Computed Tomography-begeleide tijd-domein Diffuus fluorescentie tomografie in kleine dieren voor het lokaliseren van Cancer Biomarkers

Summary

Diffuse fluorescentie tomografie biedt een relatief goedkope en potentieel hoge hele benadering van de preklinische In vivo Tumor beeldvorming. De methodiek van optische data verzamelen, kalibratie en beeldreconstructie wordt gepresenteerd voor een computertomografie-geleide non-contact tijd-domein systeem met behulp van fluorescerende doelgerichtheid van de tumor biomarker epidermale groeifactor receptor in een muis glioom model.

Abstract

Kleine dieren fluorescentie moleculaire beeldvorming (FMI) is een krachtige tool voor geneesmiddelen in preklinische ontwikkeling ontdekking en ontwikkeling van studies ^1. Echter, de absorptie van licht door weefsel chromoforen (bv hemoglobine, water, lipiden, melanine) beperkt meestal optisch signaal voortplanting door middel van diktes groter dan enkele millimeters ^2. In vergelijking met andere zichtbare golflengten, weefsel absorptie voor rood en nabij-infrarood (bijna-IR) absorptie van licht drastisch afneemt en niet-elastische verstrooiing wordt de dominante licht-weefsel interactie mechanisme. De relatief recente ontwikkeling van fluorescerende stoffen die absorberen en licht uitstralen in het nabij-infrarood bereik (600-1000 nm), heeft gedreven de ontwikkeling van beeldvormende systemen en de licht inval modellen die het hele lichaam driedimensionale beeldvorming kan bereiken in kleine dieren ^3.

Ondanks de grote vooruitgang geboekt op dit gebied, de slecht-gestelde aard van diffuse fluorescentie tomografie blijft een belangrijkeprobleem voor de stabiliteit, het contrast herstel en de ruimtelijke resolutie van beeldreconstructie technieken en de optimale benadering van FMI in kleine dieren moet nog worden afgesproken. De meerderheid van de onderzoeksgroepen hebben geïnvesteerd in charge-coupled device (CCD)-gebaseerde systemen die overvloedig weefsel-sampling, maar suboptimale gevoeligheid voor ^4-9 zorgen, terwijl onze groep en een paar anderen ^10-13 hebben uitgeoefend op basis van een zeer hoge gevoeligheid detectoren , waarmee op dat moment dichte weefselmonster alleen worden bereikt ten koste van de lage imaging doorvoer. Hier laten we zien de methodologie voor de toepassing van single-photon detectie technologie in een fluorescentie tomografie systeem te lokaliseren een kankergezwel hersenletsel in een muismodel.

De fluorescentie tomografie (FT)-systeem in dienst enkel foton te tellen met behulp van fotomultiplicatorbuizen (PMT) en informatie-rijke tijd-domein licht detectie in een non-contact exterieur ^11. Dit levert een gelijktijdige collectie van de verstrekte excitatie en emissie licht, en omvat automatische fluorescentie excitatie belichtingsregeling ^14, laser-referencing, en co-registratie met een klein dier computertomografie (microCT) systeem ^15. Een naakt muismodel gebruikt voor beeldvorming. Het dier werd orthotopically geënt met een menselijke glioma cellijn (U251) in de linker hersenhelft en 2 weken later afgebeeld. De tumor werd fluoresceren door injectie van een fluorescerende tracer, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) gericht op epidermale groeifactor receptor, een membraan eiwit bekende overexpressie gebracht in de tumor U251 lijn en andere tumoren ^18. Een tweede, ongerichte fluorescerende tracer, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) werd ook geïnjecteerd om rekening te houden voor niet-receptor gemedieerde effecten op de opname van de gerichte tracers om een ​​middel van het kwantificeren van tracer binding en receptor beschikbaarheid / dichtheid bieden ^27. Een CT-geleide, time-domein algoritme werd gebruikt om de positie van beide fluorescerende verklikstoffen (de plaats van de tumor) in muizenhersenen en hun vermogen om lokaliseren tumor werd geverifieerd door contrastversterking MRI reconstrueren.

