Methodenartikel

C. elegans Tracking en Behavioral Measurement

DOI:

10.3791/4094

⸱

17 november 2012

 ,  ,  , 
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Physics and Astronomy, Vrije Universiteit, 3Okinawa Institute of Science and Technology, 4Department of Physics, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een video-rate volgen microscoop systeem dat kan opnemen en te kwantificeren C. elegans Gedrag met een hoge resolutie en hoge snelheden. We hebben ook computationele methoden om de dimensionaliteit van de worm beelden naar een fundamentele set metingen die volledig beschrijven van de vorm van de worm te verminderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben instrumentatie, beeldverwerking en data-analyse technieken om de motorische gedrag van C. kwantificeren elegans zoals kruipt op het oppervlak van een agarplaat. Voor de studie van de genetische, biochemische en neuronale basis van gedrag, C. elegans is een ideale organisme, omdat het genetisch handelbaar, vatbaar is voor microscopie, en toont een aantal complexe gedragingen, inclusief taxi's, leren, en sociale interactie 1,2. Gedragsanalyse gebaseerd op volgen van de bewegingen van wormen als ze kruipen op agarplaten zijn bijzonder nuttig in de studie van sensorische gedrag 3, 4 motoriek en algemene mutatie fenotypering 5. Het systeem werkt door de camera en Belichtingssysteem de wormen kruipt over een stationaire agar plaat, die garandeert dat er geen mechanische stimulus wordt doorgegeven aan de worm. Ons volgsysteem is gemakkelijk te gebruiken en omvat een semi-automatische kalibratie. Een challenge van video tracking systemen is dat het een enorme hoeveelheid gegevens die intrinsiek hoge dimensionele genereert. De beeldverwerking en programma's voor gegevensanalyse gaan met dit probleem doordat de wormen vorm in een set van onafhankelijke componenten, die volledig de wormen gedrag reconstrueren als functie van slechts 3-4 afmetingen 6,7. Als voorbeeld van de werkwijze aangetoond dat het worm binnenkomt en verlaat de omkering toestand in een fase specifieke wijze.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Beschrijving van Tracking Microscoop

  1. Een agar plaat wordt verlicht door een lichtbron en vezel belicht met een camera. Dit systeem is gemonteerd op een X, Y translatietafel.
  2. De etappe wordt door standaard stappenmotoren, die zijn verbonden met een stappenmotor controller.
  3. De controller en de camera zijn aangesloten op de computer en gecontroleerd door aangepaste programma's geschreven in LabVIEW.
  4. De camerabeelden het oppervlak van een agar plaat en identificeert donkere objecten op een lichte achtergrond.
  5. De beeldkwaliteit wordt aangepast, zodat computerprogramma kan objecten kwantificeren in real time. De versterking, helderheid en sluitertijd van de camera kan worden aangepast aan een donker object op een witte achtergrond verschaffen.
  6. Een maatstreep voor de automatische kalibratie wordt gemaakt door porren de agar oppervlak met een worm pick.
  7. De gefilterde, binair beeld dat wordt gebruikt door het volgen programma kan worden gecontroleerd.
  8. De zoftware heeft een auto-calibratie functie die de kalibratie matrix berekent door het bewegen van een testobject een vaste afstand.
  9. Afstanden in pixels gekalibreerd is om stappen van de stappenmotor van de kalibratie matrix.
  10. Na de kalibratie van het systeem is klaar en hoeft niet te worden geijkt indien de vergroting gewijzigd of indien de camera wordt verplaatst.

2. Voorbereiden Tracking Platen en C. elegans voor Tracking

  1. Een koperen ring gebruikt om de wormen corral achter blijven en migreren naar de rand van de plaat. Het koper in een lokale chemische barrière en niet om anderszins invloed beweging van de worm voor de duur van het experiment (<1 uur). Verwarm de ring eerst door het op een warmteblok of gelijkwaardig.
  2. Ring plaats op een verse agar plaat (1,7% Bacto Agar, 0,25% Bacto-pepton, 0,3% NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM kaliumfosfaat buffer, 5 ug / mlcholesterol) en iets naar beneden drukken om het in te bedden in de agar oppervlak.
  3. Extra L4 stadium of jonge volwassen wormen op een agar plaat gevuld met een NGM buffer (0,3% NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM kaliumfosfaatbuffer) te wassen voedselresten. Laat de wormen zwemmen voor een paar minuten.
  4. Voorzichtig plaats een enkel worm op de tracking plaat in het midden van de ring. En plaats de plaat op de worm tracker.

