Optische registratie van suprathreshold neurale activiteit met single-cell en single-spike resolutie

Samenvatting

Inzicht in de functie van de gewervelde centrale zenuwstelsel heeft opnames van vele neuronen omdat corticale functie ontstaat op het niveau van populaties van neuronen. Hier hebben we een optische methode om suprathreshold neurale activiteit op te nemen met single-cell en single-spike resolutie te beschrijven, dithered random-access scanning. Deze methode neemt somatische fluorescentie calcium signalen van tot 100 neuronen met een hoge temporele resolutie. Een maximum-likelihood-algoritme deconvolves de onderliggende suprathreshold neurale activiteit van de somatische fluorescentie calcium signalen. Deze methode detecteert betrouwbaar spikes met een hoge detectie-efficiëntie en een laag aantal valse meldingen en kan worden gebruikt om neurale populaties te bestuderen In vitro En In vivo.

Samenvatting

Signalering van informatie in de gewervelde centrale zenuwstelsel wordt vaak gedragen door populaties van neuronen in plaats van individuele neuronen. Ook de verspreiding van suprathreshold spiking activiteit betrekking populaties van neuronen. Empirische studies over corticale functie direct vereist dus opnamen van populaties van neuronen met een hoge resolutie. Hier beschrijven we een optische methode en deconvolutie algoritme neurale activiteit opnemen tot 100 neuronen met single-cell en single-spike resolutie. Deze methode berust op detectie van de tijdelijke toename in intracellulaire calciumconcentratie somatische verbonden suprathreshold elektrische pieken (actiepotentialen) in corticale neuronen. Hoge tijdsresolutie van het optische opname wordt bereikt door een snelle willekeurige toegang scantechniek gebruik acousto-optische deflectoren (gedelegeerd ordonnateur) ^1. Twee-fotonexcitatie van de calcium-gevoelige kleurstof resulteert in hoge ruimtelijke resolutie in ondoorzichtige hersenen tisaanklagen ^2. Reconstructie van spikes van de fluorescentie calcium opnamen wordt bereikt door een maximum-likelihood methode. Gelijktijdig elektrofysiologische en optische opnamen geven aan dat onze methode betrouwbaar spikes (> 97% spike detectie-efficiëntie) detecteert, heeft een laag aantal valse positieve spike detectie (<0,003 spikes / s) en een hoge temporele precisie (ongeveer 3 ms) ^3. Deze optische methode spike detectie kan worden gebruikt om neurale activiteit opnemen in vitro en in vivo in dieren verdoofd ^3,4.

Protocol

1. Optische opstelling (figuur 1)

1. Voor twee-fotonexcitatie een infrarood laser gepulst systeem femtoseconde pulsen gebruikt. Een hoge laser uitgangsvermogen (soms> 2W bij 890 nm golflengte) nodig om de grote verliezen die door de optische componenten van het systeem te compenseren.
2. Een prechirper bestaande uit twee prisma zorgt voor een negatieve groep snelheidsdispersie (GVD) op de laserpulsen voor de acousto-optische deflectoren (gedelegeerd ordonnateur) ter compensatie van de temporele dispersie die door de gedelegeerd ordonnateur ^1.
3. Twee gedelegeerd ordonnateur met grote openingen (10 mm voor een 40x water immersie objectief met NA 0,8) buigen de laserstraal in twee dimensies.
4. Een reflecterende diffractierooster met 100 bosjes / mm geplaatst van 13 cm achter de gedelegeerd ordonnateur van de ruimtelijke spreiding geïntroduceerd door gedelegeerd ordonnateur compenseren bij gebruik van korte laserpulsen.
5. De laserstraal wordt gericht met twee relais telescopen in de camera-poort van een rechtopstaande microscope.
6. Irissen worden geplaatst op regelmatige tijdstippen voor het uitlijnen van de optische componenten.
7. Een dichroïsche bundelsplitser voor het doel zendt het infrarood excitatielicht met het model en weerspiegelt de fluorescentie van het monster op een detector.
8. Epi-en transfluorescence detectoren (fotomultiplicatoren, PMT's) te verzamelen fluorescentie-signaal door de objectieve en - indien van toepassing - door de condensor.
9. Gekleurd glas filters (BG-39, 3-5 mm) worden geplaatst voor de detectoren aan excitatielicht voorkomen bereiken van de detectoren.
10. De AOD afbuighoeken gestuurd door een computer uitgerust met een digitaal-analoog-converter board (156,25 kHz kloksnelheid), dat op zijn beurt spanningsgestuurde oscillatoren.
11. Het signaal van de fotomultiplicatoren wordt doorgegeven via een laagdoorlaatfilter Butterworth filter (cut-off frequentie van 100 kHz) en gedigitaliseerd door een analoog-digitaal-omzetter (156,25 kHz kloksnelheid) voordat deze wordt opgeslagen ineen computer voor analyse.
12. Uitlijning en elektrische ruis getest door registratie van de verdeling van fluorescentiesignalen met en zonder laserlicht, bij lage en hoge gain van de fotomultiplicatoren, en met en zonder indicator. De scanner correct is ingesteld en afgeschermd wanneer de breedte van de verdeling van de fluorescentiesignalen bij hoge gain en indicator is veel groter dan de breedte van de andere distributies van fluorescentiesignalen (Fig. 2).

