Het creëren van Defined Gasvormige omgevingen om de gevolgen van hypoxie Studie naar C. elegans

Samenvatting

Dit document beschrijft hoe u continue-stroom hypoxie kamers te gebruiken om atmosferen met bepaalde concentraties van O genereren ₂ Om biologische reacties te begrijpen van een verminderde O ₂. Dit systeem is eenvoudig te installeren en te onderhouden, en flexibel genoeg om een ​​breed scala van O passen ₂ Concentraties en modelsystemen

Samenvatting

Zuurstof is essentieel voor alle meercelligen om te overleven, met een bekende uitzondering ^1. Verminderde O ₂ beschikbaarheid (hypoxie) kan tijdens het landen van de ziekte, normale ontwikkeling of veranderingen in de omgeving ^2-5. Het begrijpen van de cellulaire signaalwegen die betrokken zijn bij de respons op hypoxie kunnen bieden nieuwe inzichten in behandelingsstrategieën voor diverse menselijke ziekten, van een beroerte tot kanker. Dit doel werd echter belemmerd, althans gedeeltelijk, door technische problemen in verband met gecontroleerde hypoxie in genetisch vatbaar modelorganismen.

De nematode Caenorhabditis elegans is bij uitstek geschikt als modelorganisme voor de studie van hypoxische respons, want het is gemakkelijk te kweken en te manipuleren genetisch. Bovendien is het mogelijk om cellulaire reacties op specifieke hypoxische O _{2-concentraties} te bestuderen zonder verstorende effect aangezien C. elegans te verkrijgen O ₂ (en andere gassen) door diffusie, in tegenstelling tot een vereenvoudigde ademhalingswegen ^6. Factoren die betrokken zijn bij de reactie op hypoxie geconserveerd zijn in C. elegans. De feitelijke reactie op hypoxie afhankelijk van de specifieke concentratie O ₂ die beschikbaar is. In C. elegans, blootstelling aan hypoxie matig een transcriptionele respons gemedieerd grotendeels door HIF-1 lokt, de hoog-geconserveerde hypoxie-induceerbare transcriptie factor ^6-9. C. elegans embryo's nodig HIF-1 om te overleven in 5,000-20,000 ppm O ₂ ^7,10 . Hypoxie is een algemene term voor "minder dan normale O _2". Normoxia (normaal O ₂₎ kunnen ook moeilijk te definiëren. Wij het ​​algemeen van mening lucht in de ruimte, dat is 210.000 ppm O ₂ te zijn normoxia. Er is echter gebleken dat C. elegans heeft een gedrags-voorkeur voor O ₂ concentraties van 5-12% (50,000-120,000 ppm O ₂₎ ^11. In larvae en volwassenen, HIF-1 werkt aan hypoxie-geïnduceerde diapauze te voorkomen bij 5.000 ppm O ₂ ^12. Echter HIF-1 geen rol spelen in de reactie op lagere concentraties O ₂ (anoxie operationele definitie <10 ppm O ₂₎ ^13. In anoxie, C. elegans aangaat een reversibele toestand van schijndood waarin alle microscopisch waarneembare activiteit staakt ^10. Het feit dat verschillende fysiologische reacties optreden in verschillende omstandigheden benadrukt het belang van het hebben van experimentele controle over de hypoxische concentratie van O _2.

Hier presenteren we een methode voor de constructie en uitvoering van het milieubeleid kamers die betrouwbare en reproduceerbare hypoxische condities te produceren met bepaalde concentraties van O _2. De voortdurende stroom methode zorgt voor een snelle evenwichtsinstelling van de kamer en verhoogt de stabiliteit van het systeem. Daarnaast is de transparantie entoegankelijkheid van de kamers geven directe visualisatie van de dieren worden blootgesteld aan hypoxie. We zien verder een effectieve methode van oogsten C. elegans monsters snel na blootstelling aan hypoxie, die nodig is om veel snel omgekeerde veranderingen die optreden in hypoxie ^10,14 nemen. Deze methode levert een fundament dat gemakkelijk kan worden aangepast voor individuele behoeften laboratorium, waaronder verschillende modelsystemen en verschillende gassen.