Hoewel gebleken voor fluorescentie beeldvorming in een glioom muismodel, kan de methode in dit video worden uitgebreid tot andere tumormodellen verschillende kleine diermodellen mogelijk tot de grootte van een rat ^17.

Protocol

1. Toebereiding van dieren

1. Verdoof naakt muis (Charles River, Wilmington, MA) met intraperitoneale injectie van ketamine-xylazine (100 mg / kg: 10 mg / kg ip).
2. Plaats de muis in het stereotactische frame, een incisie te maken in de hoofdhuid aan de linkerkant van de schedel en, met behulp van een 18-gauge naald, maak dan een 1 mm diameter gat in de schedel 2 mm van de centrale lijn en 2 mm achter de bregma.
3. Injecteer 5 × 10 ⁵ U251 menselijke neuronale glioblastoma cellen (vriendelijk verschaft door Dr Mark Israël aan het Dartmouth College, Hanover, NH) in 5 ul van fosfaatbufferoplossing in de linker hersenhelft op een diepte van ongeveer 2 mm onder het oppervlak van de hersenen. Gebruik een Hamilton micro-spuit ¹⁸ en een stomp eindigde 27-gauge-naald voor cel-implantatie en steek de punt van de naald 3 mm van de buitenkant van de schedel en vervolgens hoeveelheden van 1 mm tot een zak voor de cellen te creëren.
4. Suture incisie en laat opnieuwhersteltools van een operatie.
5. Wacht ~ 14 dagen om de tumor te groeien voor de beeldvorming.

2. Fluorescentie Tomography System Kalibratie

1. Op de dag van de muis imaging, start-systeem en laat lasers en licht detectoren op te warmen-up voor ongeveer 20 minuten tot afwijkingen in de gevoeligheid van het systeem te voorkomen.
2. Plaats een 100 °-door-4 ° ontworpen lijn diffusor (Thorlabs, Newton, NJ) in de directe centrum van de beeldvorming gantry, normaal om de excitatie laser: een picoseconde-gepulste 80-MHz multimode 635 nm laser diode (PicoQuant Photonics Noord America Inc, Westfield, MA). Pas de hoek van de diffusor aan de hoeveelheid signaal gedetecteerd door alle vijf de licht verzameling kanalen te maximaliseren. Een volledige beschrijving van de imaging-geometrie wordt elders ^11,14,15 voorzien.
3. Plaats OD 2 grijsfilters (Thorlabs, Newton, NJ) voor alle fluorescentie detectie fotomultiplicatorbuizen (PMT) en OD 1 grijsfilters (Thorlabs, Newton, NJ) voor alle transmissie detectie PMT. Verzamelen 100 temporele puls spreiding profielen (TPSF) van de laser, elk met een 1-s Integratietijd.
4. Normaliseren elk TPSF door de laser referentie, correct voor tijdelijke drift in de laser referentie, en het gemiddelde over alle iteraties voor elke detector. Met deze gemiddelde TPSFs zijn de detector-specifiek instrument respons functies (IRF) die worden gebruikt in de optische beeldreconstructie.

