Genereren van een geïmmortaliseerde Murine Brain microvasculaire endotheliale cellijn als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Brain Barrier Model

Samenvatting

Deze methode wordt beschreven hoe isoleren en onsterfelijk microvasculaire endotheelcellen van muizenhersenen. We beschrijven een stap-voor-stap protocol vanaf het homogeniseren van het hersenweefsel, digestie stappen zaaien en immortalisatie van de cellen. Meestal duurt het ongeveer vijf weken voor het verkrijgen van een homogene, vereeuwigd microvasculaire endotheliale cellijn.

Samenvatting

Epitheel-en endotheelcellen (EC) bouwen paracellulaire barrières die het weefsel te beschermen tegen de externe en interne omgeving. De bloed-hersenbarrière (BBB) ​​bestaande uit EG, astrocyten end-voeten pericyten en basaal membraan is verantwoordelijk voor de bescherming en homeostase van het hersenparenchym. In vitro BBB modellen zijn standaard tools de structuur en functie van de BBB bestuderen op cellulair niveau. Een aanzienlijk aantal verschillende in vitro BBB-modellen zijn vastgesteld voor het onderzoek in verschillende laboratoria tot nu toe. Gewoonlijk worden de cellen van runderen, varkens, rat of muis hersenweefsel (besproken in het overzicht door Wilhelm et al.. ^1). Monsters van menselijk weefsel zijn alleen beschikbaar in een beperkt aantal laboratoria of bedrijven ^2,3. Terwijl de primaire celpreparaten zijn tijdrovend en het EG-culturen kunnen verschillen van partij tot partij, de oprichting van vereeuwigd EG lines is de focus van het wetenschappelijk belang.

Hier presenteren we een methode voor het vaststellen van een onsterfelijk hersenen microvasculaire EC lijn van neonatale hersenen van muizen. We beschrijven de procedure stap voor stap bedrijf de reagentia en oplossingen gebruikt. De methode, die door ons laboratorium kan de isolatie van een homogene geïmmortaliseerde endotheelcellijn binnen vier tot vijf weken. De hersenen microvasculaire endotheliale cellijnen genoemd CEND ⁴ (van cerebrale cortex) en cerebEND ⁵ (van cerebellaire cortex) werden geïsoleerd volgens deze procedure in de Förster laboratoria en zijn effectief gebruikt voor een uitleg van verschillende fysiologische en pathologische processen bij de BBB. Met CEND en cerebEND we hebben aangetoond dat deze cellen reageren op glucocorticoïden ^4,6-9 oestrogeen-behandeling ¹⁰ alsook pro-infammatory mediatoren, zoals TNFa ^5,8. Bovendien hebben we de pathologie van meerdere sclerosis ¹¹ en hypoxie ^12,13 op de EG-niveau. De CEND en cerebEND lijnen kan worden beschouwd als een goed hulpmiddel voor het bestuderen van de structuur en functie van de BBB, cellulaire reacties van EC op verschillende stimuli of interactie van de EC met lymfocyten of kankercellen.

Protocol

1. Isolatie van Brain microvaten

1. Voor elk preparaat met vijf tot tien neonatale muizen van elk geslacht (3-5 dagen oud).
2. Euthanaseren een muis volgens lokale IACUC / dierenarts aanbevelingen onmiddellijk de hersenen en overdracht in een petrischaal met de volgende oplossing: 15 mM Hepes (pH 7,4), 153 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,3 mM _CaCl2 x 2H ₂ O, 2,6 mM _MgCl2 x 6H ₂ O, 1% (w / v) BSA (hierna buffer A).
3. Tenzij anders aangegeven, moeten alle isolatie procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT) (22-24 ° C) onder de laminaire stroming kap. Snijd de hersenen (cerebellum en cerebrum zonder hersenstam), nadat de meninges en capillaire fragmenten in buffer A met een steriele scalpel. Pipetteer de weefselfragmenten en neer met een 10 ml pipet tot er geen klontjes weergegeven. Spoel de suspensie in een 50 ml Falcon buis en centrifugeer bij 250 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.