3. Worm Tracking

  1. Voer het LabVIEW-programma en selecteer de opties indien nodig (locatie voor afbeeldingen, soorten beelden, metingen, camera-instellingen).
  2. Met behulp van de joystick de microscoop te verplaatsen totdat er een beeld van de worm is in het gezichtsveld (computerscherm). Druk op "track" om de tracking-programma in te schakelen.
  3. Het computerprogramma meet in feite de bewegingen van een binaire gefilterde zoals afgebeeld en kan metingen op het beeld om in real time
  4. Achteruiter volgen een reconstructie van de globale traject kan worden gemaakt van de stappenmotor bewegingen en de plaatselijke vormveranderingen van de worm te zien in detail.

4. Data-analyse

  1. Run skeletvorming script (MATLAB) om de worm vormen parametriseren. (Figuur 2)
  2. Bereken eigenmodes van de skelet gevormde gegevens. (Figuur 3,4)
  3. Toon Figuur 5. Lees figuur legende of representatieve resultaten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voorbeeld: Wanneer foerageren, C. elegans overgangen van vooruit naar achteruit beweging, vaak het uitvoeren van een heroriëntatie (omega beurt) voordat u terugkeert naar de voorwaartse beweging staat. Kwantificeren overgang belangrijk voor het begrijpen het scharrelen bewegingspatronen en in de worm motorbesturing. De bevoegdheid om subtiele details van de motoriek gedrag laten zien is te zien met behulp van onze tracker apparaat.

Als voorbeeld kijken we naar de vooruit naar achter...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie van de motoriek en natuurlijk gedrag vereist niet-invasieve tracking technieken in de partnerlanden met datareductie technieken. Hier hebben we aangetoond een makkelijk te volgen systeem dat gedetailleerde beelden van C. registreert gebruiken elegans gedrag kruipt op het oppervlak van een agarplaat. De hoeveelheid informatie in deze beelden is groot en hoog-dimensionale, en daarom hebben we ook methoden ontwikkeld om de dimensionaliteit van de data te reduceren tot slechts vier fundamentele m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het onderdeel Vennootschap Catalogusnummer Opmerkingen (optioneel)
CCD camera Basler A601f
Lens Edmund Optics MMS-serie
Fiber Verlichting Dolan Jenner DC-950H
Vertaling fase Deltron LS3-4
Stepper Motor Amerikaanse digitale MS23C
Stappenmotor aandrijving Gekko G201
Stappenmotor controle SimpleStep SSXYZ
Alle programmering code is beschikbaar. Stuur een verzoek e-mail naar de desbetreffende auteur.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-79 (1974).
  2. de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
  3. Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J. Neurosci. 19 (21), 9557-9569 (1999).
  4. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (9), 3184-3191 (2005).
  5. Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively. J. Neurosci. Methods. 118 (1), 9-21 (2002).
  6. Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans. PLoS Comput. Biol. 4 (1), e1000028(2008).
  7. Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. From modes to movement in the behavior of C. elegans. PLoS One. 5 (11), e13914(2010).
  8. Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. (5), 115(2004).
  9. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes. PLoS One. 3 (5), e2208(2008).
  10. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  11. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
  12. Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
  13. Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans. J Neurosci Methods. 187 (2), 229-234 (2010).
  14. Wittenburg, N., Baumeister, R. Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (18), 10477-10482 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

C elegans TrackingWorm TrackerImage ProcessingData AnalysisAgar PlateStepper MotorLabVIEW SoftwareEigen Mode AnalysisBehavioral MeasurementDimensionality Reduction

Gerelateerde artikelen