo's worden geoogst 11 dagen na het visualiseren van plug (E11.5).
  2. Plaats gesteriliseerde instrumenten in 70% ethanol. Behandel een laminaire stroming kap met UV licht gedurende minstens een uur voor gebruik. Buiskap, ontleden lade en ontleden van omvang met 70% ethanol. Verwarm 1 X PBS tot 37 ° C.
  3. Op E11.5 euthanaseren de vrouwelijke volgens de voorwaarden die zijn goedgekeurd door het Institutional Comite voor de zorg en het gebruik van dieren (ICCUA). Plaats ontleden lade in het laminaire stroming kap. Spuit het achterlijf van het vrouwtje met 70% ethanol.
  4. Open de buikholte en speld de muren tot de ontleden lade. Trek de baarmoederhoorns, zodat het rust in de buikholte.
  5. Knip voorzichtig openen de wand van de baarmoeder hoorn. Gebruik een 20 mm lepel (Fijn wetenschappelijke instrumenten) om de embryo verwijder voorzichtig in de dooierzak weg van de placenta. Plaats embryo's in een 100 mm weefselkweek schotel voorgevuld met 10 ml steriel 1 X PBS dat werd voorverwarmd in 2.2.
  6. Herhaal dit voor alle embryo's aanwezig.

3. Elektroporatie van E11.5 embryo's (Figuur 1)

  1. Een 20 mm Schep eerste embryo een nieuwe 100 mm schaal voorgevuld met 10 ml steriele 1XPBS die voorverwarmd was tot 37 ° C.
  2. Gebruik 11 cm pincet met een 0,05 x 0,02 mm tip (Fijn wetenschappelijke instrumenten) om zorgvuldig opnieuwbewegen en gooi de dooierzak.
  3. Plaats embryo zodat de rugzijde naar boven, zodat het lijkt op de cartoon in figuur 1A. Gebruik 7 mm elektrode paddles (Harvard Apparatus) om voorzichtig te houden van de embryo. De elektroden moeten worden geplaatst aan weerszijden van de neurale buis ter hoogte van de achterhersenen vierde ventrikel. Het ventrikel is zichtbaar met het blote oog, maar met behulp van een dissectie microscoop kan vergemakkelijken nauwkeurige paddle plaatsing. Plaatsing van de peddels is cruciaal voor het bepalen van de regio die de geëlektroporeerde DNA ontvangt. Als het onderste rhombische lip (LRL) van het dorsale embryonale achterhersenen gewenst is moet schoepen zijn zodanig plaats, dat deze rechtstreeks het breedste deel van het vierde ventrikel opening flankerende.
  4. Gebruik een 1 cc injectiespuit met het opstellen van het plasmide DNA gemengd met 0,01% snel groen. 500 pi van het mengsel voldoende zijn voor de elektroporatie van ten minste 8-10 embryo's (zie 3.5).
  5. Voorzichtig doorboren het dak zelf overlying de vierde ventrikel met een 25G 5/8 tuberculine naald aan de 1 cc spuit en injecteer het DNA-kleurstof mengsel in het ventrikel. Succesvolle injecties worden gekenmerkt door de DNA-kleurstof mengsel vult de gehele ventrikelsysteem (figuur 1c). De hoeveelheid DNA-kleurstof mengsel gewoonlijk geïnjecteerd minder dan 50 microliter. Exacte bedragen variabel tussen embryo als een deel van het mengsel meestal weglekken ventrikel in het PBS rondom het embryo. Een alternatieve middel van het leveren van de DNA-kleurstof mengsel zou zijn door de toegang tot het ventriculaire systeem door aanprikken van de velum bovenop de middenhersenen. Opnieuw worden succesvolle injecties gekenmerkt door de DNA-kleurstof mengsel vult de gehele ventriculaire systeem.
  6. Lever vijf vierkante pulsen met behulp van een elektrische puls generator (BTX) en 7 mm elektrode peddels. Elke puls is 50 V duurzaam 5 ms per puls van 500 ms tussen elke puls. Het weefsel het dichtst bij de positief geladen elektrode zal dan TakE t het plasmide.