Opmerking: hersenvliezen geïdentificeerd kan worden als dunne, transparante membranen aan het oppervlak van het hersenweefsel. Ze kunnen voorzichtig worden verwijderd met een steriele pincet.

4. Verwijder het supernatant.
5. Los het pellet in 4,5 ml buffer A met 1,5 ml van 0,75% (w / v) collagenase / dispase (Roche) en incubeer 45 min bij 37 ° C in een waterbad (soms schudden).
6. Ondertussen bereiden platen met 12 putjes door het coaten vier putjes met collageen IV (0,1 mg / opgelost ml in 50 mM azijnzuur). Laat gedurende 1 uur hechten.
7. Stop de vertering door toevoeging van 15 ml ijskoude buffer A. resuspendeer de pellet goed.
8. Centrifugeer de suspensie bij 250 xg gedurende 10 min bij RT.
9. Verwijder het supernatant.
10. Om myeline verwijderen, toevoegen 10 ml 25% (w / v) BSA (Sigma, zuiverheid> 98%) en gecentrifugeerd bij 1000 g gedurende 20 min bij 4 ° C. 25% BSA worden opgelost in 1x PBS (PAA Laboratories) en gefiltreerd door 0,2 urn fIlter).
11. Verwijder voorzichtig het supernatans, los de pellet op in 10 ml buffer A en over te dragen aan een nieuwe Falcon buis.
12. Centrifugeer de suspensie bij 250 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De resulterende pellet bevat de endotheelcellen.
13. Was tweemaal collageen IV gecoate 12-well plaat met PBS.
14. Resuspendeer de pellet in 4 ml groeimedium (DMEM met 10% FCS, 50U/ml penicilline / streptomycine, 1% L-glutamine) en plaat de celsuspensie in twee putjes, 2 ml in elk putje. Voeg puromycine tot een uiteindelijke concentratie van 4 ug / ml en incubeer 45 min bij 37 ° C in een celkweek incubator. Deze stap kan worden verwijderd van snel hechtende cellen,:. Puromycine toegevoegd gedurende 24 uur. Alleen hersenen ECs kan metaboliseren, andere celtypen puromycine is giftig ^14.
15. Breng de 2 ml medium dat niet-gehandeld cellen van stap 1,14 in twee verse putten (deze putjes bevatten het EG-fractie). Vul de putjes met gehandeld cellen van step 1,14 met 2 ml vers medium (Deze putjes bevatten andere celtypen, zoals fibroblasten, astrocyten en kan gekweekt in parallel worden en gebruikt voor vergelijkingen van de morfologie).
16. Verander het medium de volgende dag.

2. Onsterfelijk maken van de hersenen microvasculaire endotheelcellen

1. Cultiveren de GP + E-86 Neo (GPENeo) ¹⁵ fibroblasten, het afscheiden van een replicatie-deficiënt virus met polyoma midden T oncogene in DMEM medium dat 10% hitte-geïnactiveerd FCS, 50U/ml penicilline / streptomycine en 2 mg / ml G418 ( . PAA Laboratories) in gelatine gecoate flessen Opmerking: Polyoma middle T oncogene transfectie veroorzaakt groeivoordeel van EC EC dan niet leidt tot een homogene monolaag van cellen met endotheliale morfologie 4 tot 6 weken van cultuur. GPENeo zijn niet in de handel verkrijgbaar en kunnen worden verkregen als gedeelde publieke materiaal (zie oorspronkelijke publicaties ^4,16).
2. Het virus bevattende medium gebruiken immortalisatie, cultiveren GPENeo cellen G418-vrij medium gedurende 24 uur.
3. Verwijder 10 ml van de supernatant en voeg GPEneo Polybreen (hexadimethrine bromide) (Sigma) tot een eindconcentratie van 8 ug / ml, steriliseer door 0,45 urn filter om de cellulaire brokstukken te verwijderen.
4. Verwijder het groeimedium van het EG-culturen bereid in deel 1 en voeg 2 ml GPEneo supernatant / Polybreen mengsel in de putten. Herhaal de volgende dag met een verse GPEneo supernatant / Polybreen mengsel Note:. Polybreen wordt gebruikt om poriën te maken in de wand van de infectie vergemakkelijken de virale deeltjes).
5. Verwijder het supernatant GPEneo / Polybreen mengsel de volgende dag, tweemaal wassen van de cellen met PBS en de cellen behouden in het groeimedium veranderen om de 3 dagen. Bij samenloop, splitsen de cellen 1:02 op collageen IV-beklede platen.
6. Gewoonlijk moet stabiel cerebrale endotheel (CEND) cellijnen 4-5 weken later worden verkregen.