2. Experimentele procedures

1. Geditherde random-access scanning is gebaseerd op de detectie van intracellulaire stijging van calcium. Een groot aantal neuronen kan worden gekleurd met bolus injectie van de ester vorm van een calcium indicator (bijvoorbeeld Oregon Green 488 Bapta AM-1) in zenuwweefsel ^5.
2. Verschillende locaties van elk neuron soma opgenomen, elk voor een korte tijd ("dithering", 4 plaatsen, 6,4 microseconden voor elke locatie = 25,6 us opnametijd voor each neuron in elke cyclus, Fig. 3C). Om neuronen plaats selecteren full frame bestaande uit 256x256 pixels wordt verkregen (Fig. 3A). Het midden van elke neuron soma worden geregistreerd handmatig gekozen binnen het beeld. De controle software voegt automatisch drie punten bij 2 micrometer afstand rond dit centrum.
3. In elke cyclus wordt de fluorescentie signaal dat van elk van de 40 neuronen (Fig. 3B). Dit proces wordt herhaald voor de gehele duur van een opname (5 tweede registratie = 3,255 cycli, 1 cyclus = 1,536 ms).

3. Online software tools om spike detectie-efficiëntie te maximaliseren

1. Spike detectie van fluorescentie somatische calcium signalen berust op een hoge signaal-ruisverhouding (S / N) verhouding van de somatische fluorescentie calcium signalen. Een hoge S / N kan worden bereikt door excitatie-intensiteit. Excitatie-intensiteit kan echter alleen worden verhoogd tot een bepaalde limiet door zonbeschadigde. Spike detectie is hoog in een zeer kleine Window excitatie intensiteiten wanneer fluorescentiesignalen een hoge S / N, maar slechts weinig zonbeschadigde waargenomen ^3. Om ervoor te zorgen dat de geregistreerde signalen binnen het raam van hoge piek detectie tijdens opnames we controleren foton rate (zie vergelijking 3.2) en een afname van de basislijn fluorescentie met behulp van online analyse.
2. Geschatte foton rate per neuron wordt berekend uit een korte tijdspanne (100-200 ms) van basislijnruis. Aantal fotonen (N _λ) en foton rate (λ = N _λ / At) wordt berekend uit de fluorescentiewaarden door het aanbrengen van de verdeling (σ) van relatieve fluorescentie verandert met de volgende vergelijking:

Deze vergelijking geeft de Poissonverdeling voor foton opname ruis met een verandering van variabele relatieve fluorescentie change: AF / F = (G * N _λ (t)-N * G _{& lam}BDA,, 0) / G * N _{λ, 0} waarbij G staat voor de cumulatieve winst van fotomultiplicator en alle andere elektronische componenten. Merk op dat deze vergelijking niet correct het aantal gedetecteerde fotonen in vivo opnames bepalen omdat er andere geluidsbronnen (bewegingsartefacten) naast foton schot ruis. Echter deze vergelijking is bruikbaar voor in vivo opnames de ruisschatting.

3. Baseline fluorescentie na diezelfde tijdvenster en uitgezet als functie van tijd of trials. De gemiddelde daling van de uitgangswaarde wordt gehouden onder 0,0002 / s door het aanpassen van laservermogen omdat spike detectie snel daalt bij het overschrijden van deze limiet.
4. Elke 10-20 min het neuron somata posities zijn gecontroleerd door opnieuw het verwerven van een full frame beeld. Indien nodig, worden de opname locaties aangepast. Locaties kunnen worden aangepast voor alle neuronen in een keer, of voor individuele neuronen.

