Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

High Throughput Single-cel en Multiple-cel Micro-encapsulatie

18K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/4096

⸱

15 juni 2012

 , 
1Department of Mechanical Engineering, Vanderbilt University

In dit artikel

Samenvatting

De combinatie van monodisperse druppel generatie met traagheid ordening van cellen en deeltjes, beschrijven we een methode om een ​​gewenst aantal cellen of deeltjes in te kapselen in een enkele druppel op kHz tarieven. We laten zien efficiëntie twee maal groter dan die van niet-geordende inkapseling voor enkel-en dubbel-deeltje druppels.

Samenvatting

Microfluïdische encapsulatiemethoden zijn eerder gebruikt om cellen te vangen in monodisperse waterige druppels op picoliterschaal, waardoor ze worden afgescheiden van een bulkvloeistofomgeving voor toepassingen in high-throughput screening, cytometrie en massaspectrometrie. Wij beschrijven een methode om niet alleen enkelvoudige cellen te encapsuleren, maar om herhaaldelijk een vast aantal cellen te vangen (hier demonstreren we encapsulatie van één en twee cellen) om zowel de isolatie als de interacties tussen cellen in groepen van gecontroleerde grootte te bestuderen. Door druppelgeneratietechnieken te combineren met de ordening van cellen en deeltjes, demonstreren we gecontroleerde encapsulatie van deeltjes ter grootte van cellen voor efficiënte, continue encapsulatie. Met behulp van een waterige deeltjessuspensie en immiscibele fluoroololie genereren we waterige druppels in olie met een flow-focusing-nozzle. De waterige stroomsnelheid is voldoende hoog om een ordening van deeltjes te creëren die de nozzle bereiken met frequenties die gehele veelvouden zijn van de druppelgeneratiefrequentie, waardoor een gecontroleerd aantal cellen in elke druppel wordt ingekapseld. Voor representatieve resultaten worden polystyreen-deeltjes van 9,9 μm als celvervangers gebruikt. Deze studie laat een encapsulatie-efficiëntie voor enkelvoudige deeltjes Pk=1 van 83,7% en een encapsulatie-efficiëntie voor dubbele deeltjes Pk=2 van 79,5% zien, vergeleken met hun respectievelijke Poisson-efficiënties van 39,3% en 33,3%. Het effect van een consistente cel- en deeltjesconcentratie blijkt van groot belang te zijn voor een efficiënte encapsulatie, en overgangen van dripping naar jetting worden eveneens behandeld.

Inleiding

Continue waterige celsuspensies in media delen een gemeenschappelijke vloeistofomgeving, waardoor cellen parallel kunnen interageren en de effecten van specifieke cellen in metingen uit het medium worden gehomogeniseerd. High-throughput inkapseling van cellen in druppels op picoliter-schaal beperkt de monsters, waardoor druppels worden beschermd tegen kruiscontaminatie, een maat voor cellulaire diversiteit binnen monsters mogelijk wordt gemaakt, verdunning van reagentia en tot expressie gekomen biomarkers wordt voorkomen, en signalen van bioreactorproducten worden versterkt. Druppels bieden daarnaast de mogelijkheid om druppels weer samen te voegen tot grotere waterige monsters of met andere druppels voor studies naar intercellulaire signalering.1,2 De vermindering van verdunning impliceert sterkere detectiesignalen voor nauwkeurigere metingen, evenals de mogelijkheid om potentieel kostbare monster- en reagensvolumes te verminderen.3 Inkapseling van cellen in druppels is gebruikt om de detectie van eiwitexpressie,4 antilichamen,5,6 enzymen,7 en metabole activiteit8 voor high-throughput screening te verbeteren, en zou kunnen worden gebruikt om high-throughput cytometrie te verbeteren.9 Aanvullende studies presenteren toepassingen in bio-electrospraying van celbevattende druppels voor massaspectrometrie10 en gerichte oppervlaktecoatings van cellen.11 Sommige toepassingen zijn echter beperkt door het gebrek aan controle over het aantal cellen dat in de druppels wordt ingekapseld. Hier presenteren wij een methode van geordende inkapseling12 die de aangetoonde inkapselingsefficiënties voor één en twee cellen verhoogt en kan worden geëxtrapoleerd voor de inkapseling van een groter aantal cellen.