3. Imaging Protocol

1. Verdoven de muis met 2% isofluraan zuurstof (1 l / min).
2. Injecteer 1 nanomole van IRDye 800CW-EGF en 1 nanomole van Alexa Fluor 647 in 100 ul van de fosfaatbufferoplossing, intraperitoneaal, 12 uur voorafgaand aan de beeldvorming om epidermale groeifactor receptor overexpressie te richten in de tumor.
3. Plaats de muis op de glasvezel ondersteunt van de beeldvorming bed, het regelen van de muis, zodat zijn neus blijft een kegel leveren isofluraananesthesie.
4. Enervoor dat de muis de juiste wijze wordt gepositioneerd op het bed: dat wil zeggen, dat wanneer het bed is bevestigd in het fluorescentie tomografie het systeem van de muis is ongeveer in het midden van de beeldvorming portaal. Deze positionering kan worden geleid door aan de excitatie laser 180 ° over de muis, zodat het brandpunt van de laser een punt ongeveer licht op het midden van de muis vanuit de laser onder alle hoeken.
5. Eenmaal geplaatst, zorgvuldig over te dragen van de beeldvorming bed en de muis naar de microCT (verkennen Locus, GE Healthcare, London, ON) scanner en het verzamelen van anatomische informatie op een resolutie van 93-um isotrope voor de hele kop van de muis.
6. Visualiseer de CT-beeld stapel en kies de slice (s) af te beelden met de fluorescentie tomografie systeem.
7. Voorzichtig weer over de imaging-bed en de muis om de fluorescentie tomografie systeem. Kies het aantal bron posities om gegevens over de muis te verzamelen voor elke beeldvorming SLICe (32), de integratietijd voor elke meting TPSF (1 s), het aantal iteraties voor elke bronpositie (10) en de positie en aantal gewenste beeld segmenten van de CT-beeld stapel uit stap 3.6. De nummers tussen haakjes zijn typische waarden voor elke parameter beeldvorming waardoor ~ 5 minuten van data-acquisitie per beeldvorming slice.
8. Plaats triple notchfilters (Chroma Technology Corp Bellows Falls, VT) voor het fluorescentiedetectie PMT om een ​​laser licht op de fluorescentie detectoren beperken en OD 2 grijsfilters voor de transmissie detectie PMT verzadigd voorkomen van deze detectoren.
9. Voer de data-acquisitie software, het verzamelen van fluorescentie en transmissie TPSFs bij elke gedefinieerde bron-detector positie en voor elke excitatie golflengte (635 nm en 755 nm op de Alexa Fluor 647 en IRDye 800CW-EGF tracers, respectievelijk te wekken). Voor elke set van TPSFs verzameld, controleren en vastleggen van de laser intensiteitmet een referentie PMT kanaal.

4. Beeldreconstructie

1. Bepaal de buitenkant van de muis en de locatie van de beeldvorming bed ondersteuning staven van de CT-beelden en maskers te maken dat de grenzen van de muis en de beeldvorming staven omvat afzonderlijk.
2. Gebruik de muis masker van een eindige-elementen mesh van het dier met behulp van de software NIRFAST ¹⁹ te produceren.
3. Lokaliseren de bron en de detector posities van de fiuorescentie systeem op het oppervlak van het gaas op microCT en fluorescentie ruimtelijke coördinaten registratie ^20.
4. Verwijder optische datapunten verbonden bron of detector posities die interageren met de locatie van het beeldvormende bed steunstangen.
5. Normaliseren gegevens verzameld op elke bron-detector positie door de laser referentie, correct voor tijdelijke drift in de laser referentie, en juist voor het filter gevoeligheden, die werden bepaald door middel van proeven op het moment van aankoop ^15.
6. Neem de Born Ratio van de gegevens (fluorescentie gedeeld door transmissie) voor elke bron-detector positie en vermenigvuldigen met een voorwaartse model simulatie van transmissie op basis van de eindige elementen dier mesh voor een uniforme optische eigenschappen. Dit wordt gedaan om fouten met bron of detector weefsel koppeling ²¹ te beperken, de gegevens kalibreren het model ²² en gegevens voor andere aspecten van model-data mismatch ^23,24 passen.
7. Teken een vector data uit de geschaalde verschil van de geboren verhouding verzamelde gegevens aan beide golflengten. De vergrotingsfactor wordt gekozen om EGFR bindend contrast te maximaliseren. Voer tijd-domein beeldreconstructie met de gekalibreerde verschil gegevens met behulp van de TPSF voor elke detectie kanaal als input, en maak fluorescentie kaarten van de contrast-versterkte gericht tracer ^15.

5. Representatieve resultaten

"> Een voorbeeld van een fluorescentie reconstructie bedekt met een co-geregistreerde CT anatomische afbeelding van het hoofd van een muis met een U251 orthotope glioom tumor is weergegeven in Figuur 1b. Het centrum van de massa van de glioom bepaald door de tl-reconstructie (figuur 1b ) was binnen 1 mm van de tumor centrum van de massa bepaald door de contrast-verbetering van magnetic resonance imaging (figuur 1a). De CT-en MRI-beelden werden samen ingeschreven op basis van een wederzijdse informatie transformatie.