4. Reconstruction van de spike timing van fluorescentie signalen (deconvolutie)

1. De fluorescentiesignalen gevolg van neurale activiteit vaak summate in tijd omdat het verval van de calcium transiënten lang is (enkele honderden milliseconden). Een deconvolutie methode reconstrueert spike en spike timing van fluorescentie signalen.
2. Om de meest waarschijnlijke spike trein ten grondslag liggen aan het opgenomen fluorescentie signaal te bepalen, zijn verschillende modellen vergeleken. Hier gebruikten we een genetische algoritme om het model te bepalen - en daarmee de trein en spike spike timings - de maximum likelihood.
3. In inhomogene populaties van neuronen, kan de spike-opgeroepen calcium signaal variëren tussen neuronen. Voor clustering analyse van gegevens die we gemaakt van een algoritme dat rekening houdt met de variatie van de spike-opgewekte signaal van calcium neuron tot neuron.
4. Om te voorkomen een groot aantal vals positieve detectie is het nuttig vernauwen het toegestane amplitude en verval tijdsconstante van de model van de spike-opgeroepen calcium signaal. De gezamenlijke verdeling van de amplitude en verval tijdsconstante van single-spike opgewekte calcium transiënten worden in een aparte reeks experimenten uit hetzelfde type van neuronen onder dezelfde proefomstandigheden simultaan elektrofysiologische en optische opnamen.
5. Om rekening te houden langzame basislijn wijzigingen en om computationele kosten van deconvolving te verminderen, zijn langere opnames onderverdeeld in verschillende kortere sporen van 1-5 seconden.
6. Voor elke neuron en elke opname kan de deconvolutie algoritme testen een groot aantal modellen (tot 1.000.000 of meer verschillende modellen). Om het tempo van deconvolutie, is een experiment deconvolved op maximaal 10 verschillende computers in parallel.
7. Na deconvolutie, wordt de piek data geanalyseerd en gecontroleerd. Een peri-stimulus time histogram, spike waarschijnlijkheid, en vuursnelheid (gemiddelde piek per neuronen) worden berekend op een geautomatiseerde manier.

5.Representatieve resultaten

Spike succesvolle detectie berust op een hoge signaal-ruisverhouding van de opgenomen fluorescentie somatische calcium signalen. Gewoon met behulp van hoge excitatie tarieven (hoog laservermogen) kan leiden tot een negatief effect van photoeffects op biologisch materiaal (zonbeschadigde). In geditherde random-access scanning zonbeschadigde manifesteert zich als afname van de uitgangswaarde fluorescentie en vermindert van de spike-opgeroepen calcium fluorescentie signalen. De daling in de spike opgewekte signaal kan snel leiden tot niet spikes detecteren. Er is slechts een zeer klein venster van de excitatie-intensiteit waar spike detectie van fluorescentie signalen is hoog. Op het hogere eind dit venster wordt beperkt door zonbeschadigde op het ondereinde van de fluorescentiesignalen een laag signaal-ruisverhouding. Voor corticale neuronen in acute plakjes gebruiken we laservermogen resulteert in foton tarieven van ongeveer 400,000-1,500,000 foton / s bij het opnemen van ongeveer 100 micrometer hieronder plak oppervlak. Bij gebruik van een-Affiniteit indicator - hier Oregon Green 488 BAPTA - 1 - dit signaal voldoende is om individuele pieken te detecteren. Fig. 3E toont een voorbeeld van een fluorescentiesignaal opgeslagen bij zeer lage excitatie komt een voorbeeld van een opname in het detectievenster, en een zeer hoge excitatie rate.

Vergeleken met andere technieken om neurale activiteit nemen met single-cell en enkele piek resolutie, geditherd random-access scanning kan opnemen van een groter aantal neuronen uit dezelfde bevolking, en is minder invasief bijvoorbeeld in vergelijking met tetrode / multielectrode opnames . Zo geditherde random-access scanning kan worden gebruikt om neurale activiteit opnemen van vele neuronen wederzijdse informatie gesignaleerd suprathreshold activiteit ⁶ (Fig. 4A), veranderingen van neurale activiteit in een populatie neuronen (corticale plasticiteit) meten en propagatie van suprathreshold activiteit door populaties van neuronen ¹⁴ (Fig. 4B)

alt = "Afbeelding 1" src = "/ files/ftp_upload/4052/4052fig1.jpg" />
Figuur 1. Optische ontwerp van de geditherde-random access scanning setup.