Om monodisperse druppelgeneratie te bereiken, maakt microfluïdische "flow focusing" de creatie mogelijk van druppels met een controleerbare grootte van één vloeistof (een waterig celmengsel) binnen een andere (een continue oliefase) door gebruik te maken van een nozzle waar de stromen samenkomen.13 Voor een gegeven nozzlegeometrie kunnen de druppelgeneratiefrequentie f en de druppelgrootte worden aangepast door de olie- en waterige stroomsnelheden Qoil en Qaq te variëren. Naarmate de stroomsnelheden toenemen, kunnen de stromen overgaan van druppelgeneratie naar onstabiele jetting van de waterige vloeistof vanuit de nozzle.14

Wanneer de waterige oplossing gesuspendeerde deeltjes bevat, worden deeltjes bij de nozzle ingekapseld en van elkaar geïsoleerd. Voor de generatie van druppels met gebruik van een willekeurig verdeelde waterige celsuspensie wordt de gemiddelde fractie druppels Dk die k cellen bevatten bepaald door de Poisson-statistiek, waarbij Dk = λk exp(-λ)/(k!) en λ het gemiddelde aantal cellen per druppel is. De fractie cellen die in "correct" ingekapselde druppels terechtkomen, wordt berekend met Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk'). Het subtiele verschil tussen deze twee metrieken is dat Dk betrekking heeft op de benutting van de waterige vloeistof en de hoeveelheid druppelsortering die na de inkapseling moet worden uitgevoerd, terwijl Pk betrekking heeft op de benutting van het cellenmonster. Als voorbeeld zou men een verdunde celsuspensie (lage λ) kunnen gebruiken om druppels in te kapselen waarbij de meeste druppels die cellen bevatten slechts één cel zouden bevatten. Hoewel de efficiëntiemetriek Pk hoog zou zijn, zou de meerderheid van de druppels leeg zijn (lage Dk), waardoor een sorteermechanisme nodig is om lege druppels te verwijderen, wat tevens de doorvoer vermindert.15

Door druppelgeneratie te combineren met inertiële ordening is het mogelijk om druppels te encapsuleren met voorspelbaardere aantallen cellen per druppel en hogere doorvoersnelheden dan bij willekeurige encapsulering. Inertiële focusering werd voor het eerst ontdekt door Segre en Silberberg16 en verwijst naar de neiging van deeltjes met een eindige grootte om naar laterale evenwichtsposities in een kanaalstroom te migreren. Inertiële ordening verwijst naar de neiging van deeltjes en cellen om zich passief te organiseren in gelijkmatig verdeelde, versprongen treinen met een constante snelheid. Zowel focusering als ordening vereisen voldoende hoge stroomsnelheden (hoog Reynoldsgetal) en deeltjesgroottes (hoog deeltjes-Reynoldsgetal).17,18 Hierbij is het Reynoldsgetal Re =uDh/ν en het deeltjes-Reynoldsgetal Rep =Re(a/Dh)2, waarbij u een karakteristieke stroomsnelheid is, Dh [=2wh/(w+h)] de hydraulische diameter is, ν de kinematische viscositeit is, a de deeltesdiameter is, w de kanaalbreedte is en h de kanaalhoogte is. Empirisch gezien neemt de lengte die nodig is om volledig geordende treinen te bereiken af naarmate Re en Rep toenemen. Let op dat de hoge Re- en Rep-vereisten (voor deze studie respectievelijk in de orde van 5 en 0,5) in conflict kunnen zijn met de noodzaak om de waterige stroomsnelheden laag te houden om jetting bij de druppelgeneratie-nozzle te voorkomen. Daarnaast leiden hoge stroomsnelheden tot hogere schuifspanningen op de cellen, wat in dit protocol niet wordt behandeld. De eerdere studie naar geordende encapsulering toonde aan dat meer dan 90% van de enkelvoudig geencapsuleerde HL60-cellen onder vergelijkbare stroomcondities als in deze studie de integriteit van het celmembraan behield.12 Het effect van de grootte en de tijdschalen van schuifspanningen moet echter zorgvuldig worden overwogen bij extrapolatie naar verschillende celtypen en stroomparameters. De overlap van de beperkingen voor de waterige stroomsnelheid met betrekking tot celordening, druppelgeneratie en celviabiliteit biedt een ideaal operationeel regime voor gecontroleerde encapsulering van enkelvoudige en meervoudige cellen.

