Methodenartikel

Een Menselijke eileider Model voor Onderzoek van

15.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/4036

⸱

11 augustus 2012

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Lübeck, 2Institute of Anatomie, University of Lübeck, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck, 4Medical Clinic III, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een Ex vivo infecties Model voor visualisatie van directe interacties van bacteriële pathogenen met menselijke eileider cellen. De hele orgaanweefsel model werd opgericht om te onderzoeken C. trachomatis Geïnduceerde pathologie aan de vrouwelijke eileider onder "levensechte" voorwaarden.

Samenvatting

Genitale infecties met Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) zijn de meest voorkomende seksueel overdraagbare ziekte bij vrouwen wereldwijd. Inefficiënte klaring of voortduren van de ziekteverwekkers kan leiden tot oplopende infecties van de bovenste genitaal apparaat en worden verondersteld chronische inflammatoire schade aan geïnfecteerde weefsels 1,2 veroorzaken. Als gevolg hiervan kunnen ernstige klinische gevolgen zoals pelvic inflammatory disease (PID), eileiders occlusie en onvruchtbaarheid ontstaan ​​3,4.

De meeste onderzoek met C. trachomatis is uitgevoerd in epitheelcellen lijnen (bijvoorbeeld HEp-2 cellen en HeLa-229) of muizen. Echter, zoals met cel-cultuur gebaseerde modellen, hebben ze geen afspiegeling van de fysiologie van de natuurlijke weefsel, noch de pathofysiologie van C. trachomatis genitale infecties in vivo 5. Verder beperkingen door het feit dat centraal signaaltransductiecascades (bijvoorbeeld IFN-γ mediated JAK / STAT signaalweg) die intracellulaire chlamydia-groei te beheersen fundamenteel verschillen tussen muizen en mensen 6,7. Wij en anderen dan ook is een hele orgel eileider model om de directe interacties tussen C. te onderzoeken trachomatis en menselijke eileider cellen ex vivo 8,9.

Hiertoe werden humane eileiders van vrouwen die hysterectomie verzameld en geïnfecteerd met C. trachomatis serovar D. Binnen 24 uur na infectie, specimen, geanalyseerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM) en transmissie elektronenmicroscopie (TEM) naar Chlamydia trachomatis opsporen bemiddeld beschadiging van het epitheel en C. trachomatis opnemen vorming in de eileider weefsel.

Protocol

1. Voorbereiding van Chlamydia trachomatis serovar D Stock

  1. Infect confluerende 175 cm 2 celkweek kolf met HeLa-229 cellen met 4 ml C. trachomatis D in SPG buffer.
  2. Incubeer gedurende een uur bij 37 ° C gedurende constant schudden.
  3. 20 ml DMEM met 10% FCS en 240 ul Cycloheximide.
  4. Incubeer in een bevochtigde incubator gedurende 48 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
  5. Voeg 5 ml steriele glazen kralen, sterke schudden verwijderen en te vernietigen C. trachomatis herbergen HeLa-229 cellen.
  6. Verzamel supernatant en voeg nog een 5 ml steriele glazen kralen.
  7. Rock drie keer gedurende 1 minuut aan alle HeLa-229-cellen te vernietigen en het vrijkomen C. trachomatis.
  8. Centrifuge voor 5 min op 1000 RPMI en 4 ° C te ontdoen van celresten.
  9. Gebruik de bovenstaande vloeistof voor infectie van 8 tot 10 175 cm 2 celkweek flessen samenvloeiende grown met HeLa 229 cellen.
  10. Incubeer elke kolf met 4 ml SPG buffer en 4 ml supernatant van eerdere infectie gedurende een uur bij 37 ° C met constant schudden.
  11. Na een uur toegevoegd 15 ml DMEM met 10% FCS en 230 ul cycloheximide gevolgd door 48 uur incubatie bij 37 ° C en 5% CO2.
  12. Voeg 5 ml steriele glazen kralen, schud los te koppelen en te vernietigen C. trachomatis herbergen HeLa-229 cellen.
  13. Gebruik de bovenstaande vloeistof en voeg nog een 5 ml steriele glazen kralen.
  14. Rock drie keer gedurende 1 minuut aan alle HeLa-229-cellen te vernietigen en het vrijkomen C. trachomatis.
  15. Centrifugeer gedurende 5 min op 1000 RPMI bij 4 ° C om zich te ontdoen van cellulaire puin.
  16. Gebruik de bovenstaande vloeistof.
  17. Vul 40 ml van de bovenstaande in 50 ml Falcon buizen, centrifuge voor 99 min met 11.000 RPMI.
  18. Na het centrifugeren Verwijder de bovenstaande vloeistof af en was het pellet met 1 ml SPG buffer.
  19. Homogeniseer depellet in 1 ml aliquot manometer en 20 pi in een 1, 5 ml Eppendorf buis bewaren bij -70 ° C tot gebruik. Biologische activiteit van de bereide voorraad werd bevestigd in een gevestigde HeLa-229 cel infectie model.

