Methodenartikel

Bemonstering Human Inheemse Speeksel peptidoom Met behulp van een Lollipop-Like Ultrafiltratie Probe: vereenvoudigen en te verbeteren Peptide Detection voor Klinische massaspectrometrie

DOI:

10.3791/4108

⸱

7 augustus 2012

 ,  , 
1Sanford-Burnham Medical Research Institute, 2Division of Dermatology, University of California, San Diego , 3VA San Diego Healthcare Center, 4Moores Cancer Center, University of California, San Diego

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekening houdend met speeksel bemonstering voor toekomstige klinische toepassing, is een lolly-achtige ultrafiltratie (LLUF) probe gemaakt om te passen in de menselijke mondholte. Directe analyse van onverteerd speeksel door nanoLC-LTQ massaspectrometrie werd aangetoond dat LLUF sondes om grote eiwitten en een hoge overvloed eiwitten te verwijderen, en maak een lage overvloedige peptiden meer aantoonbaar.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel het menselijk speeksel proteoom en peptidoom zijn geopenbaard 1-2 werden ze majorly geïdentificeerd uit eiwit hydrolysaten van speeksel eiwitten. Identificatie van de inheemse peptidoom van het menselijk speeksel zonder voorafgaande vertering met exogene enzymen wordt het absoluut noodzakelijk, omdat natieve peptiden in menselijk speeksel verstrekt potentiële waarden voor de diagnose van de ziekte, het voorspellen van progressie van de ziekte, en het toezicht op de therapeutische werkzaamheid. Passende steekproef is een cruciale stap voor de verbetering van de identificatie van menselijke inheemse speeksel peptidoom. Traditionele methoden van bemonstering van menselijk speeksel met centrifugeren om vuil te verwijderen 3-4 mei te veel tijd in beslag van toepassing te zijn voor klinisch gebruik. Bovendien kan vuil verwijderd door centrifugatie niet kunnen meeste geïnfecteerde pathogenen reinigen en de hoge overvloed eiwitten die vaak belemmeren de identificatie van geringe hoeveelheden peptidoom verwijderen.

Conventionele proteomische benaderingen die priMarily gebruik tweedimensionale gel-elektroforese (2-DE) gels in conjugatie met in-gel digestie staat zijn om vele speeksel eiwitten 5-6. Deze aanpak is algemeen niet gevoelig genoeg om geringe hoeveelheden peptiden / eiwitten te detecteren. Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) op basis van proteomics is een alternatief dat eiwitten zich kunnen identificeren zonder voorafgaande 2-DE-scheiding. Hoewel deze benadering levert een hogere gevoeligheid moet algemeen vooraf mon-fractionering 7 en pre-digestie met trypsine, waardoor het moeilijk voor klinisch gebruik.

Om de hinder in de massa spectrometrie als gevolg van monstervoorbereiding te omzeilen, hebben we een techniek genaamd capillaire ultrafiltratie (CUF) sondes 8-11. De gegevens van ons laboratorium aangetoond dat de CUF probes in staat zijn om het vastleggen van eiwitten in vivo van verschillende micro-omgevingen bij dieren in een dynamische en minimaal invasieve manier 8 -11. Geen centrifugeren is nodig omdat een negatieve druk wordt gecreëerd door gewoon spuit te trekken tijdens de monstername. De CUF sondes in combinatie met LC-MS hebben met succes geïdentificeerd tryptische-eiwitten verteerd 8-11. In deze studie hebben we een upgrade van de ultrafiltratie sampling techniek door het creëren van een lolly-achtige ultrafiltratie (LLUF) probe die gemakkelijk kunnen passen in de menselijke mondholte. De directe analyse van LC-MS zonder trypsinedigestie gebleken dat menselijk speeksel aangekocht bevat veel peptide fragmenten afkomstig van verschillende eiwitten. Bemonstering speeksel met LLUF sondes vermeden centrifugeren, maar effectief verwijderd veel groter en hoge overvloed eiwitten. Onze massaspectrometrische resultaten blijkt dat veel lage abundantie peptiden werden gedetecteerd na het uitfilteren van grotere eiwitten met LLUF sondes. Detectie van lage abundantie heeft speeksel peptiden was onafhankelijk van de verschillende voor-stap voorbeeld scheiding met chromatografie. Voor klinische toepassing, de LLUF sondes te nemend met LC-MS zou kunnen worden gebruikt in de toekomst progressie van de ziekte van speeksel te controleren.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Oprichting van LLUF Probes