Omdat zeer weinig studies ingaan op de onderlinge afstand tussen partikeltreinen,19,20 wordt deze afstand het gemakkelijkst empirisch bepaald en is deze afhankelijk van de kanaalgeometrie, de stroomsnelheid, de partikelgrootte en de partikelconcentratie. Desondanks impliceert de gelijke laterale afstand tussen de treinen dat cellen aankomen in voorspelbare, consistente tijdsintervallen. Wanneer druppelgeneratie plaatsvindt met dezelfde snelheid als waarmee de geordende cellen bij de spuitmond aankomen, worden de cellen op een gecontroleerde manier in de druppel ingekapseld. Deze techniek is gebruikt om enkelvoudige cellen in te kapselen met doorvoersnelheden van ongeveer 15 kHz,12 een aanzienlijke verbetering ten opzichte van eerdere studies die inkapselsnelheden rapporteerden van ongeveer 60-160 Hz.4,15 In het werk over gecontroleerde inkapseling bevatte meer dan 80% van de druppels één en slechts één cel, een aanzienlijke efficiëntieverbetering ten opzichte van Poisson-statistieken (willekeurig), die gemiddeld een efficiëntie van minder dan 40% voorspellen.12

In eerder gecontroleerd inkapselingswerk,12 werd het gemiddelde aantal deeltjes per druppel λ afgestemd om inkapseling van enkele cellen te bewerkstelligen. Wij stellen dat we door het afstemmen van de stroomsnelheden efficiënt elk gewenst aantal cellen per druppel kunnen inkapselen wanneer λ gelijk is aan of dicht bij het gewenste aantal cellen per druppel ligt. Hoewel inkapseling van enkele cellen waardevol is bij het bepalen van individuele celresponsen op stimuli, verschaft inkapseling van meerdere cellen informatie over de interactie tussen gecontroleerde aantallen en typen cellen. Hier presenteren we een protocol, representatieve resultaten met behulp van polystyreen microsferen en een discussie over de gecontroleerde inkapseling van meerdere cellen met behulp van een passief inertieel ordningskanaal en een spuitmond voor druppelgeneratie.

Protocol

De protocollen in dit hoofdstuk beschrijven de materialen en uitrusting die specifiek gebruikt om de gepresenteerde experimentele resultaten te verkrijgen. Merk op dat alternatieve leveranciers van chemicaliën en apparatuur kan worden gebruikt.

1. Apparaat Fabricage en zachte lithografie

Standaard zachte lithografie technieken, 21 waarvan een aantal zijn gekenmerkt in voorgaande Jove artikelen, werden 22 gebruikt voor het maken polydimethylsiloxaan (PDMS) microkanaal netwerken gebonden aan glas substraten. Naast meester replica schimmel fabricage door SU-8 fotolithografie, kunnen de processen worden uitgevoerd buiten een schone kamer of schone kap, maar stof en deeltjes moet nog steeds worden geminimaliseerd om consistente resultaten te bereiken.