2. Voorbereiding van de Mens eileider

  1. Store menselijke eileiders (HFT) van vrouwen die een hysterectomie direct na de operatie in RPMI met 5% FCS zonder antibiotica in 4 ° C tot voorbereiding. Het protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Lübeck (09-153). Vrouwen in de studie opgenomen (leeftijd 34 tot 53) had geen voorgeschiedenis van C. trachomatis infectie. Weefsel van de eileiders is verzameld op peripartum sterilisatie op verzoek van de moeder tijdens de keizersnede of tijdens baarmoederverwijdering als gevolg van symptomatische vleesbomen in de luteale fase. Alle HFT zijn negatief getest op C. trachomatis door PCR.
  2. Ontleden de HFT in een petrischaal met RPMI met5% FCS zonder antibiotica. Gedurende de gehele bewerking het weefsel worden ondergedompeld in media om uitdroging.
  3. Knip en gooi het bindweefsel en weefsel vernietigd tijdens de operatie.
  4. Na dissectie voorzichtig open de HFT met een klein scalpel.
  5. Voor verdere experimenten bereiden stukken weefsel in de grootte van 0,5 cm x 0,5 cm tot 1 cm x 1 cm.
  6. Voor infectie winkel HFT model in 1 ml RPMI met 5% FCS zonder antibiotica. HFT monsters werden geïnfecteerd met 5.5x10 5 IFU (inclusie eenheden) van C. trachomatis.
  7. Incubeer HFT monster in 37 ° C, 5% CO2 en 21% O2 en in 37 ° C, 5% CO2 en 2% O 2 gedurende 24 uur.
  8. Na de incubatie tijd te verzamelen monster en bewaar ze in fixatief Monti's gedurende ten minste drie dagen bij 4 ° C tot SEM / TEM bereiding.

3. Voorbereiding van de HFT Model voor TEM

  1. VoorTEM verwijderen exemplaar uit fixatief Monti's en snijd 2 x 2 mm tot 4 x 5 mm stukken. De resterende weefsel kan worden gebruikt voor SEM.
  2. Was stukken met natrium cacodylate buffer, pH 7,35 gedurende 1 uur.
  3. Incubeer in 1% (w / v) osmiumtetroxide in aqua dest. nachts.
  4. Verwijder het teveel aan osmiumtetroxide door het wassen van 6x5 min in natrium cacodylate buffer, pH 7,35.
  5. Verwijder het water door incubatie in toenemende concentraties ethanol in water (v / v) (30% gedurende 2 uur, 40% 2 uur, 50% 2 uur, 60% 2 uur, 70% 's nachts, 80% 2 h, 90% gedurende 1 uur, 95% gedurende 1 uur 100% gedurende 1 uur.
  6. Spoel ethanol gedurende 2 x 15 min in propyleenoxide en vervolgens naar een mengsel van 50% (v / v) vers bereide Araldite (inclusief alle componenten) propyleen en incubeer overnacht.
  7. Toevoeging aan vers bereide Araldite (inclusief alle componenten) ten minste een uur.
  8. Transfer naar platte inbedding mallen en vul deze met Araldite.
  9. Laat Araldite uithardenten minste 48 uur bij 60 ° C
  10. Na het trimmen van embedded monster gesneden semi dunne secties (700 nm) op een ultramicrotoom gebruik van glas messen of een histo diamant mes en vlek met Richardson vlek.
  11. Snij ultra-dunne secties (ca. 70 nm) met behulp van een diamant mes en transfer naar koper roosters (bijv. 150 vierkante mesh).
  12. Stain ultra-dunne secties met 0,5% (w / v) uranylacetaat in aqua dest. gevolgd door 3% (w / v) loodcitraat in gedestilleerd. in een automatische sectie Stainer. Als alternatief kan delen met de hand worden gekleurd door het verlaten van roosters 15 min. op een verzadigde oplossing van gecentrifugeerd uranylacetaat in aqua dest. gevolgd door 0,3% lood citraat (w / v) in gedestilleerd water.

