Basis- Caenorhabditis elegans Methoden: Synchronisatie-en-

Summary

Het gemak van het behoud en het uitdragen van de nematode C. elegans Maken het een leuk model organisme om mee te werken. De mogelijkheid synchronisatie wormen kan het werken met een aanzienlijke hoeveelheid onderwerpen aan dezelfde ontwikkelingsfase, wat maakt de studie van een bepaald proces veel dieren.

Abstract

Onderzoek naar de Ontwikkelings-en Moleculaire biologie van de nematode Caenorhabditis elegans is begonnen in de vroege jaren zeventig door Sydney Brenner en het is sindsdien veelvuldig gebruikt als modelorganisme ^1. C. elegans bezit essentiële eigenschappen als eenvoud, transparantie en korte levenscyclus hebben gemaakt dat het een geschikte experimentele systeem voor fundamenteel biologisch onderzoek voor vele jaren ^2. Ontdekkingen in deze nematode heeft grote gevolgen, omdat vele cellulaire en moleculaire processen die de dieren ontwikkeling zijn evolutionair geconserveerd ^3.

C. elegans levenscyclus gaat door middel van een embryonale fase en vier larvale stadia voordat de dieren volwassen zijn. Ontwikkeling kan 2 tot 4 dagen te afhankelijk van de temperatuur. In elk van de fasen een aantal kenmerkende eigenschappen waar te nemen. De kennis van de complete cellijn ^4,5 samen met de diepe annotation van zijn genoom maken van dit aaltje in een groot model in uiteenlopende gebieden als de neurobiologie ^6, de vergrijzing ^7,8, stamcelbiologie ⁹ en kiembaan biologie ^10.

Een extra functie dat C. maakt elegans aantrekkelijk model te werken met de mogelijkheid om populaties wormen gesynchroniseerd in een bepaald stadium met een relatief eenvoudige protocol. Het gemak van onderhoud en propageren van deze nematode toegevoegd om de mogelijkheid van synchronisatie een krachtig middel grote hoeveelheden wormen, die kunnen worden gebruikt voor een groot aantal kleine of high-throughput experimenten zoals RNAi schermen, microarrays, massieve sequencing verkrijgen, immunoblot of in situ hybridisatie, onder anderen.

Door de transparantie C. elegans structuren kunnen worden onderscheiden onder de microscoop met differentieel interferentie contrast microscopie, ook bekend als micro Nomarskikopiëren. Het gebruik van een fluorescerende DNA bindmiddel DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool) bijvoorbeeld kan leiden tot de specifieke identificatie en lokalisatie van individuele cellen alsmede subcellulaire structuren / defecten worden herkend.

Protocol

1. Protocol A: Het kweken van Worms voor het bleken van ¹¹

Grote populaties van C. elegans kan worden verkregen door het kweken die hetzij in vloeibare media of vast medium in platen. Ze zijn meestal gegroeid op vaste NGM (Nematode Groei Media) en gevoed met E. coli bacteriën, die aan de platen een levend of dood (gedood door UV ^12, door hitte ¹³ of koude door ^14). De meest gebruikelijke procedure maakt gebruik van live-OP50 E. coli die defect in de synthese van uracil en niet overwoekeren een dikke laag zou belemmeren de wormen.

1. Meng 3 g NaCl, 17 g agar en 2,5 g pepton en voeg 975 ml _H2O Autoclaaf 50 minuten.
2. Koel de kolf af tot 55 ° C.
3. Voeg 1 ml 1 M _CaCl2, 1 ml 5 mg / ml cholesterol in ethanol, 1 ml 1 M _MgSÜ4 en 25 ml 1 M KPO ₄ buffer (allemaal maar cholesterol eerder autoclaved).
4. Met behulp van steriele procedures afzien van de NGM oplossing in petrischalen, vul platen tot 2/3 van hun volume.
5. Na droging is het raadzaam om platen te verlaten kamertemperatuur 2-3 dagen vóór gebruik voor de detectie van verontreinigingen. Maak een streak van OP50 E. coli uit een glycerol voorraad (OP50 kan worden verkregen bij de Caenorhabditis Genetics Center).
6. Kies een kolonie en groeien in LB overnacht bij 37 ° C onder roeren.
7. Overtollig van vocht uit de platen verdampen door het verwijderen van het deksel in de laminaire stroming en voeg OP50 het centrum van de plaat met een steriele Pasteur pipet.
8. Laat de OP50 E. coli gazon een nacht groeien bij kamertemperatuur of bij 37 ° C gedurende 8 uur.
9. Voeg de gewenste hoeveelheid wormen de platen (indien geïncubeerd bij 37 ° C platen worden gekoeld bij kamertemperatuur voor gebruik).