  1. Ontwerp een micro-kanaalraster zoals getoond in figuur 1 AutoCAD (AutoDesk Inc.) Door een derde fabrikant (Fineline Imaging Inc) naar een hoge resolutie (50.000 dpi) trans af te drukkentransparantie masker op Mylar-film of kwarts, waar kanalen zijn transparant op een donkere achtergrond.
  2. Maak een silicium en SU-8 fotolak master voor replica gieten. Kort draaien SU-8 2050 (Microchem) negatieve fotolak met fabrikant aanbevolen rpm op een spin-coater een 52 pm dikke laag op een schone 7,5 cm of 10 cm siliciumplak maken. Na de zachte bakken, rand kraal verwijderen, UV-blootstelling via een contact masker, na blootstelling bakken, ontwikkeling en vloed blootstelling, het meten van de werkelijke dikte van de SU-8 lagen met behulp van een Dektak profilometer (Veeco). Tape de matrijs op de bodem van een 4 "en 5" petrischaal voorbereiding van PDMS replica vormen.
  3. Mix PDMS elastomeer basis met elastomeer verharder (Dow Corning) in een verhouding 10:01 w / w basis voor verharder. Giet goed gemengde PDMS voorloper op het silicium master naar een 2-3 mm uiteindelijke dikte laag te maken. Een mengsel van 20 g elastomeer basis met 2 g hardingsmiddel voldoende 4 "diameter oppervlak.
  4. Plaats de master schimmel en PDMS in vacuüm exsiccator (Jencons) naar de-gas van de niet-uitgeharde PDMS. Met behulp van een drukregelaar (Cole Parmer), langzaam afnemen de kamer gage druk van 0 "Hg tot -27" Hg meer dan 20 minuten om overmatige schuimvorming te voorkomen. Laat het apparaat in de vacuümkamer bij -27 "Hg gedurende 30 minuten of totdat de luchtbellen verdwijnen.
  5. Laat vacuüm en bewegen meester schimmels en PDMS op een 65 ° C oven (Thermo Scientific) voor een minimum van vier uur. De inrichting kan blijven de oven gedurende de nacht uitharding te verbeteren.
  6. Verwijder het apparaat uit de oven en laat het afkoelen. Knip voorzichtig PDMS rond ronde wafer met een precisie mes en schil uit PDMS. Snij inrichting omtrek zoals weergegeven in figuur 1 met een scalpel.
  7. Punch vloeibare poorten (drie per apparaat) in de drie gebieden ronde figuur 1 met een biopsie punch. Voor dit apparaat, gebruik maken van een 0,75 mm buitendiameter punch (Harris).
  8. Houd scotch tape om de bedrukte zijde van de PDMS en de schil aan een te verwijderenstof. Als een kostenbesparend, maar levensvatbaar alternatief voor de conventionele zuurstof plasma-apparaten, 21,22 plasma behandeling van de bedrukte zijde van de PDMS en een schone 3 "x 1" glas microscoopglaasje met behulp van een hand-held laboratorium corona treater (Electro-Technic Products Inc .). 23 Merk op dat dit apparaat gebruikt moet worden in een zuurkast of een goed geventileerde ruimte te wijten aan ozon ontslag, en alle horloges en mobiele telefoons moeten minstens tien meter afstand worden gehouden. Pas de corona-ontlading tot een stabiele corona te bereiken met een minimum aan vonken. Langzaam zwaaien de elektrode ongeveer 1/4 "boven elk oppervlak ongeveer 20 seconden en onmiddellijk de behandelde oppervlakken in contact brengen van een sterke permanente hechting vormen voor het PDMS oppervlakken naar hun natieve toestand.
  9. Plaats het apparaat op een metalen plaat, plaats op een koele oven, zet de oven voor op 120 ° C, en bak 's nachts om de hechting te voltooien en het PDMS terugkeren naar zijn oorspronkelijke hydrofobe toestand. 24 Tijdens deze hoge temperatuur bakken, thij glas van het kanaal worden gehydrofobeerd door depositie van een dunne hydrofobe laagje op het glas. Als alternatief kan hydrofobe coatings zoals Aquapel (PPG Industries) worden geïnjecteerd in de vloeibare-poorten met een 1 ml spuit en een injectienaald. 12 voorzichtig maar stevig injecteer de Aquapel gevolgd door zuivering lucht in de vloeibare havens zonder het breken van de PDMS om glas bond . Agressief herhaal de ontluchter op alle in-en uitlaat-poorten, terwijl het afvegen overtollige Aquapel om alle deposito's die zouden kunnen verstoppen en de kanalen op het drogen te voorkomen.

2. Monstervoorbereiding

  1. Maak een celkweek volgens vaste procedures voor het door u gekozen celtype. Voor het specifieke apparaat dat wordt gebruikt in dit onderzoek, dient 8-15 micrometer deeltjes of cellen adequaat te bestellen voor inkapseling. Kleiner of groter celtypen kan een wijziging van de afmetingen van de focussering kanaal voldoende Re p bereiken. Voor het meThOD demonstratie resultaten zijn weergegeven in dit document wordt onder 9,9 micrometer polystyreen microsferen (G1000, Thermo Scientific) gebruikt als cel surrogaten.
  2. Bereid de waterige deeltje of celsuspensie door middel van voorzichtig mengen. Bij gebruik cellen of polystyreen deeltjes concentratie in essentieel (zie figuur 4) te bereiken ideale volgorde inkapseling. Met behulp van eerdere gegevens 12 als een gids, de berekening van de gewenste cel of deeltjesconcentratie op basis van de bestelde treinen afstand en micro-kanaals formaat als: een cel of deeltje per verwachte lengte trein afstand keer de nadruk kanaal doorsnede. Als de voorraad concentratie (1% w / w) onvoldoende is, verhogen de concentratie (hier tot 1,5% w / w) door voorzichtig centrifugeren van het stock sample, het verwijderen van bovendrijvende vloeistof, en opnieuw schorsing van de deeltjes door vortex mengen, of zachter mengen bij gebruik cellen. Bereid een voldoende volume om rekening te houden voor de gewenste collectie volume en voor de werktijd in verband met flow tuning.
  3. Zowel cellen en polystyreen deeltjes een soortelijk gewicht groter dan een. Hoewel niet aangetoond in dit protocol, voor de lange termijn experimenten duren in de orde van vele minuten tot uren, drijfvermogen overeenkomen met de oplossing door het toevoegen van een opgeloste stof, zoals CaCl 2 voor deeltjes of OptiPrep (Sigma-Aldrich) voor de cellen.
  4. Bereid een 10 ml monster van de continue fluorkoolstof oliefase door vermenging van de fluorkoolwaterstof olie FC-40 (3M) en PFPE-PEG blokcopolymeer oppervlakteactieve 25 (2,5% w / w) (Raindance Technologies) in een 15 ml centrifugebuis. Als alternatief kan lichte minerale olie (PTI Werkwijze Chemicals) worden gebruikt met ABIL-EM 90 oppervlakteactieve stof (2,5% w / w) (Evonik Goldschmidt Corporation).