4. Cultuur van embryo's

  1. In een laminaire stroming kap vult de buitenste putjes van een 12 goed kweekschaal met 2 ml DMEM/F12 media aangevuld met 10% foetaal runderserum, 5% paarden serum, 1% glutamine, 1% penicilline / streptomycine dat werd voorverwarmd tot 37 ° C. De kweekomstandigheden zijn overgenomen van de Diego en collega's. 15
  2. In laminaire stroming kap snufje embryo's op buik (onder het hart) met een pincet en verwijder achterste deel van de embryo. Plaats het voorste gedeelte in een van de gevulde putten van de 12-well cultuur schotel.
  3. Herhaal dit voor alle embryo's. Vul alleen de buitenste putjes van de 12-well plaat om verontreiniging van culturen voorkomen.
  4. Culture embryo's in een 37 ° C incubator met 5% CO2. Expressie van het geëlektroporeerde plasmide moet worden waarneembaar binnen 24 uur.
  5. Indien meer cultuur tijden te wensen over, vul het uit putten van een nieuwe 12 wells-plaat met 2 mlde media gebruikt in 4.1. Met een gesteriliseerde lepel over te dragen de embryo's tot een goed in de nieuwe plaat. Plaats terug in de 37 ° C incubator. Cultuur voor maximaal 48 uur is mogelijk.
  6. Als de gewenste cultuur van de tijd is bereikt, vast embryo's voor analyse (zie hieronder).

5. Voorbereiding van embryo's voor analyse

  1. Spoel embryo 1 X PBS bij 4 ° C gedurende vijf minuten. Herhaal.
  2. Fix embryo voor de analyse van 2% paraformaldehyde (PFA) in 1XPBS gedurende 2 uur bij 4 ° C.
  3. Spoel embryo 1 X PBS bij 4 ° C gedurende vijf minuten. Herhaal.
  4. Evenwicht embryo in 30% sucrose in een X PBS gedurende de nacht bij 4 ° C.
  5. Embedden embryo's in optimale Cutting Temperatuur (LGO) verbinding met een droogijs / ethanol bad. Embryo's kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.
  6. Sectie embryo's op een cryostaat (Leica) in 30 micrometer secties en monteren op dia's (VWR, Superfrost Plus). Bewaren bij -20 ° C.

6. IMMUnohistochemistry Analyse

  1. Immunohistochemie werd uitgevoerd zoals beschreven in 16. Primaire antilichaam verdunningen gebruikt voor dit onderzoek zijn onder andere konijn α-GFP (Invitrogen) 1:2500; muis α-Mash1 (BD Biosciences) 1:100; konijn α-Ngn1 (Jane Johnson) 1:5000; konijn α-Ptf1a (Jane Johnson ) 1:2500; konijn-Math1 (Jane Johnson) 1:100. Incubeer glijbaan vlak, monster naar boven op een kleuring lade bij 4 ° C gedurende de nacht.
  2. Dia's werden geanalyseerd op een samengestelde microscoop (Olympus BX51).

7. Representatieve resultaten

Een schematisch in fig. 1A toont de elektroporatie experiment. Figuur 1B toont een aanzicht van een sagittaal E11.5 embryo voor manipulatie. Dezelfde embryo na injectie van het plasmide bevattende CAG :: GFP in 0,01% Fast Green is in figuur 1C en een representatief losgemaakte embryo vertoont GFP eenzijdigeuitdrukking in de dorsale achterhersenen 24 uur volgende cultuur in figuur 1D. De omvang van het gebied van de LRL dat succesvol geëlektroporeerd is variabel en lijkt sterk afhankelijk positionering van de elektroden. In onze onderzoeken werd gevonden dat 52 van 65 (80%) van de geëlektroporeerde embryo succes GFP uitgedrukt. Tissue geacht met succes geëlektroporeerd als het positief GFP in gelokaliseerde gebieden over verschillende secties na fixatie en immunohistochemische analyse (zie hierna). Embryo's die niet aan deze criteria voldoen werden gescoord als niet geslaagde pogingen tot elektroporatie.