4. Voorbereiding van de HFT monster voor SEM

  1. Voor SEM verwijderen exemplaar uit fixatief Monti, oriënteren met epitheel naar boven op een 1,5 x 1 cm kurk vel en zet positie met behulp van insecten naalden.
  2. Transfer exemplaar op kurk om geschikte metalen manden enwassen gedurende 30 minuten natrium cacodylate buffer, pH 7.35.
  3. Verwijder het water door incubatie monster in toenemende concentratie van aceton / water mengsels (v / v) 30% gedurende 6 uur, 40% voor 6 uur, 60% gedurende 8 uur, 70% 's nachts, 80% 2 uur, 90% 2 uur en 100% 's nachts (uiterst voorzichtig te blijven monster continu onder water).
  4. Transfer naar vers 100% aceton en droog monster met behulp van kritisch punt drogen (temperatuur 40 ° C, druk 80 bar).
  5. Verwijder de naalden, kurk en lijm exemplaar met het epitheel naar boven op SEM exemplaar mount voorzien van een geleidende koolstof tabblad met behulp van geleidende koolstof cement. Gebruik vloeibare geleidende zilver om de geleidbaarheid tussen de bevestiging en de geleidende koolstof tabblad te verbeteren.
  6. Bereid een geleidende platina, goud of palladium coating van het monster met een sputter coater.

5. Kleuren van Semi dunne secties met Richardson's Stain

  1. Laat semi dunne delen droog op dia.
  2. Vlek secties kleuren oplossing bij 60 ° C gedurende 1-2 minuten.
  3. Was in aqua dest.
  4. Droge secties en dekglaasje aan.

6. Representatieve resultaten

Binnen de menselijke eileider infectie model dat we in staat waren om verschillen in de epitheliale morfologie tussen de niet-geïnfecteerde controles (figuur 1) en de C. visualiseren trachomatis - geïnfecteerde buizen (figuur 2) onder normoxische staat. Karakteristiek morfologische verschillen impliciet pathogenen geïnduceerde zwelling en lysis van eileider epitheelcellen die niet konden worden gedetecteerd in niet-geïnfecteerde controle. Met behulp van semi-dunne secties en transmissie-elektronenmicroscopie konden we intracellulaire C. te bewijzen trachomatis opname vorming in de ex vivo geïnfecteerd mens eileider weefsel (figuur 3, 5) maar niet in niet-geïnfecteerde controle (figuur 4). Zoals zuurstof concentragen in de vrouwelijke geslachtsorganen zijn al laag onder fysiologische omstandigheden 11 en verdere daling tijdens een inflammatoir proces hebben we ook ons model onderzocht onder hypoxische condities. Voorlopige resultaten geven aan het model is nuttig om chlamydia-groei en de nakomelingen te analyseren onder verschillende zuurstof concentraties. Chlamydia-geïnduceerde epitheliale cellen schade moet worden gescheiden van artefacten die worden bemiddeld door onvoorzichtige voorbereiding en behandeling van de eileiders vóór infectie (figuur 6).

figure-protocol-1
Figuur 1. Scanning electronen microscopie (SEM) van een niet-geïnfecteerde menselijke eileiders na een dag incubatie in controle medium (groene pijl aan trilharen cel, blauwe pijl aan niet-trilharen cel).

figure-protocol-2
Figuur 2. Scanning elektronen micro's kopie (SEM) van een ex vivo C. trachomatis infectie menselijke eileider een dag na infectie (witte pijl gescheurde integratie).

figure-protocol-3
Figuur 3. Semi dunne secties tonen typische intracellulaire insluitsels (witte pijlen) 1d na infectie van de menselijke eileider met C. trachomatis ex vivo.

figure-protocol-4
Figuur 4. Transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) van een niet-geïnfecteerde humane eileider na een dag incubatie onder controle medium.

figure-protocol-5
Figuur 5. Transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) van een ex vivo C. trachomatis infectie menselijke eileider een dag na infectie (witte pijlen geven chlamydia-insluitingen).

ve_content "> figure-protocol-6
Figuur 6. Scanning electronen microscopie (SEM) van eileider epitheel beschadigd door onvoorzichtige voorbereiding en behandeling van het monster (witte pijlen merk vernietigd epitheelweefsel).

Discussie

Visualisatie van pathogenen geïnduceerde schade aan het geïnfecteerde weefsel is zwaar en vaak beperkt tot experimentele procedures bij muizen. We stelden een ex vivo model infectie bij de mens eileiders naar C. te analyseren trachomatis infecties van de bovenste vrouwelijke geslachtsorganen. Door toepassing van deze methode, konden we C. visualiseren trachomatis - geïnduceerde schade aan de eileider epitheel binnen een dag na infectie. Cellulaire zwelling en lysis waren typische morfologische veranderingen die werden waargenomen in C. trachomatis - geïnfecteerde eileiders, maar niet in niet-geïnfecteerde controles. TEM analyses bleek dat Chlamydiae een typische intracellulaire ontwikkelingscyclus te voeren binnen de geïnfecteerde weefsels, met grote insluitsels met re-gesplitste elementaire lichamen, maar ook kleinere insluitsels met vergrote reticulate lichamen die kunnen wijzen op doorzettingsvermogen. Echter, de morfologische beeld alleen niet voldoende zijn om onderscheid te maken tussen replicating en hardnekkige infecties, die worden gekenmerkt door een verminderd metabolisme en een verhoogde weerstand tegen antimicrobiële middelen 10.