Protocol

1. De bouw van het milieu Chambers

1. Selecteer de kleinste redelijke hoeveelheid ruimte die nodig is voor de omvang van uw project. Kamer moet worden gemaakt van gas (O ₂₎ ondoorlatend materiaal. Pyrex kristallisatie gerechten, Anaeropack dozen, of grote gegoten acryl dozen (Ellard Instrumentation), kunnen worden gebruikt. Wij hebben gevonden dat 9 50 mm platen past in een 100 x 50 Kimex kristallisatie schotel. Glasplaten kan worden gebruikt als deksels Pyrex kristallisatie schotels.
2. Boor een gat in de geselecteerde kamer en past met een plastic mannelijke Luer de slang weerhaak fitting (Cole Parmer). Beslag kan worden beveiligd door pijp montage of met epoxy. Plaats een dergelijke inrichting aan de andere zijde van de houder mogelijk te maken gas in-en uitstromen van de kamer. Zo mogelijk te verhelpen gaten om turbulente menging te verhogen.
3. Zorg voor samengeperst gas tanks met gedefinieerde O ₂ concentraties (in balans met N ₂₎ die standaard zijn gecertificeerd voor O ₂ content of anoxische omstandigheden voor zuiver _N2 (<10 ppm O _2). Gebruik automatische omschakeling regelgevende instanties voor de langere termijn studies om te voorkomen dat het verstoren van de zuurstof in de kamers.
4. Organismale reactie op hypoxie is gebleken temperatuurafhankelijk ^15. Door de kamer in een incubator, kunnen verschillende temperaturen worden gehandhaafd. De temperatuur in een broedmachine kan zijn ongelijk en als zodanig, is het verstandig om gebruik te maken van een temperatuur datalogger om de temperatuur constant te meten in de kamer.

2. Aansluiten van de gas naar de milieu-kamer

1. Voor alle aansluitingen, gebruik maken van een achtste-inch buiten-diameter buis met elkaar verbonden door ofwel snel connectors of klemkoppelingen. Tubing moet dicht en reageert met O _2, zoals fluorethyleen propyleen (FEP) of nylon (Cole Parmer). Voor een schematische voorstelling van de setup voltooid, zie figuur 1.
2. Sluit de comingedrukt gastanks op een flow control apparaat, zoals een massastroom controller (Sierra Instruments) of rotameter (Aalborg). Controleer voordruk van de tank in de range van de debieten inrichting en de slangaansluiting inrichting. Twee-traps regelaars zijn over het algemeen gebruikt, met de tweede fase op de gewenste druk [Zie hoofdstuk drie voor het selecteren van de juiste debiet]
3. Hydrate het gas door borrelen door middel van gedestilleerd water met behulp van een gas wasfles met gefrit cilinder, dan direct in een van de fittingen op de milieu-kamer, waardoor het tweede hulpstuk open voor gas uitlaat (zie figuur 1). Voor de korte termijn studies, gas hydratatie beschermt tegen uitdroging plaat, maar de vochtigheid controle kan nodig zijn voor de lange termijn studies.
4. Dow Corning Vacuum vet kan worden gebruikt om de kamer af te dichten. Plaats gewichten op het deksel van de kamer om een ​​luchtdichte verzegeling. Om een ​​goede afdichting en voldoende stroom te bevestigen, het bezit van een kleine plas water in de palm van yonze gehandschoende hand om de uit montage op de kamer en controleer of bellen.

3. Selecteren van Flow Rate

1. Uitgaande perfecte menging is er 90% gas uitwisseling van het gasvormige atmosfeer telkens het volume van de kamer wordt vervangen (Fick zijn). Bijvoorbeeld, in 100 cc kamer met een debiet van 100 cc / min, de oorspronkelijke huis lucht in de kamer worden vervangen door 90% van het gewenste gas na 1 minuut en volledige uitwisseling asymptotisch benaderen 90% per minuut daarna.
2. Hogere debieten en kleinere containers bereikt uw gewenste zuurstofconcentratie sneller. 100 x 50 Kimex containers (400 cc), een debiet van 120 cc / min bereikt 99,9% uitwisseling in 10 minuten (3 uitwisseling). Dit debiet is geschikt voor de meeste zuurstof omstandigheden. Voor zover wij weten is er geen sprake van een systematisch onderzoek naar de manier waarop de mate van verandering van O _{2-concentratie} van invloed op de respons in C. elegans.