  1. De polyethersulfone membranen (2 cm 2) werden afgesloten met driehoek polypropyleen paddles (University of California, San Diego) door lijmen membranen met epoxy op de grens van peddels. Een negatief geladen polyethersulfon membraan met een molecuulgewicht drempelwaarde (MWCO) op 30 kDa was gebruikt.
  2. Een teflon gefluoreerde etheen-propeen buis (inwendige diameter / buitendiameter 0.35/0.50 cm) werd aan een cilinder uitgang van een driehoek polypropyleen paddle zodat LLUF probe kan worden aangesloten op een 20 ml spuit.
  3. Na het weken de polyethersulfon membraan in menselijk speeksel in een cultuur schotel (50 mm diameter), is negatieve druk die door intrekking van een spuit. De injectiespuit met onderdruk reed ultrafiltratie proces voor bemonstering eiwitten uit speeksel.
  4. De probes werden gesteriliseerd 70% alcohol nacht voor gebruik. Om een ​​goede afdichting tonen we LLUF probes geplaatst in een oplossingTION met blauwe dextran (50 mg / ml) met een gemiddeld molecuulgewicht van 2.000 kDa gedurende 2 uur. De afwezigheid van blauwe dextran in de verzamelde voorbeelden blijkt dat geen lekken ontstaan ​​tijdens fabricage probe en bemonstering.

2. Speeksel Collection

  1. Hele speeksel werd verzameld uit drie gezonde vrijwilligers (twee mannen en een vrouw in de leeftijd tussen 20 en 40), waarbij geen medicijnen, zonder duidelijke tekenen van gingivitis of holten 6.
  2. Na het spoelen van de mond met water, werden de hele speekselmonsters verzameld door spugen, zonder chemische stimulatie, in een met ijs gekoelde vat.
  3. Alle monsters werden samengevoegd en op ijs gehouden tijdens het verzamelen procedure.
  4. Onmiddellijk na de inzameling, werd speeksel (200 ul) die wordt toegepast voor de bemonstering met LLUF sondes. De bemonstering werd uitgevoerd bij 4 ° C kamer.
  5. Speeksel eiwitten (1,0 pg / pl) met of zonder LLUF probe verzameling werden direct onderworpen aan nano LC-massa'spectrometry analyse zonder tryptische spijsvertering. Eiwitconcentraties werden bepaald met een Bio-Rad Protein Assay 12.

3. NanoLC-LTQ MS Analysis

  1. De niet-gedigereerde speeksel (5 pi) rechtstreeks geladen op de val kolom van de Eksigent nanoLC systeem door de autosampler met 100% buffer A (2% acetonitrile/0.1% mierezuur). De nanoLC is on-line in combinatie met een Finnigan LTQ massaspectrometer.
  2. Na het monster laden en wassen, werd het ventiel geschakeld en een 500 nl / min lineaire gradiënt werd geleverd aan de val en de scheiding kolom (10 cm lang, 100 micrometer id, in-house vol met Synergi 4 micrometer C18). De gradiënt was 0-50% buffer B (80% acetonitrile/0.1% mierezuur) bij 45 minuten.
  3. De nanoLC-LTQ MS instrumenten werden gebruikt in de gegevens die afhankelijk zijn mode door Xcalibur. MS / MS-spectra van de vier sterkste MS ionen boven een intensiteit van 1 x 10 5 werden verzameld dynamische uitsluitingingeschakeld en de botsingsenergie vastgesteld op 35%.
  4. Elk monster werd twee keer door de nanoLC-LTQ MS systeem. Monsters van drie verschillende bereidingen werden gebruikt. Deze peptiden detecteerbaar in drie monsters werden in aanvullende tabellen 1 en 2. Vertegenwoordiger van nanoLC-LTQ MS-spectra werd geïllustreerd in figuur 3.