Verdere beoordeling van elektroporatie efficiency kan worden vastgesteld door het uitvoeren immunohistochemie tegen GFP op dwarsdoorsneden van geëlektroporeerde embryo's op het niveau van de vierde kamer. Figuur 2 representatief seriële secties van een embryo weergegeven eenzijdigeGFP expressie. Figuur 2A toont een geïdealiseerd schema dat illustreert dat de linkerzijde van de embryo richting van de positieve elektrode. Dwarsprofielen (op een niveau gerepresenteerd door de middelste tekening van figuur 2A) blijkt gelokaliseerde GFP expressie uitsluitend aan de linkerkant van de achterhersenen weefsel (Figuren 2C en 2D). De geëlektroporeerde gebied van de LRL niet vergroten de gehele anterior-posterior as van de neurale buis onderzoek secties 300 pm rostraal of meer van die getoond in figuur 2C niet expliciet GFP (Figuur 2B).

Het nut van deze assay voor manipulatie van genexpressie afhankelijk is van de stabiliteit van de expressie gebieden voor de endogene eiwitten. De LRL wordt gekenmerkt als met hun eigen unieke voorlopercellen domeinen gekenmerkt door de differentiële expressie van proneural transcriptiefactoren (herzien in 1).Een subgroep van deze factoren (Mash1, Math1, Ngn1 en Ptf1a) werden gekozen voor analyse door hun voorgestelde en / of gekenmerkt rol in de specificatie van precerebellar neurale subtypes in de LRL, een onderwerp van toekomstige studies 16-18. Alle vier de eiwitten hebben een zeer karakteristieke uitdrukking domeinen in het caudale achterhersenen op E11.5 16-18. We zagen dat embryo's die werden geplaatst culturen niet in omvang toenemen en ook niet aan de productie van choroïdplexus epitheel en invaginatie van de LRL en dak zelf, morfologische gebeurtenissen die plaatsvinden tussen E11.5 en E12.5 5 te initiëren. Op basis van deze observaties werd vastgesteld dat de normale ontwikkeling van deze embryo's werd gestopt of grove vertraagd en de vergelijkbare controle voor de gekweekte embryo's onbeschaafde embryo's zijn op E11.5.

Om ervoor te zorgen dat cultuur en elektroporatie niet het niveau van endogene eiwitten verstoren, hebben we vier verschillende eiwitten geanalyseerd door immunohistochemistry (IHC) in 34 verschillende embryo's werden geëlektroporeerd en gekweekt gedurende minimaal 24 uur. Tabel I toont het aantal embryo geanalyseerd voor elke marker en het percentage van de embryo geanalyseerd om vastgehouden normale eiwitgehalte. Figuur 3 representatieve gegevens blijkt IHC van twee van de eiwitten geanalyseerd Mash1 (Figuren 3A en 3B) en Math1 (figuren 3C en 3D). We hebben vastgesteld dat het merendeel van de embryo normale niveaus van expressie na elektroporatie en cultuur (figuren 3b en 3d) gehandhaafd vergeleken met de controle embryo's in E11.5 (Figuren 3A en 3C). Belangrijker, het kenmerk expressie domeinen van deze eiwitten niet verstoord.

figure-protocol-1
Figuur 1. Elektroporatie van embryo's op E11.5. (A) Schematische weergave van ee elektroporatie experiment. Een E11.5 embryo wordt geïsoleerd en het expressieplasmide in 0,01% Fast Green wordt geïnjecteerd in de vierde kamer. De embryo wordt geflankeerd door elektrode schoepen en onderworpen aan een 50 volt puls voor plaatsing in cultuur (B) Sagittaal aanzicht van een E11.5 embryo voor injectie. (C) dezelfde E11.5 embryo na injectie van plasmide in 0,01% Fast Green. (D) Eenzijdige achterhersenen expressie van GFP waargenomen in E11.5 embryo na 24 uur van de cultuur. mb-middenhersenen, 4V-vierde ventrikel.

figure-protocol-2
Figuur 2. Expressie van GFP in geëlektroporeerd Tissue. (A) De strip links toont de plaatsing van elektroden rond een E11.5 embryo. Midden cartoon toont opname en weergave van plasmide dat codeert GFP links van het embryo. Beeldverhaal over rechts is schema van een geïdealiseerde dwarse doorsnede genomen door het embryo op levels aangegeven met zwarte lijnen in het midden cartoon. (B-D) Immunohistochemie voor GFP op dwarsdoorsneden door middel van een geëlektroporeerde E11.5 embryo na 24 uur van de cultuur. Pijlen geven het dak zelf (rp), die vallen het secundaire antilichaam. Beelden worden genomen op 10x vergroting. De relatieve niveau van de getoonde secties worden weergegeven door de horizontale lijnen door het midden cartoon (A). mb-middenhersenen; l 4V-vierde ventrikel; rp-dak zelf.