e "> 3. cultiveren van de hersenen microvasculaire endotheelcellen

1. Ontdooi de cellen van cryoaliquot in waterbad in 15 ml-Falcon met 10 ml voorverwarmd medium.
2. Centrifugeer de suspensie bij 250 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
3. Verwijderen medium, overdragen pellet in het collageen IV beklede T _{25 cm} ² celkweek kolf met voorverwarmd groeimedium (celdichtheid plating moet minimaal 1x 10 ⁴ cellen / ml).
4. Veranderen medium en de volgende dag nadat de cellen samenvloeiing bereikt (gewoonlijk na 5 dagen) splitsen de cellen.

4. Splitsing van CEND-cellen (Opmerking: Splitsing moet worden gedaan slechts eenmaal per week, Vermijd splitsen Hoger dan 1:4).

1. Verwijder medium, was de cellen met PBS.
2. 3 ml warm trypsine-EDTA-oplossing (PAA Laboratories) (T _{⁷⁵ cm2} kolf), incuberen bij 37 ° C en wacht tot cellen laag is gedispergeerd (gewoonlijk binnen 5 tot 15 min).
3. Voeg 5 ml of groeimedium en pipetteer op en neer, en transfer naar een nieuwe collageen IV-gecoate kolf.

5. Bevriezing van CEND-cellen

1. Verkrijgen celsuspensie zoals beschreven in stap 4
2. Centrifugeer de suspensie bij 250 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
3. Resuspendeer de celpellet (verkregen van 1 T _{⁷⁵ cm2} kolf) in 6 ml ijskoud medium (95% kweekmedium, 5% DMSO).
4. Verdeel de celsuspensie in vier 1,5 ml cryo-porties. Opmerking: Een cryo-aliquot kan worden gezaaid op T _{25 cm} ² kolf.
5. Sla de cryo-monsters onder vloeibare stikstof damptemperatuur.

CEND groeimedium: 450 ml DMEM, 10% FCS, 10 ml L-glutamine, 2% MEM-Kit, 2% NEAA, 10 ml natrium pyruvaat, 50 U / ml penicilline / streptomycine

6. Representatieve resultaten

De CEND en cerebEND cellen werden gekenmerkt door immunostainings van endotheliale eennd BBB markers en door meting van transendotheliale elektrische weerstand (TEER) en permeabiliteit. De CEND en cerebEND had een morfologie lijken op primaire culturen van hersenen EC, met monolagen van dicht opeengepakte langwerpige cellen die groeiremming tentoongesteld op samenloop. De cellen brachten goed detecteerbare niveaus van claudine-5 occludin en VE-cadherine eiwitten die zijn gelokaliseerd in de cel-cel verbindingen, zoals met immunofluorescentie (Figuur 3) ^4,5. CEND kweken cellen in serum-gereduceerde medium tot een toename in TEER (van 150 Qcm ² in aanwezigheid van 10% serum tot 500 Qcm ² in aanwezigheid van 2% serum) werd versterkt door de toevoeging van hydrocortison (800 Qcm ²⁾ of insuline (1000 Qcm ^{2) 4.} Monolagen van CEND gekweekt in serum-gereduceerde medium gedurende 21 dagen had TEER van 900 Qcm ² (Figuur 4). TEER werd gemeten met een samenstelmet de huidige-passing en de spanning te meten elektroden (World precisie-instrumenten). Ter vergelijking, is de primaire microvasculaire hersenen EC gemeld dat TEER waarden van 200-600 hebben Qcm ² en een in de handel verkrijgbare muis cellijn bEnd.3 TEER waarden van 100-140 Qcm ² (had voor recent overzicht zie Abt 2005 en Toth et al., 2011 ^17,18). Bovendien werd de passage van macromoleculen, zoals niet-geladen FITC-dextranen van molecuulmassa's 4, 10, 70 en 500 kDa, of fluoresceïne (300 Da) over de monolaag CEND in 2% FCS differentiatiemedium over 4 uur gedaald vergeleken met controle cellen aangehouden in kweekmedium dat 10% FCS: paracellulaire flux werd verlaagd tot 30% van de controle cellen voor fluoresceïne, tot 26% bij FITC-dextranen 10 en 70 kDa en flux werd verlaagd tot 4,5% van de controle cellen voor FITC dextrtan-500 kDa. Soortgelijke waarden Teer, de permeabiliteit was op het laagste niveau in de cellen gekweekt in aanwezigheid van glucocorticoids (GC) ^4. In verdere studies identificeerden we de glucocorticoid doelwitgenen, occludin, claudin-5 en VE-cadherine van de hersenen vasculaire endotheel ^4,7,9. GC behandeling leidt tot een toename van de expressie van deze eiwitten en de herschikking van VE-cadherine het cytoskelet. De directe GC gemedieerde regulering van tight junction eiwitten occludin en claudin-5 verschijnt door GC responselementen in de promotergebieden ^4,7,19. Bovendien claudin-5 werd geïdentificeerd als een nieuw doel oestrogeen in vasculair endotheel ^10.