3. Experimentele opstelling

  1. Schakel de omgekeerde optische microscoop (Axio Observer, Zeiss) en high speed camera (Phantom V310, Vision Research). Focus en de kanalen voor klompen en vuil inspecteren door handmatig verplaatsen van het apparaat ofdoor een motor microscooptafel. Sommige kleine vuil kan worden geschoven wanneer vloeistof stroomt door. Voor grote vuil of voor de hand liggende klompen, selecteer een ander kanaal op het toestel zoals puin in de aandacht kanaal kan worden afgebroken bestellen kwaliteit aanzienlijk. Merk op dat klompen vaak kan worden verwijderd onder stroom door te drukken stevig op de PDMS oppervlak boven het getroffen gebied met stompe pincet.
  2. Snijd drie lengtes van de PVC-buis (0,01 "ID/0.03" OD, Tygon) voor de waterige inlaat-, olie-inlaat, en emulsie stopcontact. Om dood volume minimaliseren, knip net genoeg slangen te bereiken vanaf de spuit pompen aan de microscoop podium. Snijd buis eindigt in een hoek van 45 ° om het inbrengen te vergemakkelijken in vloeibare poorten.
  3. Pincet om op de buiseinden in de vloeibare poorten geperforeerd in stap 1 passen en druk aanbrengen van twee 30 gauge stompe uiteinde roestvrijstalen injectienaalden (SmallParts) in de vrije uiteinden van de respectieve waterige en olie inlaatbuizen (geen lijm nodig) . Plaats de uitlaat slang in een verspilling reservoir. Deze buis zal later worden verplaatst naar een opvangbak.
  4. Plaats het apparaat en de bijgevoegde slang aan op de microscoop podium, uitlijnen en richten zich op het apparaat met behulp van een mondstuk beschikbare objectieve (20x werd gebruikt voor dit experiment). Pas voor K hler verlichting en andere microscoop instellingen zoals vereist voor een optimale opname.
  5. Vul een 1 ml injectiespuit (BD) met goed gemengde waterige fase en een 3 ml spuit (BD) de oliefase bereid in stap 2. Merk op dat alle spuiten van een volume kan worden gebruikt en dienen zorgvuldig te worden geselecteerd afhankelijk van de gewenste doorlooptijden en minimalisering van eventuele pulsatiliteit. Verticaal kantelen een spuit en beweeg om luchtbellen te verplaatsen naar de spuit stopcontact. Duw langzaam zuiger genoeg om de lucht te duwen om de spuit. Houd de spuit verticaal, sluit de spuiten aan de respectieve naald reeds aan het apparaat in stap 3.3. Druk de zuiger om de lucht te dwingen door middel van de naald dood volume totdat de vloeistof is pushed door de slang bijna op het apparaat. Veilig te monteren tegen de spuit om een ​​injectiepomp (Nexus 3000, Chemyx) en trek de zuiger blok. Herhaal aansluitingen voor de tweede spuit en monteren op een tweede spuit pomp.
  6. Vermogen van elke pomp en spuit programma met behulp van de pomp fabrikant protocollen. Stel de eerste debiet Q olie = 50 pl / min en Q aq = 5 ul / min voor de oliefase en waterfase respectievelijk. Start de pompen.
  7. Wacht tot alle vloeistof om het apparaat in te voeren en de kanalen te vullen, te duwen resterende dode lucht. Dit kan enkele minuten duren. Als er een grote hoeveelheid lucht in de inlaat slang, tijdelijk verhogen elk debiet tot de lucht verdreven. Niet meer het debiet zo hoog dat grote druk optreden in het kanaal, kan leiden tot PDMS op glas losraakt.
  8. Met behulp van de initiële stroomsnelheden, bestudeer de vorming van druppels aan de spuitkop (resultaten hier weergegeven: 20x magnification, frame rate 21.005 fps, blootstelling 3 ps). Verminder de camera gezichtsveld om alleen het pijpje in de frame rate te maximaliseren en het geheugen te verminderen indien mogelijk. Leg sample video's en bevestigen dat de sampling rate is voldoende om aliasing te voorkomen.
  9. Om te voorkomen dat jetting (zie figuur 2), te beginnen met een laag water debiet. Verhoog langzaam het water debiet te observeren ordening van de deeltjes op de lange waterige oplossing kanaal als het debiet toeneemt.
  10. Als de deeltjes concentratie te laag is om treinen te voorzien van relatief weinig "ontbrekende" deeltjes en het monster werd niet geëvenaard drijfvermogen, fysiek kantelt de spuit pomp in de richting van de spuit-uitgang aan te bieden geleidelijk bezinken van deeltjes in de richting van de spuit stopcontact. Deze methode blijkt in de video protocol. Van tijd tot tijd het draaien van de spuit om zijn as kunnen ook de ongewenste vestiging.
  11. Als voldoende bestellen gebeurt, past u de olie debiet naar de generatie frequentie af te stemmen engrootte van druppels. De gemiddelde daling van het volume kan worden berekend met de waterige debiet gedeeld door de daling van generatie frequentie zoals gemeten door video-opname. Iteratief aan te passen beide debieten tot de gewenste inkapseling tarieven en daling volumes te bereiken.
  12. Zodra een stabiele besteld inkapseling wordt bevestigd, beweegt u de afvoer slang van het afval reservoir in een verzameling reservoir of stop het in een ander apparaat voor verdere testen.
  13. Bepaal de verzameling tijd op basis van gewenste aantal druppels en de berekende generatie frequentie.
  14. Neem de fractie van druppels met 0, 1, 2, ..., N deeltjes efficiency kwantificeren behulp van druppel generatie video resultaten of pipetteren een monster opgevangen emulsie voor inspectie.