TIPS:

• De uitstorting van dezelfde hoeveelheid mediain de platen met een pipet of een dispenser pomp zorgt hetzelfde volume agar de platen en vergemakkelijkt het verplaatsen van de plaat zonder de noodzaak om de stereomicroscoop heroriënteren.
• Platen (zowel zaden en unseeded met bacteriën) kan verschillende weken na bereid bij opgeslagen in een bij kamertemperatuur en 4 ° C.
• Voorkom plateren de bacteriën aan de rand van de plaat. Als het gazon uitstrekt tot de randen van de plaat de wormen kan kruipen de zijkanten, uitdrogen en sterven.
• Wormen leven langer als de bacterie gezaaid op de platen zijn al dood ^15.

2. Protocol B: Behandeling met Alkaline hypochloriet oplossing ("Bleken") ¹¹

Het bleken techniek wordt gebruikt voor synchronisatie C. elegans culturen op het eerste larvale stadium (L1). Het principe van de werkwijze ligt in het feit dat wormen gevoelig zijn bleken terwijl de eischaal beschermt embryos van. Na behandeling met alkalisch hypochloriet-oplossing, worden embryo's geïncubeerd in vloeibare media zonder voedsel, die zich toelegt laat maar voorkomt verdere ontwikkeling.

1. Laat wormen te groeien tot volwassen stadium.
2. Recover zwangere volwassenen in 15 ml buizen door het wassen van platen met M9 buffer.
3. Pellet wormen door centrifugeren gedurende 2 minuten 400xg (~ 1500 rpm op een standaard tafelcentrifuge) bij kamertemperatuur en verwijderen supernatant.
4. Voer 1-3 wasbeurten totdat de buffer lijkt vrij van bacteriën.
5. Het gewenste bleekoplossing (Tabel I) en schud enkele minuten (vernietiging van de volwassen weefsels worden gecontroleerd onder stereomicroscoop en de reactie gestopt wanneer sporen van volwassenen nog zichtbaar, die gewoonlijk 3 tot 9 minuten, afhankelijk takes kwesties, zoals het volume van de worm pellet, genoemd in de discussie) (afb. 3).
6. Stop reactie door het toevoegen van M9 Buffer de buis vullen.
7. Snel (sinds de behandeling nog steeds actief zijn) centrifugeer 1 minuut bij 400 xg en gooi supernatant.
8. Was de pellet nog drie keer door het vullen van de buis met M9 buffer.
9. Voeg 1 ml M9 buffer op de korrel, of plaats de eieren ongeplaatste NGM platen, en incubeer op de gewenste temperatuur onder zacht schudden. Goede beluchting dient te worden voorzien (Fig. 4).

TIPS:

• Er zijn verschillende bleken oplossingen te kiezen die beter werkt in je handen (zie tabel 1, Fig. 1).
• Eieren al gelegd op de platen kan worden teruggewonnen door schrappen het oppervlak van de agar met een zacht materiaal, zoals een stuk van een X-straal film.
• Te veel resten van volwassen dieren kan schadelijk zijn voor synchronisatie aangezien zij een voedselvoorziening voor de onlangs uitgekomen larven.
• Hogere temperaturen iets versnellen van de ontwikkeling die is lastig if een worm slaat synchronisatie omdat het verschil in ontwikkeling tussen gesynchroniseerd en niet-gesynchroniseerde wormen groter zal zijn bij hogere temperaturen.
• Bleken oplossing moet vlak voor worden uitgevoerd om het gebruik ervan. Daarnaast bleek verliest kracht nadat het is al een tijdje open, mede vanwege de lichtgevoeligheid. Wij stellen voor om aliquot elke nieuwe fles in kleine amberkleurige flesjes die schade te voorkomen en blootstelling aan licht te minimaliseren.