4. Data-analyse en Proteïne database zoeken

  1. Elke RAW-bestand is omgezet in een mzXML bestand met behulp van Readw.exe.
  2. De mzXML bestand werd ingevoerd in een Sequest Sorcerer 2-systeem en zocht tegen een menselijke database gegenereerd op basis van de overeenkomstige National Center for Biotechnology Information (NCBI) eiwit-database met behulp van niet-enzym specificiteit. De massa tolerantie van precursor ion werd vastgesteld op 1,5 Da. Een molecuulmassa van 16 Da is toegevoegd methionine differentiële zoeken om rekening te houden oxidatie.
  3. Na Sequest zoeken, waren de resultaten automatisch gefilterd, gevalideerd eend weergegeven door PeptideProphet en ProteinProphet [Institute for Systems Biology (ISB)]. PeptideProphet schat een uitgebreide waarschijnlijkheid (P) score die een peptide opdracht is "correct" versus "incorrect" op de basis van haar Sequest score (Xcorr, ΔCn, Sp, RSP) en de aanvullende informatie van elke onderscheiden peptide sequentie. ProteinProphet berekend een kans score 0-1 voor elk eiwit op basis van peptiden die aan MS / MS-spectra.
  4. Om vals-positieve identificaties te minimaliseren gebruiken we strenge filter criteria. Eerst wordt de minimale P score cutoff vastgesteld op 0,8 voor aanvaarde peptide tot zeer lage fout (veel minder dan 3%) en redelijk goede gevoeligheid te verzekeren. Ten tweede moeten alle peptiden met> 0,8 P score een hoge cross-correlatie (Xcorr) scoort op hetzelfde moment: 1,9, 2,2, en 3,0 voor +1, +2 en +3 kosten.

5. Het verwijderen van bacteriën in de mond met LLUF Probes

  1. Om het vermogen van LLUF sondes te bepalen om de te verwijderenorale bacteriën, speeksel voor en na LLUF probe collectie (hoofdstuk 3) werd uitgespreid op agar platen voor bacteriële detectie.
  2. Aërobe bacteriën werden gekweekt op een antibioticum-vrij Lauria-Bertani (LB) agarplaat bij 37 ° C gedurende een dag.
  3. Anaerobe bacteriën werden gekweekt op een antibioticum-free Brucella bouillon agarplaat (BD, Sparks, MD) onder anaërobe omstandigheden met behulp van gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) bij 37 ° C gedurende een dag.

6. Representatieve resultaten

1. Fabricage van LLUF probes en bemonstering speeksel in een nagebootst orale milieu

Indien uit een monsterneming speeksel kan worden uitgevoerd als een lolly zuigen, zal de procedure voorkomen dat de afbraak van spuugde speeksel in de collectie van apparaten 13-14. Belangrijk is, zal het ook mogelijk geworden om patiënten te controleren dynamisch en lokaal van orale holtes. Bovendien, als monstervoorbereiding met behulp van speeksel kunnen worden vereenvoudigd, zouden clinici gemakkelijk facilitate de procedure om hun beslissing te bespoedigen op de volgende klinische operatie. Massaspectrometrie een van de meest gevoelige technieken voor het opsporen en sequentie eiwitten zelfs in zeer korte tijd. Er zijn echter ingewikkelde procedures voor monstervoorbereiding bemoeilijkt het gebruik van deze techniek in de kliniek. Verder is bekend dat een hogere overvloed eiwitten of eiwitten met hoog molecuulgewicht in klinische monsters (bijvoorbeeld amylase in speeksel) masker geringe hoeveelheden eiwitten massaspectrometrische analyse 15-16. Om de hindernissen te overwinnen bovengenoemde, ontwikkelden we een lolly-achtig apparaat met de naam ultrafiltratie LLUF sondes (figuur 1). Een negatief geladen polyethersulfon membraan met een MWCO 30 kDa (figuur 1A, a) werd gelijmd polypropyleen drukplaat (figuur 1A, b). Het werd geplaatst voor de LLUF sonde met de intentie om te filteren op grotere eiwitten in het speeksel. Om de humane orale omgeving (Figuur 1A, g na te bootsen), Een spons (figuur 1A, e) gedrenkt in speeksel een kweekschaal (figuur 1A, f). Na volledig terugtrekken van de injectiespuit (figuur 1A, d), gefiltreerd speeksel in beweging langs een buis aangesloten (Figuur 1A, c) en werden verzameld.