Endotheeldisfunctie grondslag verschillende ziekten. We gekweekt de CEND onder zuurstof / glucose deprivatie (OGD) omstandigheden. OGD heeft geleid tot de verstoring van de BBB-functie, die kan worden opgelost na combinatie behandeling met GC en proteasoomremmer bortezomib ^12. OGD omstandigheden leidden tot een sterke toename van glucoseopname en de expressie van glucose transportters in cerebEND, die kunnen worden verzwakt door de toevoeging van mk801, een niet-competitieve remmer van de NMDA-receptor ^13.

Figuur 1. Morfologie van de hersenen microvasculaire endotheelcellen (CEND) een week na isolatie. Lichtmicroscopie beelden werden genomen onder 6x (A) en 15x (B) vergroting. Het eiland gevormde kolonies van endotheelcellen zichtbaar.

Figuur 2. Morfologie van de hersenen microvasculaire endotheelcellen (CEND) een maand na isolatie en immortalisatie. Lichtmicroscopie beelden werden genomen onder 15x vergroting. Een confluent, homogene monolaag van endotheelcellen kan worden waargenomen.

Figuur 3. Vereeuwigd hersenen microvascular endotheelcellen express claudine-5 occludin en VE-cadherine. CEND cellen werden gekweekt op collageen IV gecoate dekglaasjes en gekleurd met antilichamen tegen claudin-5 (A), occludin (B) en VE-cadherine (C). De beelden werden gemaakt met behulp van een Zeiss microscoop Axioscop2 onder de 40x vergroting.

Figuur 4. Meting van transendotheliale elektrische weerstand (TEER) van CEND monolaag. CEND werden gekweekt op collageen IV gecoate transwell filters (poriegrootte 0,4 pm). Na het bereiken van confluentie werden de cellen gehouden in medium dat 2% FCS. TEER werd gemeten na 7, 14 en 21 dagen met behulp van een samenstel bevattende stroom-passing en spanningsmeetinrichting elektroden.

Discussie

De beschreven procedure kan worden gebruikt voor isolatie van microvasculaire EC van verschillende muizenstammen en van verschillende knock-out muizenstammen het bestuderen van de specifieke veranderingen in vasculaire endotheelfunctie. Als methode immortalisatie we de transformatie oncoproteïne van muizen polyomavirus, Polyoma middle T antigen. Het verandert snel onrijpe endotheelcellen in vivo en in vitro ^20,21,22. Andere methoden immortalisatie van EC in de literatuur omvatten bijvoorbeeld de immortalisatie met SV40 grote T antigen van Simian Virus 40 Vacuola ²³ adenovirus E1A genproduct ²⁴ of overexpressie van de katalytische subeenheid van menselijk telomerase ^3. De immortalisatie met PymT specifiek is voor de murine onrijpe EC, waardoor het verkrijgen van een homogene EC cultuur van neonatale muizen in een korte tijd. Immortalisatie verandert de eigenschappen van de cellen en ee resultaten verkregen met geïmmortaliseerde cellijnen kan gebruik worden vergeleken met primaire cellen of in vivo experimenten met muizen. PymT onsterfelijk EG is beschreven hoge fibrinolytische activiteit als gevolg van verhoogde productie van urokinase-type plasminogeen activator drukken en verlaagde productie van plasminogeen activator remmers ^25. Rechtstreekse vergelijking PymT geïmmortaliseerde cellijn met bEND5 primaire EC gebleken dat zowel in vitro modellen BBB goed geschikt zijn voor T celadhesie studies ^26.