3. Protocol C: Worm Plating

1. Wacht tussen 12 en 24 uur (tijd embryonale ontwikkeling vullen afhankelijk van de temperatuur) na het bleken uitgevoerd en terug wormen door centrifugeren (2 minuten bij 400 x g).
2. Gooi supernatant, zaad wormen op de gewenste plaatjes en laat resterende vloeistof droog.
3. Plaats platen bij de vereiste temperatuur.

TIPS:

• L1 larven in M9 buffer kan worden gehouden bij 15 ° C schommelen ten minste een week without voor de hand liggende wijzigingen.
• Wees voorzichtig bij het berekenen van de wormen zul je zaad omdat er te veel kan het voedsel uitputten sneller dan verwacht en ruïneren uw experiment. Ongeveer 500 L1 kan bereiken volwassenheid in een 55 mm plaat zonder een tekort aan voedsel.

4. Protocol D: C. elegans Observatie

D.1 Nomarski observatie

Differentieel interferentie contrast microscopie is een optische microscopie verlichting techniek die gebruikt wordt om het contrast in de ongekleurde transparante monsters te verbeteren. Het woord Nomarski verwijst naar het gebruikte prisma, genoemd naar zijn uitvinder. Door het observeren van dieren in leven zijn wij in staat de fysiologie van het dier te onderzoeken met het enige veranderingen afgeleid van immobilisatie. Bovendien, aangezien geen fixatief wordt toegevoegd, fluorescerende merkers worden in vivo. Dit feit en de mogelijkheid smelten fluorescerende merkers voor een gen van interesse maken het mogelijk om processen w volgenhich het eiwit van onderzoek kan worden betrokken. Door het gebruik van de techniek beschreven in dit protocol, kan niet alleen levende wormen in acht worden genomen, maar ze kunnen ook worden hersteld en bekleed opnieuw.

Agar pad voorbereiding (vlak voor gebruik):

1. Bereid agarose 2% in water en smelten. Houd gesmolten bij 65 ° C.
2. Plaats twee dia's met een stukje plakband deze aan weerszijden van een derde schoon dia.
3. Met behulp van een Pasteur pipet plaats een druppel agar op de schone ondergrond.
4. Bedek de agar met een schoon dia bovenop de drie loodrecht dia.
5. Druk voorzichtig zodat de agar druppel plat op de dikte van de band spacers.
6. Zodra de agar stolt, trek de tape dia's en scheiden de twee overgebleven dia's door te schuiven een familielid naar de andere.

Montage van levende dieren

7. Plaats een druppel (10 ul) van levamisol 1 mm of natriumazide 10-30 mm op thij midden van het pad.
8. Breng dieren in de daling van het gebruik van een worm keuze.
9. Plaats voorzichtig een dekglaasje over de dieren en bevestig deze aan beide zijden met wat nagellak of silicone.

TIPS:

• Houd aliquots van 2% agarose bij 4 ° C.
• Gesmolten agarose kan worden gehouden op 65 ° C gedurende ten minste een dag.
• Let op: Levamisol is een nicotine receptor agonist die ontlokt spastische spierverlamming ^16.
• Wees voorzichtig, natriumazide is extreem giftig!

D.2 Ethanol fixatie en DAPI vlekken

Het protocol hier beschreven is een snelle manier van verven wormen met DAPI, maar vanwege de dissecation van de worm een ​​aantal structuren kunnen vormen enkele wijziging. Er zijn verschillende andere methodes om wormen voorafgaand aan DAPI vlekken, zoals fixatie met de oplossing Carnoy's of formaldehyde die beter behoud van de integriteit van de worm ¹⁷ vast.