Figuur 2 Uitlijning en testen:. Distributies van fluorescentie signalen die worden opgenomen onder verschillende omstandigheden. A) No laserlicht en laag photomultiplier gain, B) bij hogere gain PMT, maar laserlicht, de verdeling breder is door de fotomultiplicator donkerstroom. C) Met de laser op en opgenomen bij hoge PMT winst. Een verschil tussen de verdelingen in getoond in B en deze verdeling zou blijken dat excitatielicht bereikt PMT detectoren. D) De verdeling van fluorescentie signalen opgenomen met hoge versterking van neuron somata. Als er geen andere geluidsbron draagt, deze verdeling komt voort uit foton shot-noise alleen.

. Jpg "/>
Figuur 3 A) Schermvullend fluorescentie beeld op te sporen en te selecteren neuron somata posities, B) Scan pad van een cyclus, C) Illustratie van de dithering principe;. Per soma (cirkel) diverse locaties zijn opgenomen voordat u de balk naar de volgende soma, D) Illustratie van de output van de twee D / A kanalen. Voor elke neuron soma wordt opgenomen fluorescentiesignaal van 4 verschillende plaatsen in elke soma (S1-S4). De locatie van elke spot wordt bepaald door de x en y-positie. De x-en y posities voor alle vlekken en alle neuronen worden verzonden naar de digitaal-analoog omzetter op een sequentiële wijze. Terwijl de bundel wordt bewogen tussen twee neuron somata, wordt geen signaal verkregen (blanco). E) Voorbeelden van fluorescentiesignalen. Merk op dat elk voorbeeld verband met een spike toont (zoals gemeten met elektrofysiologische cell-ingeschreven opname).

Figuur 4. Studeren Cortical functie met behulp van geditherde random-access scanning. A) Het meten van wederzijdse informatie gesignaleerd door populaties van neuronen. Bovenste beeld toont microfoto van een acuut hersenletsel slice en twee pipetten stimulatie in dezelfde kolom in corticale laag 4 (L4). Center grafieken tonen neurale antwoorden voor elke herhaling van een stimulus. Onderste grafiek toont wederzijdse informatie Shannon's gesignaleerd door de geregistreerde bevolking van neuronen. B) het meten voortplanting van suprathreshold spiking activiteit (signaalvoortplanting) tussen populaties van corticale neuronen. Bovenste grafiek toont proefopzet middenbeeld fluorescentie beeld toont, stippellijnen vat grenzen aangeven onderste grafiek toont gedetecteerd spikes in antwoord op elektrische stimulatie van thalamocorticale vezels (driehoeken).

Discussie

Geditherde random-access scanning detecteert indirect suprathreshold spiking activiteit van de stijging van de intracellulaire calcium somatische die bij elke piek in een neuron somata. De toename in intracellulaire calcium gedetecteerd door fluorescente kleurstoffen calcium. De beperkingen van geditherde random-access scanning zijn grotendeels uit de beperkte signaal-ruisverhouding van het calcium fluorescentiesignalen. De signaal-ruisverhouding weer beperkt door zonbeschadigde, waarvan geen gebruik van hoge excitatie ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
			Optische componenten in volgorde vanaf de laser
Titan: Sapphire Laser	Coherent Inc	Chameleon Ultra 2	Hoog vermogen aanbevolen (> 2 W bij 900 nm)
Achromatische lens f = 30 mm	Thor laboratoria	AC254-030-B	Anti-reflectie (AR) coating voor 650-1.050 nm
Achromatische lens f = 100 mm	Thor laboratoria	AC254-100-B	AR 650-1050 nm
lens f = 75 mm	Thor laboratoria	LA1608-B	AR 650-1050 nm
lens f = 175 mm	Thor laboratoria	LA1229-B	AR 650-1050 nm
Achromatische lens f = 300 mm	Thor laboratoria	AC254-300-B	AR 650-1050 nm
Achromatische lens f = 100 mm	Thor laboratoria	AC254-100-B	AR 650-1050 nm
Achromatische lens f = 100 mm	Thor laboratoria	AC254-100-B	AR 650-1050 nm
Acousto-optische deflectoren	Intraaction Corp	ATD 6510CD2
Reflecterende diffraktieraster	Newport	53-011R	100 groeven / mm voor gedelegeerd ordonnateur met 65 MHz bandbreedte en scan hoek van 45 mrad
21,6 mm Brewster prisma	Lambda Research Optics Inc	IBP21.6SF10
Gekleurd Glas	Schott	BG-39
Dichroïsche spiegel	Chroma Technology Corp	Z532RDC
Fotomultiplicator modules	Hamamatsu	H9305-03
DAC-ADC board	National Instruments	PCI-6115
Oregon Green 488 Bapta-1 AM	Invitrogen	O-6807