4. Representatieve resultaten

De resultaten worden gepresenteerd die bereiken zowel gecontroleerde single-deeltjes en gecontroleerde dubbele deeltjes inkapseling (figuur 3). Bij het snijdende FC-40 olie debiet in de helft, single-deeltje inkapseling wordt twee-deeltjes inkapseling. Omgekeerd zouden we hebben het waterige debiet om deeltjes te leveren aan de nozzle sneller, maar we hebben ook zouden hebben verhoogd het risico van jetting van de waterige stroom. Histogrammen in Figuur 3 presenteert de fractionele aantal deeltjes per druppel voor de twee gevallen, samen met vergelijkingen met Poisson statistiek. Incidenteel druppels met nul deeltjes voornamelijk te wijten aan "missing" deeltjes in de geordende treinen, terwijl wanneer er meer ingekapselde deeltjes dan gewenst resultaat van middelbare deeltjesconcentraties en deeltjes die soms migreren naar een van de twee verticale gericht posities. Merk op dat drijfvermogen bijpassende zoals beschreven in paragraaf 2 werd niet benut. In plaats daarvan werd spuitpomp fysiek gekanteld om bezinking van deeltjes naar de uitlaat spuit, waardoor een hoge concentratie van deeltjes tijdens het experiment.

Een experimentele run illustreert de noodzaak voor een goede deeltjesgrootte en celconcentraties is in figuur 4. Zonder volledige bestelling, zijn lokale groepen van deeltjes orde en ingekapseld, maar veel druppels zijn zonder deeltjes. Een histogram toont de verminderde inkapseling efficiëntie voor de gewenste twee deeltjes inkapseling.

figure-protocol-1
Figuur 1. Encapsulation apparaat. a) Algemene apparaat met inhammen, uitlaat, en de lange bestellen kanaal. Het apparaat hoogte is 52 micrometer en de volgorde kanaalbreedte is 27 micrometer. b) zowel waterige en olie inhammen hebben grote brokstukken filters met gaten in de orde van de bestelprocedure kanaalbreedte voor de vergrote weergave van de olie-inlaat. c) De vergrote weergave toont nozzle gelijk kanaalbreedten 27 urn voor de waterige en oliekanalen, gevolgd door het mondstuk samentrekking van 22 urn en plotselinge expansie een bredere 61 pm kanaal.Merk op dat de afmetingen van de inrichting hier zijn getest met een profilometer na microfabricage en enigszins verschillen in de afmetingen van het masker. Een ware beeld van de bestelling kanaal en het mondstuk zijn online beschikbaar als aanvullende Figuur 1 . De AutoCAD masker bestand is ook opgenomen online als aanvulling op dit manuscript.