4. Voorbereiding van monsters voor Levensvatbaarheid Assay

1. Worms blootgesteld aan hypoxische omstandigheden vaak ontsnappen aan de oppervlakte van agar platen. Om dit te voorkomen plaats een ring palmitinezuur (10 mg / ml in ethanol) om de rand van de platen. De palmitinezuur zullen uit de oplossing ethanol verdampt, waardoor een fysieke barrière. Palmitinezuur barrières hebben geen invloed op snelheid van leg, vruchtbaarheid en levensduur in C. elegans ^16,17. Gravende niet vaker voor te komen in hypoxische omstandigheden, zo extra preventieve maatregelen in het algemeen niet nodig.
2. 1. Genereer gesynchroniseerd populaties door het bleken zwangere volwassenen in een klein druppeltje bleekwater alkalische oplossing op ongeplaatste nematode groei van media (NGM) platen ^18. In tegenstelling tot standaard grote batch hypochlorietbleken protocollen pak 1-100 dieren in een druppel bleekwateroplossing op het oppervlak van een NGM plaat, dan kan de oplossing bleek te absorberen in de plaat ^{18. Na ten minste 12 uur, over te dragen de gesynchroniseerde L1 larven platen bezaaid met live-OP50 bacteriën. Als alternatief kan men toelaten zwangere volwassenen om eieren te leggen op de plaat gedurende 2-3 uur aan een groep van wormen die synchroon zal ontwikkelen of kies L4 larven van een gemengde populatie te genereren.}
   2. Vermijd blootstelling van gebleekt embryo's aan hypoxie, want dit kan levensvatbaarheid ¹³ te verminderen. Om jonge embryo's (2-4 cellen) te verzamelen, kunnen zwangere volwassenen worden gehakt in een klein volume water met een scheermesje en embryo's verplaatst naar platen via de mond pipet voor latere blootstelling aan hypoxie.
3. Seal-platen in de klimaatkamer. Controle dieren worden gehouden in normoxia (huis lucht) op dezelfde temperatuur als behandeld wormen. Er is geen waarneembaar verschil tussen monsters meer in huis lucht die onderhouden dezelfde kamer met huis lucht die over zijn. Start gasstroom en onderhouden van blootstelling voor de gewenste tijd. Om uniformiteit in de helling te garanderen, moet uvervangen water in het gas wasfles voor de belichting.
4. Om test overleving van embryo's, zodat de wormen gedurende 48 uur te ontwikkelen na de terugkeer naar de kamer van de lucht, op welk punt zij de vierde stadium larven / dag een volwassenen. Score om te overleven, censureren alle wormen die niet kunnen worden verantwoord.
5. Om dieren blootgesteld aan hypoxie te visualiseren, te verplaatsen wormen tot een daling van de M9 op een 22 mm ² dekglaasje en omkeren op een pad van 2% agarose in M9 ^18. Indien nodig levamisool (25 mM) en natriumazide (10 mM) kan worden gebruikt als verdoving. Natriumazide en levamisol kunnen beïnvloeden enkele opmerkingen in verband met toxiciteit en moet oordeelkundig worden gebruikt ^19.

5. Snelle Oogst van hypoxie-blootgestelde Worms (Voorbeeld: Voorbereiding van monsters voor HIF-1 West-analyse)

Veel hypoxie-geïnduceerde effecten zijn snel omgekeerd bij terugkeer naar de kamer van de lucht, met inbegrip van de hervatting van de productie van eieren ^12, fosforylering van mitotische epitopenin embryogenese ¹³ en afbraak van het HIF-1 eiwit ^9,20. Rapid isolatie van dieren blootgesteld aan hypoxie moet reproduceerbaar te bekomen bij deze voorwaarden. Met deze opzet kunnen dieren worden geoogst en ingevroren in vloeibare stikstof in minder dan twee minuten. Terwijl handschoenenkastje hypoxie kamers geven voor manipulatie van de monsters in zuurstofloze omstandigheden, de kosten en uitvoerbaarheid van andere omstandigheden dan anoxie beperken hun nut.