De cellijnen vastgesteld overeenkomstig de beschreven procedure kan worden gebruikt bij lage passage nummer barrière-eigenschappen te behouden door een hoge expressie van BBB en EC junctional eiwitten, cellen verliezen deze eigenschappen tijdens veroudering. Dus na het verlies van barrière-eigenschappen, moet de voorbereiding van een nieuwe cellijn worden overwogen. Cell plating dichtheid hoog moet zijn voor EC, omdat dit essentieel voor celproliferatie. Dit moet worden gezien in de loop van de isolatie procedure, alsmede het onderhoud van de vereeuwigd EC. Elke nieuwe cellijn moeten worden getest op de barrière-eigenschappen en mogelijke verontreinigingen met andere celtypen. EC monolagen kunnen worden gekleurd met anti-galactocerebroside, anti-gliale fibrillaire zure proteïne en anti-gladde spier antigen als primaire antilichamen tegen de besmetting met oligodendrocyten, astrocyten en pericyten ^4,27 uitsluiten. Uitsluiten besmetting door meningal vasculatuur kan de expressie van trombomoduline te testen, uitgedrukt in alle vasculaire bedden met uitzondering van de hersenen ^28.

Interessant is dat de geïmmortaliseerde microvasculaire endotheliale cellijnen geïsoleerd uit verschillende hersengebieden verschillen in hun barrière-eigenschappen en gevoeligheid voor pro-inflammatoire stimuli. Als voorbeeld kan de cerebrale en cerebellaire CEND cerebEND cellijnen worden vermeld ^4,5. CerebEND toonden in vergelijkingnaar CEND, lagere expressie niveaus van de belangrijkste tight junction componenten claudin-1 en occludin. De niveaus van claudin-3 en -12 waren hoger in cerebEND. De barrièrefunctie van cerebEND cellen lijden veel onder behandeling met het ontstekingsmediatoren, TNFa dan de barrière-eigenschappen van CEND cellen deden ^5. Cerebellaire hogere gevoeligheid voor inflammatoire stimuli kan worden waargenomen in vivo bij multiple sclerose en in het diermodel experimentele autoimmune encephalomyelitis ^29. Deze interessante bevindingen tonen de noodzaak genereren en karakteriseren individu in vitro modellen voor verschillende hersengebieden, om de toekomst drug targeting in de hersenen te verbeteren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Bovine serum albumine (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906	Zuiverheid> 98%
collageen IV	Sigma-Aldrich	C5533	50 pg / ml in 50 mM azijnzuur
Collagenase / Dispase	Roche	10269638001
Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Foetaal kalfsserum (FCS)	PAA Laboratories	A15110-1333	uiteindelijke concentratie 10% hitte geïnactiveerd (30 min bij 56 ° C)
L-glutamine	Biochrom AG	K0282	Opslag: ≤ -15 ° C
MEM Vitamine	Biochrom AG	K0373	Opslag: ≤ -15 ° C
Na-pyruvaat	Biochrom AG	L0473
Neomycine (G418)	PAA Laboratories	P11-012
Niet-essentiële aminozuren (NEA)	Biochrom AG	K0293	Opslag bij 4 ° C
Penicilin / streptomycine	Biochrom AG	A2212	Opslag: ≤ -15 ° C
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)	Biochrom AG	L1825
Polybreen (hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	107689	0,8 mg / ml in PBS, opslag bij -20 ° C
Puromycine	Sigma-Aldrich	P8833
Trypsine / EDTA	Biochrom AG	L1825	0,05%, 0,02% EDTA in PBS