Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

Mohan Babu; Olga Kagan; Hongbo Guo; Jack Greenblatt; Andrew Emili

doi:10.3791/4057

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Identificatie van eiwit complexen in

48.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/4057

⸱

12 november 2012

Mohan Babu¹^,² , Olga Kagan¹ , Hongbo Guo¹ , Jack Greenblatt¹^,³ , Andrew Emili¹^,³

¹Banting and Best Department of Medical Research, Donnelly Centre, University of Toronto, ²Deparment of Biochemistry, Research and Innovation Centre, University of Regina, ³Department of Medical Genetics and Microbiology, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de bacterie Escherichia coli Die worden gebruikt voor het isoleren en stabiele multi-eiwitcomplexen karakteriseren buurt homogeniteit zelfs vanaf lage kopie-aantallen per cel.

Samenvatting

Aangezien de meeste cellulaire processen gemedieerd worden door macromoleculaire samenstellingen, de systematische identificatie van eiwit-eiwit interacties (PPI) en de identificatie van de subunit samenstelling van multi-eiwit complexen kan inzichtelijk genfuncties en het begrip van biologische systemen ^{1, 2.} Fysieke interacties in kaart worden gebracht met groot vertrouwen vialarge schaal isolatie en karakterisering van endogeen eiwit complexen die bijna fysiologische omstandigheden gebaseerd op affiniteitszuivering van chromosomaal gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM). Deze aanpak is succesvol toegepast in evolutionair verschillende organismen, waaronder gist, vliegen, wormen, zoogdiercellen, bacteriën en ^1-6. In het bijzonder hebben wij een gegenereerd carboxy-terminale peptide Sequential Affinity (SPA) dual tagging systeem affiniteit zuiveren natieve eiwitcomplexen uit gekweekte gram-negatieve Escherichia coli, met genetically-handelbaar gastheer laboratoriumstammen die zeer geschikt is voor genoom-brede onderzoeken van de fundamentele biologie en geconserveerde processen van prokaryoten ^{1, 2, 7.} De SPA-merksysteem is analoog aan de tandem affinity purification methode oorspronkelijk ontwikkeld voor gist ^{8, 9,} en bestaat uit een calmoduline-bindend peptide (CBP) gevolgd door de splitsingsplaats voor de zeer specifieke tobacco etch virus (TEV) protease en drie kopieën van de FLAG-epitoop (3x FLAG), waardoor twee opeenvolgende rondes van affiniteitsverrijking. Na cassette amplificatie worden sequentiespecifieke lineaire PCR producten coderen voor de SPA-tag en een selecteerbare marker geïntegreerd en uitgedrukt in frame als carboxyterminale fusies in een DY330 achtergrond die wordt geïnduceerd om op transiënte expressie een efficiënte heterologe bacteriofaag lambda rekombinatiestelsel ^10. Dual volgende stappen zuivering met calmoduline en anti-FLAG affiniteit beads kan de zeer selectieveen efficiënte invordering van zelfs lage abundantie heeft eiwitcomplexen van grootschalige culturen. Tandem massaspectrometrie wordt vervolgens gebruikt om de stabiel co-zuivering eiwitten te identificeren met hoge gevoeligheid (laag nanogram detectielimieten).

We beschrijven gedetailleerde stap-voor-stap procedures we vaak gebruikt voor systematische eiwit tagging, zuivering en massaspectrometrie-analyse van oplosbare eiwitcomplexen van E. coli, die kan worden opgeschaald en mogelijk aangepast aan andere bacteriële species, waaronder bepaalde opportunistische pathogenen die vatbaar zijn recombineering. De resulterende fysieke interacties kunnen onthullen vaak interessante onverwachte onderdelen en verbindingen suggereren nieuwe mechanistische links. Integratie van de PPI gegevens met alternatieve moleculaire vereniging gegevens, zoals genetische (gen-gen) interacties en genomische-context (GC) voorspellingen kan opheldering van de wereldwijde moleculaire organisatie van multi-eiwit complexen te vergemakkelijken binnen bische paden. De netwerken gegenereerd voor E. coli kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in de functionele architectuur van orthologe genproducten in andere microben die functionele annotaties op dit moment ontbreekt.