figure-protocol-3
Figuur 3. Expressie van endogene eiwitten in de onderste lip Rhombic Immunohistochemie van Mash1 (A en B) of Math1 (C en D) het vergelijken dwarsdoorsneden van E11.5 embryo's die niet waren gekweekt (A, C) met embryo's werden geëlektroporeerd met CAG.: : GFP en gekweekt gedurende 24 uur (B en D). Foto genomen op 10x vergroting.

Proneural TranscriptiAnalyse van de Factor Aantal embryo's Analyzed Percentage behouden Normaal expressiepatronen
Math1 15 86,7%
Mash1 12 83,3%
Ngn1 7 71,4%
Ptf1a 6 100%

Tabel I. Percentage geëlektroporeerd en gekweekt embryo's behouden Normaal Proneural Transcriptie Factor Domeinen in de LRL.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De in vitro elektroporatie techniek die in deze studie is een nieuwe methodiek die efficiënt kan worden om de genexpressie te manipuleren gebruikt in embryo's jonger dan 12 dagen van de dracht. Plaatsing van de embryo's in de cultuur maakt de expressie van het geïntroduceerde gen zijn en is de letaliteit waargenomen wanneer geëlektroporeerde embryo's mogen blijven in vivo. Deze techniek maakt het mogelijk om manipulatie van genexpressie in embryonale voorlopers die voorheen niet toegankelij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag Jane Johnson bedanken voor de Math1, Ngn1 en Ptf1a antilichamen en Connie Cepko voor de pCAG :: GFP plasmide. Dit werk werd gefinancierd door NIH R15 1R15HD059922-01.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het serum Vennootschap Catalogusnummer Opmerkingen (optioneel)
Cryostaat Leica CM-1850
Biologie tip Dumoxel behandeld DUMONT tang Fijn wetenschappelijke instrumenten 11252-30
20 mm Moria geperforeerde lepel Fijn wetenschappelijke instrumenten 10370-17
ECM 830 Square Wave Elektroporatie Generator BTX (VWR) 47745-928
Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes * Elektroden BTX (Fisher) BTX450165
Fisher Isotemp CO 2 Incubator Visser 1325525
NAPCO CO 2 Gas Regulator Visser 15497020
12 well kultuurplaten BD Falcon (Fisher) 877229
Hyclone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); Met L-Glutamine en HEPES; 500 ml Thermo Scientific (Fisher) SH3002301
Hyclone * Donor Equine Serum Thermo Scientific (Fisher) SH3007402
Foetaal runderserum, gekwalificeerd, Heat geïnactiveerd Invitrogen 16140-063
cellgro * 10.000 IE Penicilline, 10.000 pg / ml streptomycine Mediatech (Fisher) MT-30-002-CI
Hyclone * L-Glutamine L-Glutamine, 200mm in 0,85% NaCl Thermo Scientific (Fisher) SH3003401
Fast-Green Visser AC41053-0250 0,01%

Referenties

  1. Ray, R. S., Dymecki, S. M. Rautenlippe Redux -- toward a unified view of the precerebellar rhombic lip. Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).
  2. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  3. Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
  4. Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).
  5. Altman, J., Bayer, S. A. Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function. , CRC Press, Inc. Boca Raton. (1997).
  6. Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps. Neuron. 50, 205-218 (2006).
  7. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
  8. Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. Origin of the precerebellar system. Neuron. 27, 475-486 (2000).
  9. Taber-Pierce, E. Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse. J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).
  10. Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem. Neuroscience. 162, 560-573 (2009).
  11. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
  12. Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain. Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).
  13. Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).
  14. Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene. Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).
  15. de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla. Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).
  16. Landsberg, R. L. Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6. Neuron. 48, 933-947 (2005).
  17. Hoshino, M. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
  18. Yamada, M. Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on. Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Manipulatie van genexpressieinjectie van plasmide DNAembryo cultuurimmunohistochemische analyseprogenitorcellen van de ruiterspeekselherseneninjectie in het ventriculaire systeemweefselkweekprocedure

Gerelateerde artikelen