2. Identificatie van inheemse speeksel peptidoom door nanoLC-LTQ MS

Vergelijken LC chromatogrammen, we verschillende chromatogrammen van speeksel gevonden voor en na LLUF bemonstering (Figuur 2), wat aangeeft dat er verschillende eiwitsamenstellingen in het speeksel na LLUF bemonstering. Om het eiwit samenstellingen bepalen gebruikten we nanoLC-LTQ massaspectrometrie waarvan bekend is dat snel kunnen sequentie peptiden uit een veelvoud proteïnemengsel. Wat nog belangrijker is, om monstervoorbereiding voor klinische doeleinden te vereenvoudigen, werd geheel speeksel zonder chemische of enzymatische vertering aangevraagd nanoLC-LTQ MS-analyse. Onverwacht 131 peptiden weopnieuw geïdentificeerd in onverteerde speeksel (aanvullende tabel 1). Deze peptiden zijn fragmenten die voortkomen uit verschillende proline rijke eiwitten, actine, alfa-amylase, alfa-1-globine-, bèta-globine, histain 1, keratine 1, mucine 7, polymere immuunglobuline receptor, satherin en S100A9. Zesentwintig unieke peptiden werden in speeksel na filtering met LLUF probes (aanvullende tabel 2). Deze peptiden zijn fragmenten voornamelijk afkomstig van verschillende proline-rijke eiwitten. Peptiden afgeleid van proteïnen zoals de polymère immunoglobuline receptor (83,24 kDa) en alfa-amylase, waren niet detecteerbaar, het aantonen dat LLUF probes in verwijdering van grotere en overvloedige proteïnen. Een MS / MS spectrum van de PFIAIHAEAESKL peptide overeenkomt met een interne peptide van alfa-amylase is in figuur 3A. De meeste intrigerend, na het verwijderen van grotere eiwitten, 18 van 26 gesequenced peptiden werden gedetecteerd in de LLUF probe-bemonsterd speeksel (tabel1). Deze 18 peptiden afgeleid van proline-rijke eiwitten of eiwitten die hypothetische afgesloten met een proline (P) -. Glutamine (Q) (-PQ),-SR,-SP-PP C-terminus figuur 3B heeft een MS / MS spectrum van PQGPPQQGGHPRPP peptide dat is gedetecteerd in de LLUF sonde bemonsterd speeksel. Het peptide kan worden afgeleid van proline-rijke eiwitten HaelII subfamilie 1 en 2 (Tabel 1).

figure-protocol-1
Figuur 1. Samenstellingen van LLUF probes en bemonstering van hele speeksel nabootsen menselijke mondholte Paneel A. (A) een semi-permeabel polyethersulfon een MWCO 30 kDa, (b) een polypropyleen paddle, (c) een teflon gefluoreerde etheen-propeen buis; (d) een 20 ml spuit Paneel B:. een spons (e) (a nagebootste tong) werd gedrenkt in een kweekschaal (f) met speeksel makenkunstmatige menselijke mondholte (g). De resulterende negatieve druk die door het volledig intrekken van een injectiespuit drijft de verzamelde vloeistof langs een aangesloten buis (pijl) en naar een ruimte gecreëerd (pijlpunt) te verplaatsen binnen spuit. Bar: 2,0 cm.

figure-protocol-2
Figuur 2. Differentieel LC / MS / MS chromatogrammen van speeksel voor en na LLUF bemonstering. Eiwitten (1,0 pg / pl) in humaan speeksel gefiltreerd zonder of met een probe LLUF. Eiwitten zonder tryptische digestie werden direct onderworpen aan nanoLC-LTQ MS dat geconjugeerd is met een Eksigent Nano LC zoals beschreven in Materiaal en methoden. De base-piek chromatogrammen (44-mim retentietijden) speeksel voor (A) en na (B) LLUF bemonstering werden geïllustreerd.

figure-protocol-3
Figuur 3. DetectieTIE van speeksel peptidoom door nanoLC-LTQ MS sequencing. speeksel eiwitten voor (A) en na (B) bemonstering met LLUF sondes werden geanalyseerd door nanoLC-LTQ MS zoals beschreven in de experimentele procedures. Speeksel peptidoom uit natuurlijke speeksel zonder tryptische digestie werden aangetoond in aanvullende tabellen 1 en 2. Een peptide (PFIAIHAEAESKL) zijn afgeleid van alfa-amylase werd uitsluitend aangetroffen in een speekselmonster zonder de heffing met LLUF sondes (A), hetgeen illustreert dat het vermogen van LLUF sondes in het verwijderen van grote eiwitten. Veel peptiden met-PQ,-SR,-SP-PP C-termini werd uitsluitend monsters na ultrafiltratie LLUF probes. Een (PQGPPQQGGHPRPP) van peptiden die zijn afgeleid van verschillende proline rijke eiwitten bleken (B). MS / MS spectra met karakteristieke "y" en "b"-serie ionen bevestigde de identiteit van beide peptiden.