1. Grow Bristol N2 wormen op 4 10 cm hoge groei (HG) platen tot een meerderheid van de wormen zijn zwangere volwassenen van ^18. Was wormen 15 ml conische buis met een 1:5 alkalische bleekwateroplossing en geïncubeerd met de rotatie tot wormen beginnen op te lossen niet meer dan 5 minuten ^9. Was de wormen drie keer met de M9, af te draaien bij 1500 xg tussen elke wasbeurt zonder remmen.
2. Plaat gebleekt embryo op 8 150 mm NGM platen en laat ontwikkelen L4 larven (~ 48 uur Bristol N2 bij 22 ° C).Beweeg platen klimaatkamers en blootstellen aan hypoxische (1000 ppm, 5000 ppm) en anoxische (N2) voorwaarden gedurende 4 uur. De belichtingstijden variëren afhankelijk van de opzet van het experiment. Hoewel blootstelling aan hypoxie heeft een direct effect op de snelheid van de eileg, twee cellen embryo's sterven na 16-18 uur van de blootstelling aan ^12. Met deze hypoxie kamer configuratie, zijn de ondergrens van de blootstelling beperkt door de snelheid van de atmosfeer uitwisseling nodig is om evenwicht te bereiken.
3. Label een 1,5 mL microfugebuis en een 15 ml conische buis voor elke experimentele monster. Worms blootgesteld aan hypoxie hebben meer kans om aan de zijkanten van de buis plakken tijdens het oogsten. Om dit te voorkomen plaats 100 pi 1% natriumdodecylsulfaat (SDS) in elk 15 ml conische buis. Als SDS remt afgeleide toepassingen, runderserum albumine (BSA) gebruikt kan worden om plakken te voorkomen. Routinematig gebruik van SDS of BSA lijkt niet om een ​​duidelijk verschil te hebben. Voeg 50 pi 2x eiwit lading kleurstof (4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol ensporen broomfenolblauw in 30% glycerol (w / v)) aan de 1,5 mL microfugebuis. Heb een Dewar van vloeibare stikstof klaar.
4. De tijd van de stappen na het verwijderen van de wormen van hypoxie en record. Verwijder het deksel aan de hypoxische kamer, neem een ​​monster plaat, en sluit de kamer. Gebruik gedestilleerd water om de wormen te wassen op een nylon filter en vervolgens in de 15 ml conische buis gieten. Draai de wormen in een desktop-centrifuge bij 1500 xg gedurende 15-20 seconden met rem.
5. Gebruik vacuüm meeste supernatant uit de buis, waarbij de worm pellet onaangeroerd.
6. Met behulp van een pipet, verplaatst u de worm pellet in 50 ul van de 1,5 ml microfugebuis. Sluit de buis en ondergedompeld in vloeibare stikstof.
7. Herhaal dit tot alle monsters zijn geïsoleerd. Volg deze procedures voor het huis de lucht controlemonsters voor de consistentie. Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.

6. Representatieve resultaten

Organismale van hypoxie te ziendoor onderzoek van de mogelijkheden met betrekking tot de volwassenheid van C. elegans (figuur 2). Embryo's gelegd door wild-type Bristol (N2) en HIF-1 (ia04) deletiemutanten zijn allemaal te overleven in het huis van de lucht O _{2-concentratie} (210.000 ppm O _2). N ₂ wormen zijn in staat aan te passen en tot volwassenheid te overleven in 5.000 ppm O _2, terwijl de HIF-1 embryo's niet levensvatbaar zijn. Hieruit blijkt dat HIF-1 is essentieel voor aanpassing aan de veranderende hoeveelheid zuurstof in de omgeving ^10. Noch N2 of HIF-1 dieren overleven blootstelling aan 1000 ppm O _2.

Visualiseren worm direct hypoxie is mogelijk met het gebruik van een ontleding strekking duidelijk container (figuur 3). Door direct plaatsen van de hypoxie kamer op de snijkamer toepassingsgebied is er geen noodzaak om de wormen uit hypoxie tot organismale reacties te observeren. De omvang kunnen worden voorzien fluorescentie illumation (zoals in figuur 3 ), verdere uitbreiding van de soorten van de waarnemingen bij hypoxie die mogelijk zijn.