Vernietiging van het epitheel in geïnfecteerde eileiders is hetzij als gevolg van verstoring van de C. trachomatis - geïnfecteerde epitheelcellen na voltooiing van de intracellulaire ontwikkelingscyclus en het vrijkomen van infectieuze elementaire organen of het vrijkomen van pro-inflammatoire cytokines 8. Pathogenen geïnduceerde beschadiging van het weefsel en host-geïnduceerde immuunreacties tegen C. trachomatis worden verondersteld de belangrijkste factoren die leiden tot verlies van epitheliale cel functie, fibroblast remodeling en ten slotte de eileiders onvruchtbaarheid in vivo 8,11.

Een van de belangrijkste beperkingen van dit model is de afwezigheid van inflammatoire cellen die de analyse van nevenwerkingen belemmert de eerste C. trachomatis infectie van de eileider epitheel. Echter, het model is apEen geschikte aan verschillende milieu-omstandigheden (bijv. zuurstofgehalte) en de eerste host-immuunrespons bij acute C. te onderzoeken trachomatis infecties 8,9. Verdere plannen zijn om een model voor het testen van antimicrobiële middelen tegen C. te stellen trachomatis in gehele menselijke eileiders en de metabole toestanden van de verschillende ontwikkelingsstadia waargenomen in de eileider epitheel door 2-foton laser scanning microscopie karakteriseren.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de DFG-Cluster of Excellence "ontsteking op Interfaces" (RA-Als, RA-D). We zijn dankbaar voor de uitstekende technische bijstand van Kristin Wischnat.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het serum Vennootschap Catalogusnummer Reacties
DMEM PAA E15-843
RPMI PAA R15-802
FCS PAA A15-101
Cycloheximide Sigma - Aldrich
SPG buffer verschillende hieronder zie recept
Monti's fixatief verschillende hieronder zie recept
natrium cacodylate buffer verschillende hieronder zie recept
Richardson de vlek verschillende hieronder zie recept

Recepten:

1. SPG buffer

  1. Voeg 75 g sucrose.
  2. Voeg 2,47 g dinatrium fosfaat.
  3. Voeg 0,36 g mononatriumfosfaat.
  4. Voeg 0,72 g glutaminezuur.
  5. Vul aan tot 1 liter met gedestilleerd water.
  6. Pas de pH op 7,3.

2. 0,1 M natrium cacodylate buffer, pH 7.35.

  1. Voeg 42,80 g dimethylarsenic-natriumzout.
  2. Voeg 68,46 g sucrose.
  3. Vul aan tot 1 liter met gedestilleerd water. tot 0,2 M natrium cacodylate buffer te krijgen.
  4. Voor gebruik verdunde oplossing met gedestilleerd water. gewenste concentratie en de pH 7,35 indien nodig.

3. Monti's fixatief

  1. Voeg 156 ml 0,12 M natrium cacodylate buffer. 3,2 Voeg 25 ml 25% glutaardialdehyde in aqua dest.
  2. Voeg 19 ml10% paraformaldehyde in aqua dest.
  3. Voeg 3 ml 3% CaCl 2 in aqua dest.
  4. Breng de pH op 7,35 en vul deze met gedestilleerd water. tot 312 ml uiteindelijke oplossing.

4. Richardson vlek

  1. Meng gelijke delen 1% methyleenblauw in 1% waterige oplossing en borax 1% Azur II in gedestilleerd.

Referenties

  1. Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping. J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).
  2. Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility. Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).
  3. Peipert, J. F. Clinical practice. Genital chlamydial infections. N. Engl. J. Med. 349, 2424-2430 (2003).
  4. Mardh, P. A. Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).
  5. Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells. Mol. Cancer. 5, 55(2006).
  6. Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells. Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).
  7. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
  8. Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection. Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).
  9. Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).
  10. Wyrick, P. B., Knight, S. T. Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin. J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).
  11. Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring. Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Chlamydia trachomatisscanningelektronenmicroscopietransmissie elektronenmicroscopieex vivo weefselmodelfixatiemiddel van Montykritisch punt drogersputtercoaterultramicrotoomhypoxiekamer

Gerelateerde artikelen