figure-protocol-4
Figuur 4. Verwijdering van bacteriën in de mond gebruiken tijdens LLUF sondes. Een LLUF probe werd als beschreven in Materialen en Werkwijzen. De sonde was geplaatst in het menselijk speeksel in een nagebootste mondmilieu (figuur 1). De spuit eind LLUF probe werd onttrokken aan een onderdruk die de ultrafiltratie proces speeksel bemonstering reden maken. Tijdens de bemonstering, de hele speeksel gekruist selectief door de polyethersulfon membraan en opgebouwd in een spuit. Hele speeksel bij de bemonstering met een probe LLUF diende als controle. Speeksel (10 pi) vóór en na LLUF probe bemonstering uitgespreid op agar platen bacteriële detectie panel A. Speeksel met (+ LLUF) en zonder (+ LLUF) LLUF probe bemonstering verspreid naast elkaar op een antibioticum vrij LB agarplaat bij 37 ° C gedurende een dag panel B. speeksel met en zonder LLUF probe bemonstering uitgespreid op een antibioticum vrij Brucella bouillon agarplaatonder anaerobe omstandigheden met gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) bij 37 ° C gedurende een dag. Bacteriën niet groeien op agar platen verspreid met LLUF probe-bemonsterd speeksel, het aantonen van de mogelijkheid van LLCF probes in het elimineren van aërobe en anaërobe bacteriën in de mond. Bar: 1,0 cm.

Peptidensequentie / Gemeten peptide massa Toetreding aantal Naam
1 AGNPQGPSPQGGNKPQ
GPPPPPGKPQ
2485.3 		gi | 41349484 Proline-rijk eiwit BstNI subfamilie een isovorm 2 voorloper
gi | 41349482 Proline-rijk eiwit BstNI subfamilie een isovorm 1 precursor
gi | 60301553 Proline-rijk eiwit BstNI subfamilie 2
2 GGHQQGPPPPPPGKPQ
1576.9 		gi | 4826944 Proline-rijk eiwit HaelII subfamilie 2
gi | 9945310 Proline-rijk eiwit HaelII subfamilie 1
3 GPPPAGGNPQQPQAPPA
GKPQGPPPPPQGGRPP
3126.2 		gi | 37537692 Proline-rijk eiwit BstNI subfamilie 4 voorloper
4 GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ
2028.3 		gi | 113423660 Voorspeld: hypothetische eiwit
5 GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP
2077.8 		gi | 113423262 Voorspeld: hypothetisch proteïne isovorm 5
gi | 41349482 Proline-rijk eiwit BstNI onderfamilie 1 isoform 1 precursor
gi | 60301553 Proline-rijk eiwit BstNI subfamilie 2
gi | 113423663 Voorspeld: hypothetische eiwit
gi | 41349484 Proline-rijk eiwit BstNI subfamilie een isovorm 2 voorloper
gi | 41349486 Proline-rijk eiwit BstNI subfamilie een isovorm 3 voorloper
6 GPPPPPPGKPQGPPPQ
GGRPQGPPQGQSPQ
2918.5 		gi | 9945310 Proline-rijk eiwit HaelII subfamilie 1
7 GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ
2131.3 		gi | 113423660 Voorspeld: hypothetische eiwit
8 GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ
2030 		gi | 113423663 Voorspeld: hypothetische eiwit
gi | 41349482 Proline-rijk eiwit BstNI subfamilie een isovorm 1 precursor
gi | 113423262 Voorspeld: hypothetisch proteïne isovorm 5
gi | 60301553 Proline-rijk eiwit BstNI subfamilie 2
9 GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ
1866.6 		gi | 4826944 Proline-rijk eiwit HaelII subfamilie 2
10 GPPQQGGHPPPPQGRPQ
1713.8 		gi | 9945310 Proline-rijk eiwit HaelII subfamilie 1
gi | 4826944 Proline-rijk eiwit HaelII subfamilie 2
11 GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ
2083.1 		gi | 9945310 Proline-rijk eiwit HaelII subfamilie 1
gi | 4826944 Proline-rijk eiwit HaelII subfamilie 2
12 GRPQGPPQQGGHQQGP
PPPPPGKPQ
2512.6 		gi | 4826944 Proline-rijk eiwit HaelII subfamilie 2
gi | 9945310 Proline-rijk eiwit HaelII subfamilie 1
13 NKPQGPPPPGKPQGPP
PQGGSKSRSSR
2720.2 		gi | 113423262 Voorspeld: hypothetisch proteïne isovorm 5
gi | 113423663 Voorspeld: hypothetical eiwit
14 PQGPPQQGGHPRPP
1450.1 		gi | 9945310 Proline-rijk eiwit HaelII subfamilie 1
gi | 4826944 Proline-rijk eiwit HaelII subfamilie 2
15 QGRPQGPPQQGGHPRPP
1791.1 		gi | 4826944 Proline-rijk eiwit HaelII subfamilie 2
gi | 9945310 Proline-rijk eiwit HaelII subfamilie 1
16 SPPGKPQGPPPQ
1186.9 		gi | 113423262 Voorspeld: hypothetisch proteïne isovorm 5
gi | 41349482 Proline-rijk eiwit BstNI subfamilie een isovorm 1 precursor
gi | 60301553 Proline-rijk eiwit BstNI subfamilie 2
gi | 113423663 Voorspeld: hypothetische eiwit
gi | 41349484 Proline-rijk eiwit BstNI subfamilie een isovorm 2 voorloper
gi | 41349486 Proline-rijk eiwit BstNI subfamilie een isovorm 3 voorloper
17 SPPGKPQGPPPQGGNQ
PQGPPPPPGKPQ
2720.3 		gi | 113423663 Voorspeld: hypothetische eiwit
gi | 41349482 Proline-rijk eiwit BstNI subfamilie een isovorm 1 precursor
gi | 113423262 Voorspeld: hypothetisch proteïne isovorm 5
gi | 60301553 Proline-rijk eiwit BstNI subfamilie 2
18 SPPGKPQGPPQQEGNKPQ
1870.9 		gi | 37537692 Proline-rijk eiwit BstNI subfamilie 4 voorloper