Figuur 1. Voorbeeld Hypoxie kamer. Richting van de gasstroom wordt aangegeven door pijlen. Gas wordt opgeslagen in tanks samengeperst gas met vaste O ₂ concentraties (1) en een twee trap is bevestigd (2). Gas komt de bodem van de meetbuis (3), die uit de top van de juiste debiet. Gas stroomt in de ballon vat (4), hydraterende het gas (correcte aansluiting van bel door te kijken kolf belletjes). Gehydrateerd gas stroomt vervolgens in de kamer hypoxie in de instroom klep (5), waardoor de monsters hypoxie. Het gas uiteindelijk openingen in de ruimte door middel van een uitlaat gat geboord in de kamer.

Figuur 2. Levensvatbaarheid van embryo's worden blootgesteld aan 1.000 ppm O _2, 5000 ppm O _{2 normoxia (~ 210000 ppm O 2). Embryo's werden blootgesteld aan zuurstofgehalte als embryo gedurende 24 uur continue stroom zuurstof kamers. Worms werden verplaatst naar normoxische voorwaarden, toegestaan ​​om naar de volwassenheid te ontwikkelen voor 48 uur, en scoorde voor de levensvatbaarheid naar volwassenheid. n> 50 N = 5.}

Figuur 3. Visualisatie van C. elegans in hypoxie met microscopie. Worms worden blootgesteld aan hypoxie met behulp van de geschetste methoden. De transparante milieu-kamer (gebouwd met een pyrex kristallisatie schotel en glazen plaat) wordt direct geplaatst op het podium van een dissectie scope. Twee visies worden getoond, waarvan een inclusief de gehele gasstroom opgezet, de andere met alleen de kamer op de microscoop podium.

Discussie

Deze methode een strategie voor het construeren een hypoxische omgeving waarin voor omgevingen nauwkeurige zuurstofconcentraties worden gehandhaafd in het laboratorium. Deze kamers een eenvoudige werkwijze voor het belichten organismen specifieke lage concentraties O ₂ en controle van de moleculaire en fysiologische uitgangen. De beschreven klimaatkamer wordt samengesteld door het laboratorium plaats van commercieel gekocht en kan dus worden aangepast aan de behoeften van het experiment te passen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer
Slangen (FEP en PTFE)	Cole Parmer Tygon	YO-95821-00 (1/8 "FEP) 06.605-27 (1/16 x 1/8 "PTFE) R-3603
Klemkoppelingen	Seattle Fluid Systems	06.363-58 (M. koppeling 1/16 ") 06363-62 (F. koppeling 1/16 ") 06363-60 (M. koppeling 1/8 ") 06363-61 (F. koppeling 1/8 ")
Flow buis	Aalborg	PMR3-010073 (3 uitgang) PMR1-013520 (1 uitgang)
Massastroomregelaar	Sierra Instruments	810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2)
Samengeperst gas tank	Airgas	Gemaakt om te bestellen
Plastic mannelijke Luer van slang barb fittingen	Cole Parmer	45.505-41 (500 serie 1/16 ")
Gegoten acryl dozen	Ellard Instrumentatie	Gemaakt om te bestellen
Buisleidingen (messing of roestvrij staal)	Seattle Fluid Systems	B-402-1 (1/4 "moer) B-200-3 (1/8 "vakbond T-stuk) B-400-set (1/4 "ferrules) B-QM2-B1-200 (QM Body QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 "male conn)
Dow Corning Vacuum Grease	Sigma-Aldrich	Z273554
AnaeroPack box	Misubishi Gas Chemical Company	R684004 (0,4 liter) R685025 (2,5 liter) R685070 (7,0 liter)
Pyrex gas spuitfles	Sigma-Aldrich	CLS31770500C (500 ml) CLS31770250C (250 ml) CLS31770125C (125 ml)
Palmitinezuur	Sigma-Aldrich	P0500
Geit anti-muis IgG-mierikswortelperoxidase	Southern Biotechnology Associates	1032-1005
SuperSignal West Pico Chemiluminsecent ondergrond	Pierce Chemical	34077
100 x 50 glas kristallisatie gerechten	Kimax Kimble	23000