figure-protocol-2
Figuur 2. Hysterese van een druipend aan jetting overgang met een groter toestel (80 micrometer breed x 22 micrometer hoog). a) Bij constante FC-40 debiet (Q olie = 45 pL / min), gestage druppelvorming optreedt bij 10 kHz met behulp van een waterige debiet Q aq = 8 pl / min. Aangezien de waterige stroom langzaam verhoogd tot 10 m &u; L / min, jetting van de waterige vloeistof stroom wordt geactiveerd. b) Wanneer de stroom wordt teruggestuurd naar 8 pl / min jetting verder. Merk op dat voortdurende daling van de vorming kan worden hersteld door het kort te pauzeren de waterige stroom pomp (een pauze van 1 seconde is een typisch voorbeeld).

figure-protocol-3
Figuur 3. Single-en dubbel-deeltje inkapseling. A) Drop formatie met een cel per druppel (Q olie = 60 pL / min, Q aq = 9 pL / min) met een daling generatie tarief van 6,1 kHz, gemiddelde druppelgrootte van 24,4 pL, en een eencellige capture efficiëntie D k = 79,5% en Pk = 83,7% (λ = 0,95) voor een monster van n d = 517 druppels en n p = 491 deeltjes. b) druppelvorming met twee cellen per druppel wordt eenvoudig bereikt door het verminderen van de FC-40 debiet Q olie tot 30 μL / min. De grotere (39,8 pL) druppels worden gevormd met een snelheid van 3,8 kHz met een twee-cel vangdoelmatigheid D k = 71,5% en Pk = 79,5% (λ = 1,80) voor een monster van n d = 383 druppels en n p = 689 deeltjes. cd) twee staven vergelijken met de daling van inkapseling deeltje efficiëntie D k van de bestelde enkel-en dubbel-deeltje inkapseling met Poisson statistieken (willekeurige inkapseling). Merk op dat voor beide gevallen deeltjes afstand in de stromingsrichting ongeveer 17-18 pm voor volledig geordende, afwisselend deeltjes. Aanvullende video's met zowel single-en double-deeltje inkapseling zijn online beschikbaar. Klik hier om aanvullende Movie 3 bis te bekijken . Klik hier om aanvullende Movie 3b te bekijken .

figure-protocol-4
Figuur 4. Concentratie van grote invloed op inkapselefficiëntie. A) Als de concentratie afneemt, volledige bestelling doet zich niet voor, en dus "gaten" in de treinen komen, waardoor er enkele druppels met minder dan verwacht deeltjes. B) Het histogram van de afname van de efficiëntie laat zien ( D k = 55,9%, Pk = 70,9%) voor twee-deeltjes inkapseling door een lagere waarde van λ = 1,57 waar nagenoeg evenveel enkele druppels deeltjes als er twee-deeltjes druppels. Dit cijfer resultaten Q olie = 30 pl / min en Q aq = 9 pl / min, dezelfde stromingsomstandigheden als voor figuur 3b. Een vertegenwoordiger aanvullende video is online beschikbaar. Klik hier om aanvullende Movie 4 te bekijken .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Ondanks de relatief hoge mate van bestellen, zullen niet alle druppels bevatten het juiste aantal deeltjes of cellen. Inkapselefficiëntie kan worden berekend als het aantal cellen of deeltjes die raken ingekapseld in druppels met de gewenste bezetting gedeeld door hun aantal. Deze ruwe data kunnen worden verkregen bij een geautomatiseerde high speed video-algoritme of van beeldvorming een monster van de verzamelde emulsie. Dit kan vergeleken worden met de fractie deeltjes Pk ingekapseld in een druppe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

JE is een uitvinder op een octrooi gebaseerd op de technologie gebruikt in dit manuscript.