Tabel 1. Peptiden waren uitsluitend aantoonbaar in LLUF-verzameld monsters.

Aanvullende tabel 1. Klik hier om extra tabel te bekijken 1 .

Aanvullende tabel 2. Klik hier om extra tabel te bekijken 2 .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij hebben gevonden dat veel peptide fragmenten bestaan ​​menselijke onverteerd speeksel. Deze peptide fragmenten daarvan aan verschillende vormen van proline-rijke eiwitten, actine, alfa-amylase, alpha 1 globine, beta-globine, histain 1, keratine 1, mucine 7 polymère immunoglobuline receptor, satherin, S100A9. Er kunnen vele factoren de productie van peptiden met een onbepaald knipplaatsen. Bijvoorbeeld, sommige peptidefragmenten van nature aanwezig in humaan speeksel. Veel peptiden met-PQ C-termini vastgesteld

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grants (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 en R21-I58002-01). Wij danken C. Niemeyer voor de kritische lezing van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het serum Vennootschap Catalogusnummer Reacties
Polyethersulfon membranen Pall Corporation 30 kDa MWCO
Teflon gefluoreerde etheen-propeen buis Upchurch Wetenschappelijk
Blue dextran Sigma
Nano LC systeem Eksigent
C18 val kolom Agilent 5065-9913
LTQ lineaire ion-trap massaspectrometer Thermo Fisher
Sorcerer 2 Sage-N ReseaRCH
Acetonitril-0.1% mierenzuur JT Baker 9832-03 LC / MS klasse
Water-0.1% mierenzuur JT Baker 9834-03 LC / MS klasse

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
  2. Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
  3. Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
  4. Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
  5. Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
  6. Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
  7. Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
  8. Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
  9. Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
  10. Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
  11. Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
  12. Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
  13. Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
  14. Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
  15. Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
  16. Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
  17. Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
  18. Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
  19. Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
  20. Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
  21. Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
  22. Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
  23. Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
  24. Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
  25. Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
  26. Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
  27. Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
  28. Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
  29. Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
  30. Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
  31. Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
  32. Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
  33. Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
  34. Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
  35. Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
  36. Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
  37. Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
  38. Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lollipop ultrafiltratieprobeanalyse van het saliva peptidoomcapillaire ultrafiltratienano LC MS analyseinheemse speekselpeptideneiwitfiltratiemethodedirecte massaspectrometrieverwerking van speekselmonstersdetectie van peptiden met een lage abundantieontdekking van klinische biomarkers

Gerelateerde artikelen