Ethanol fixatie (gewijzigd van ¹⁸⁾

1. Plaats ~ 10 pi M9 buffer (of water) op een microscoopglaasje.
2. Met behulp van een worm pick zorgvuldig over te dragen 10-25 wormen aan de daling.
3. Met behulp van filtreerpapier of een micro-pipet te verwijderen zoveel M9 buffer mogelijk zonder het verwijderen van de wormen of hen te laten drogen.
4. Voeg ~ 10 ul van 90% ethanol en laat het drogen.
5. Herhaal stap 4 een of twee keer.

4 ',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) kleuring

6. Meng DAPI met de gewenste afdekmiddel tot een eindconcentratie van 2 ng / pl.
7. Zodra de ethanol volledig verdampt, voeg 7 pi van de DAPI: montage media mengsel.
8. Plaats een dekglaasje aan en bevestig deze aan beide zijden met wat nagellak of silicone. Dia klaar voor waarneming ongeveer 5 minuten na toevoeging van DAPI.

TIPS:

• De montage media bevat glycerol, dus een kleine hoeveelheid is genoeg om de hele voorbereiding te dekken.
• Er bestaat een breed scala aan commerciële montage media (Fluoromount of verlengen, bijvoorbeeld), hun kwaliteit en prijs hangt af van hoe lang u wilt uw monster op te slaan.
• Wees voorzichtig, DAPI is een bekende mutageen die sterk bindt aan AT-rijke regio's in DNA.

Recepten

Nematoden groeimedium (NGM)

1,7% (w / v) Agar
50 mM NaCl
0,25% (w / v) pepton
1 mM _CaCl2
5 pg / ml Cholesterol
25 mM KPO ₄
1 mM _MgSÜ4

M9 buffer

22mm KH ₂ PO ₄
42 mM Na ₂ HPO ₄
86 mM NaCl
1 mM _MgSÜ4

Bleken oplossingen getest

	recept # 1	recept # 2	recept # 3	Recept nr. ​​4	Recept nr. ​​5
water (ml)	2,75	3,5	0,5	0,5	1,5
natriumhydroxide (ml)	1,25 (1M)	0,5 (5M)	2.5 (1M)	2.5 (2M)	2.5 (1M)
natriumhypochloriet op ~ 4% (ml)	1	1	1	2	1
totaal (ml)	5	5	4	5	5

Tabel I. Verschillende bleken oplossing recepten getest op dit artikel. Recepten # 3 en # 4 zijn 2x en worden toegevoegd aan een gelijk volume M9. Recepten voor # 1 # 2 # 5 en al eerder gemeld ^{2, 11, 19.} Final concentraties: # 1 NaOH 0,25 M, NaOCl op ~ 0,8% , # 2 NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%, # 3 NaOH 0.625M, NaOCl ~ 1%, # 4 NaOH 1 M, NaOCl ~ 1,6%, # 5 NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%.

5. Representatieve resultaten

Figuur 1. Vergelijking van vijf verschillende oplossingen bleken twee verschillende incubatietijden. N2 wormen tweemaal gewassen met M9 werden verdeeld in vijf 15 ml conische buizen die elk bleken oplossing. Buizen werden krachtig geschud en 1 ml overgebracht naar een nieuwe buis met M9 de reactie na het aangegeven tijdstip stoppen. Na het bleken procedure wormen werden geïncubeerd met 1 ml M9 bij 20 ° C gedurende 24 uur. In elk geval werd onderste foto genomen net na het bleken, bovenste foto 24 uur later.

_upload/4019/4019fig2.jpg "alt =" Figuur 2 "/>
Figuur 2. Temperatuur bleekoplossing invloed op de doelmatigheid van de behandeling. Gelijke volumes van N2 wormen gebleekt met dezelfde bleekoplossing een vooraf gekoeld op ijs gedurende 20 minuten of bewaard bij 25 ° C op dezelfde tijd. De twee kolommen aan de linkerkant geven aan foto's net na het bleken. Na behandeling wormen geïncubeerd in 15 ml conische buizen met 1 ml M9 bij 20 ° C gedurende 24 uur. Kolommen aan de rechterkant schermafbeeldingen 24 uur later.