Dankbetuigingen

Wij danken Raindance Technologies voor de steekproef van PFPE-PEG oppervlakte-actieve stof gebruikt in deze studie, en we danken de BioMEMS Resource Center (Mehmet Toner, directeur) voor de silicium wafer mal gebruikt om PDMS kanaal replica's te creëren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het serum Vennootschap Catalogusnummer Reacties
AutoCAD AutoDesk
Transparantie Mask Fineline Imaging Inc
SU-8 fotolak Microchem 2050
Dektak profilometer Veeco
Petrischaal BD Falcon 351058
PDMS Siliconen Elastomeer Kit Dow Corning Corp Sylgard 184, Materiaal nummer (240) 4019862
Vacuümexsiccator Jencons 250-030
Vacuümpomp Alcatel Vacuum Technology 2010 C2
Vacuümregelaar Cole Parmer- EW-00910-10
Oven Thermo Scientific Lindberg Blue M, OV800F
Biopsie Punch, 0,75 mm Harris Uni-Core 15072
Laboratorium Corona Treater Electro-Technic Products Inc BD-20AC, SKU 12051A
Objectglaasjes Gold Seal 3010
Aquapel PPG Industries Alternatieve strategie
Polystyreen Microspheres, 9,9 micrometer Thermo G1000
OptiPrep Sigma-Aldrich D1556 Niet aangetoond
Luer-Lok spuiten BD 1 ml: 309628
3 ml: 309585
FC-40 Fluorocarbon Oil 3M Inc Sigma Aldrich, F9755
PFPE-PEG fluor Raindance Technologies
Lichte minerale olie PTI Proceschemicaliën 08042-47-5 Alternatieve strategie
Minerale olie oppervlakteactieve Evonik Goldschmidt Corporation ABIL EM 90 Alternatieve strategie
Tygon PVC-buis SmallParts TGY-010
30 Gauge Luer-Lok naald, 1/2 " SmallParts NE-301PL-C
Geïnverteerde microscoop Carl Zeiss Imaging Axio Observer.Z1
High Speed ​​Camera Vision Research Phantom V310
Spuit Pompen (2) Chemyx Inc Nexus 3000
Siliconenolie Dow Corning 200 vloeistof 10 cSt Optioneel voor Emulsion opslag

Referenties

  1. Zagnoni, M., Lain, G. L. e, Cooper, J. M. Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).
  2. Niu, X. Z., Gielen, F., Edel, J. B., deMello, A. J. A microdroplet dilutor for high-throughput screening. Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).
  3. Vincent, M. E., Liu, W., Haney, E. B., Ismagilov, R. F. Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals. Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).
  4. Huebner, A. Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics. Chemical communications. , 1218-1220 (2007).
  5. Love, J. C., Ronan, J. L., Grotenbreg, G. M., van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies. Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).
  6. Bradshaw, E. M. Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies. Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).
  7. Liu, W. S., Kim, H. J., Lucchetta, E. M., Du, W. B., Ismagilov, R. F. Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement. Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).
  8. Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).
  9. Koster, S. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).
  10. Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).
  11. Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biomedical materials. 5, 21001(2010).
  12. Edd, J. F. Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops. Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).
  13. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82, 364(2003).
  14. Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., Weitz, D. Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams. Physical Review Letters. 99, (2007).
  15. Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).
  16. Segrí, G., Silberberg, A. Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions. Nature. 189, 209-210 (1961).
  17. Carlo, D. D. i Inertial microfluidics. Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).
  18. Carlo, D. D. i, Edd, J., Humphry, K., Stone, H., Toner, M. Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows. Physical Review Letters. 102, (2009).
  19. Humphry, K. J., Kulkarni, P. M., Weitz, D. A., Morris, J. F., Stone, H. A. Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows. Physics of Fluids. 22, 081703(2010).
  20. Lee, W., Amini, H., Stone, H. A., Carlo, D. D. i Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413(2010).
  21. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane. Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
  22. Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J. Vis. Exp. (8), e319(2007).
  23. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
  24. Hatch, A. C. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab on a chip. , 3838-3845 (2011).
  25. Holtze, C. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).
  26. Garstecki, P., Stone, H., Whitesides, G. Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions. Physical Review Letters. 94, (2005).
  27. Garstecki, P., Fuerstman, M. J., Stone, H. A., Whitesides, G. M. Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up. Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).
  28. Nie, Z. Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids. Microfluidics and Nanofluidics. , (2008).
  29. Holt, D. J., Payne, R. J., Chow, W. Y., Abell, C. Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis. Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).
  30. Holt, D. J., Payne, R. J., Abell, C. Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams. Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).
  31. Hatch, A. C., Fisher, J. S., Pentoney, S. L., Yang, D. L., Lee, A. P. Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays. Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).
  32. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Microfluïdische inkapselingflow-focusing spuitmondinertiële ordeningenkeltje-celinkapselingdubbel-celinkapselingpartikelsurrogatendruppelgeneratiesnelheidwaterige stroomsnelheidoliesnelheidgecontroleerde inkapseling
High Throughput Single-cel en Multiple-cel Micro-encapsulatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.