Figuur 1. Met contrast-versterking (gadolinium) magnetische resonantie beeld van de muis hoofd (a). De muis werd orthotopically geënt met een U251 menselijke glioma cellijn. De plaats van de tumor die meer contrastmiddel dan de normale hersenen absorbeert, te zien in de linkerhersenhelft (rechts in beeld) en aangegeven door de witte pijl. De corresponding computertomografie beeld (vanaf dezelfde locatie op de muis hoofd) is afgebeeld in (b) met de epidermale groeifactor gericht fluorescentie na aftrek van de niet-gerichte fluorescentie reconstructie bedekt. De eenheden van fluorescentie in inverse mm en hebben betrekking op de absorptiecoëfficiënt van gebonden gerichte fluorescentie vermenigvuldigd met zijn kwantumrendement en zijn concentratie.

Discussion

Fluorescentie tomografie (FT) is een gevoelig, ioniserende straling vrij moleculaire beeldvormende modaliteit op basis van zichtbare en nabij-infrarood licht transport door biologisch weefsel. De meeste van het belang in FT is gericht op de mogelijkheden van drug discovery en ontwikkeling te versnellen in kleine dieren experimentele modellen ¹ en een belangrijk terrein van onderzoek is de studie van kanker biomarker expressie en de reactie op moleculaire therapieën ^26. Op dit moment zijn er twee concurrerende benaderingen van FT systeemontwerp. De meest voorkomende ontwerp is gebaseerd op gekoelde ladingsgekoppelde inrichting (CCD) camera's fluorescentiedetectie ^4-9. Dit ontwerp geeft een hoge dichtheid van metingen maximaliseren weefselmonster aangezien elke pixel in de CCD camera kan licht dat een uniek pad is afgelegd door het weefsel. Echter, CCD-camera's hebben een beperkt dynamisch bereik en lees-out grenswaarden voor het geluid hun ultieme gevoeligheid. Het tweede ontwerp voorkomt mogelijke beperkingen gen van de CCD-camera detectie door het gebruik van zeer gevoelige single-photon tellen van technologie, gebaseerd op het gebruik van dergelijke detectoren fotomultiplicatorbuizen of lawine fotodiodes ^10-13. Het nadeel van deze gevoeliger detectiemethoden dat elke detector alleen licht te verzamelen op een punt, dus bereiken dicht weefsel monsters, hetzij veel detectoren te gebruiken (die zeer duur), of meerdere uitsteeksels worden afgebeeld met dezelfde detector (welke kan tijdrovend zijn). Terwijl het optimale niveau van weefsel bemonstering voor kleine dieren FT niet is overeengekomen, en kan variëren van geval tot geval, wordt overeengekomen dat single-photon tellen van instrumenten beter geschikt is om de gevoeligheid grenzen van de FT te verkennen op het gebied haar vermogen om lage concentraties van moleculaire merkers te detecteren. In deze studie geven we een methodologie voor het uitvoeren van FT het gebruik van single-photon tellen detectie apparatuur te lokaliseren tumoren in muizen.