Figuur 3. De verhouding worm pellet: tijdstip alkalisch hypochloriet incubatie invloed op de doelmatigheid van de behandeling 50, 100, 250 en 500 ul worm pellet werden geïncubeerd met 2 ml bleekoplossing # 3 3, 6 en 9 minuten.. Uitgebroed L1, dode embryo's en resten van volwassen fragmenten werden gekwantificeerd na incubatie bij 20 ° C gedurende 2 4 uur in 15 ml conische buizen met 1 ml M9 buffer. Ongeveer drie confluerende 55 mm platen met volwassen wormen zijn nodig om een ​​100 pi worm pellet te krijgen.

Figuur 4. Een goede beluchting is vereist voor broedeieren en overleving van C. elegans embryo. een pellet van 100 pi N2 wormen gebleekt 6 minuten en geïncubeerd in 15 ml conische buizen met 1, 5 of 10 ml zoals aangegeven, van M9 bij 20 ° C gedurende 24 uur. Het bovenste deel van de figuur toont foto's van de culturen na 24 uur, waarbij pijlen eieren niet uitkomen. Onderaan is een grafiek die de hoeveelheid larven (grijs) en dode embryo (grijs) 48 uur na het bleken op de aangegeven voorwaarden.

tp_upload/4019/4019fig5.jpg "alt =" Figuur 5 "/>
Figuur 5. Levenscyclus van C. elegans. een. Geschatte lengte van de wormen in verschillende stadia. Uur nodig is om elke fase te bereiken, afhankelijk van de temperatuur (gewijzigd vanaf ^20). B. Nomarski (omhoog) en DAPI (naar beneden) foto's van verschillende wormen op de aangegeven ontwikkelingsstadia. De meeste belangrijke functies in elke fase worden vergroot L1: pijl geeft de voorlopers van de somatische gonaden en de kiembaan vroege L4: zwarte pijl (Nomarski) geeft de ontwikkeling van vulva, witte pijlen (DAPI) geven de twee gonadale armen Mid-... laat L4: pijl geeft de ontwikkeling van vulva op de zogenaamde kerstboom stadium Young Adult:. zwarte pijl geeft aan een embryo in de baarmoeder, pijlpunt wijst naar de spermatheca, witte pijl geeft een eicel zwangere volwassene:. pijlpunt (DAPI) wijst erop bevruchte embryo's. Arrow in DAPI beeld geeft aan spermatheca.

Figuur 6. Vulva morfologie bij L3, L4 en volwassen stadia. Op L3 stadium alleen een lumen waarin de vulva gevormd worden waargenomen. Op L4 dit lumen expandeert die de zogenaamde "kerstboom". In de volwassen de vulva is al gesloten. Gele lijnen geven de plaats van de vulva op deze drie fasen.

Figuur 7. DAPI vlekken op L3, L4 vroege, late L4 en volwassen stadia. Op L3, wordt kiemlijn verlengd. Op L4, gonaden armen huidige U-vorm morfologie. Op late-L4 stadium sperma kan worden waargenomen in het distale deel van de gonaden. Jonge Volwassenen presenteren eicellen. De Adult kiembaan presenteert eicellen en embryo's. Gele lijnen begrenzen kiem lijnen op ee verschillende stadia aangegeven.

Figuur 8. C. elegans ontwikkeling bij 15 en 25 ° C. N2 wormen gebleekt, overnacht geïncubeerd in M9 en roeren bij 15 ° C, overgebracht naar platen en gekweekt de aangegeven tijdstippen de aangegeven temperaturen.

Discussion

Nematode Synchronisatie

Verschillende oplossingen bleken zijn beschreven. We hebben geprobeerd vijf verschillende recepten (Tabel I) en, in onze handen, ze toonde geen significante verschillen in de synchronisatie van worm populaties (afb. 1). Maar onze experimenten toonden aan dat zoals temperatuur (Fig. 2), de verhouding bleekoplossing: volume van wormen (fig. 3) en het volume van M9 met de embryo's geïncubeerd broedeiere...