ENT "> Er zijn vier belangrijke stappen om robuuste datasets met tijd-gecorreleerde single-photon tellen FT te produceren. De eerste is de toepassing van een geschikte en eenvoudige kalibratie procedure. In de gepresenteerde methodiek, maar de betrokken gevoeligheden van elke detectie kanaal verantwoord door het verzamelen van een nulmeting excitatielicht doorgegeven via een lijn-diffusor de gelijke fracties van het licht aan elke detector ¹⁵ richt. Bovendien wordt het gedetecteerde licht in een experiment continu afgestemd op de laser verwijzing zowel intensiteit en de gemiddelde .-time, wat kan fluctueren in de tijd, door de werking van een laser referentiekanaal ^11,15 De tweede belangrijke stap is de juiste inning en co-registratie van anatomische beeldvorming voor begeleide fluorescentie reconstructies De FT gegevens alleen geen anatomische informatie biedt.; Derhalve, om een ​​model van licht transport maken die gebruikt kan worden om de lo reconstruerentoepassing van fluorescerende bronnen in een exemplaar uit de gedetecteerde fluorescentie aan het oppervlak van het monster moeten de anatomie van het monster ten opzichte van het FT systeem nauwkeurig bekend. In ons systeem wordt de anatomische informatie verkregen door een micro-CT-systeem met ruimtelijke coördinaten die ruimtelijk zijn geregistreerd met die van de FT-systeem ^15,20. De derde belangrijke stap is ervoor te zorgen dat een optimale belichting (dat wil zeggen, de totale foton detectie tijd voor elke laser projectie) is werkzaam bij elke bron-detector positie. Dit is om twee redenen: zodat er voldoende signaal-ruisverhouding bij elke detectiepositie en tweede detector om verzadiging, waardoor schade de detectie-eenheden te voorkomen. Met het oog op een optimale belichting bij elke detector positie te bereiken, een automatische belichting wordt toegepast, die in wezen triangulates de optimale belichting van twee, laag-signaal blootstelling ^14. De vierde kritischestap van de methodologie is dat verwijst naar de verzamelde fluorescentie data om de hoeveelheid uitgezonden excitatie licht. Deze verwijzing wordt ook wel de Born-verhouding, en biedt vele voordelen voor FT, met de voornaamste is een beperking van het model-data mismatch fouten ^23,24. De gepresenteerde systeem is ontworpen om zowel fluorescentie en doorvallend excitatielicht gelijktijdig detecteren door channeling het licht in elke detectie kanaal in 2 aparte fotomultiplicatorbuizen. Door dit te doen, vermijden we eventuele effecten van beweging op de juistheid van de Born ratio.

Met een robuuste dataset met de hand, beeldreconstructie van tijd-domein van gegevens betreft het oplossen van het inverse probleem van de eindige elementen mesh met de uitdrukking:

d = Jx

waarbij d is een vector met n x m-elementen voor n bron-detector projecties en m TPSF tijd poorten, J is een n x m-voor-l gevoeligheid matrix (of Jacobian) voor l knooppunten in het gaas en x de vector van fluorescentie optische eigenschappen in elk knooppunt met afmetingen l d gekalibreerde gegevens tijdens het experiment en J gesimuleerd met de eindige elementen oplossing. naar het tijdsdomein diffusie onderlinge aanpassing van de fluorescentie transport ^25. De tijd dimensie J ook geconvolueerd met de detector specifieke instrument responsies. X is een voorstelling van de fluorescentie kaart van belang en wordt opgelost met een Levenberg-Marqardt niet-negatieve kleinste kwadraten benadering Tikhonov regularisatie ^15.

De methodiek die hier, die beschrijft een procedure die kan lokaliseren van fluorescent gelabelde tumoren in muizen met behulp van zeer gevoelige foton tellen fluorescentiedetectie, heeft de potentie om de grenzen van de FT te duwen. In een eerdere studie, het potentieel van de tewerkstelling van dezebenadering groter dan muizen diermodellen, zoals ratten, alsmede verbeterde gevoeligheid ten opzichte van bestaande installatie ontwerpen muis grote specimens werd aangetoond ^17. De onmiddellijke toepassing van deze aanpak zou zijn voor de monitoring van biomarker expressie in vivo in kleine dieren tumor modellen om de werkzaamheid van drugs beoordelen in een high-throughput middelen. Het vermogen van het systeem op te wekken en fluorescentie detecteren op meerdere golflengtes kan de gelijktijdige detectie van meerdere fluorescerende markers. Extra fluorescerende merkers een middel van het ondervragen meerdere aspecten van een pathologie, tegelijkertijd, of kan worden gebruikt, zoals in deze studie, om meer kwantitatieve beeldvorming benaderingen, zoals dual-reporter-methoden voor het meten in vivo binding potentieel, een marker van receptor dichtheid in dienst ^26,27.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
IRDye 800CW-EGF	LI-COR Biosciences	926-08446
Alexa Fluor 647, succinimidylester	Life Technologies	A20106	Gereageerd met water niet-specifieke binding te minimaliseren