Muis Islet van Langerhans Isolatie met behulp van een combinatie van Gezuiverde Collagenase en neutraal protease

Samenvatting

Een gedetailleerde beschrijving van muis eilandje isolatie wordt beschreven door de techniek van in situ pancreas ductaal infusen en perfusie van een combinatie van gezuiverd collagenase en neutrale protease.

Samenvatting

Ondervraging van beta genexpressie en functie in vitro is vierkant verschoven over de jaren de studie van knaagdieren tumorigene cellijnen de studie van geïsoleerde eilandjes knaagdieren. Primaire eilandjes bieden het onmiskenbare voordeel dat ze meer getrouw de biologie van intracellulaire signaalwegen en secretoire respons te geven. Dat de werkwijze eilandje isolatie met behulp van tissue dissociëren enzym (TDE) preparaten is goed vastgesteld in vele laboratoria ^1-4, variaties in de consistentie van eilandje opbrengst en kwaliteit van een bepaalde stam knaagdier de draagwijdte en de haalbaarheid van primaire eilandje studies. Deze variaties vaak optreden als gevolg van de ruwe gedeeltelijk gezuiverde TDES in de isolatieprocedure eilandje; TDes vertonen vaak veel te veel verschillen in activiteit en vaak aanpassingen van de dosering enzym. Een klein aantal rapporten hebben gebruikt gezuiverd TDES voor knaagdieren cel isolaties ^{5, 6} 7, 8, waarbij de TDes rechtstreeks geperfuseerd in de ductus pancreaticus van muizen, gevolgd door ruwe tissue fractionering door een Histopaque gradiënt ⁹ en isolatie van gezuiverd eilandjes. Een significant verschil in ons protocol is het gebruik van gezuiverd collagenase (CI zyme MA) en neutraal protease (CI zyme BP) combinatie. De collagenase werd gekenmerkt door het gebruik van een ⁶ fluorescentie collageen afbrekende activiteit (CDA) assay die fluorescent gelabeld oplosbaar kalfshuid vezels als substraat ⁶ gebruikt. Dit substraat is voorspellend de kinetiek van collageenafbraak in de weefselmatrix omdat het berust op natief collageen als substraat. De protease was laracterized met een gevoelige fluorescente kinetische test ^10. Gebruik te maken van deze verbeterde testen, samen met meer traditionele biochemische analyse mogelijk te maken van de TDE om meer consistent worden vervaardigd, wat leidt tot betere prestaties consistentie tussen partijen. De hierin beschreven protocol werd geoptimaliseerd voor maximale opbrengst en optimale islet islet morfologie met C57BL / 6 muizen. Tijdens de ontwikkeling van dit protocol werden verschillende combinaties van collagenase en neutrale proteasen in verschillende concentraties geëvalueerd en de uiteindelijke verhouding van collagenase: neutraal protease enzym van 35:10 geeft prestatie vergelijkbaar Sigma Type XI. Omdat significante variabiliteit in gemiddelde islet opbrengst van verschillende stammen van ratten en muizen gemeld, aanvullende modificaties van de TDE samenstelling worden om de opbrengst en kwaliteit van eilandjes teruggewonnen uit verschillende soorten en stammen verbeteren.

Protocol

A. Benodigde materialen: zie tabel 1 (reagentia) voor de bereiding

1. HBSS (P / S) 100 ml 10X HBSS + 900 ml H ₂ 0 + 1% penicilline / streptomycine (opgeslagen in de koelkast bewaard op ijs).
2. 20% BSA stock wordt in water en in porties verdeeld en bewaard bij -20 ° C.
3. HBSS (BSA): 200 ml 1X HBSS (P / S) + 3 ml 20% BSA (BSA uiteindelijke concentratie 0,3%)
4. Islet medium: RPMI + 10% FBS + 1% glutamine + 1% penicilline / streptomycine
5. Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque + 200 ml 1077 Histopaque
6. 4-0 Suture (McKesson): gesneden in 2 ¾ inch stukjes en opgeslagen in een 10 cm Petrischaal
7. Instrumenten: Buig de tang van Fine Science Tools tot 90 °, en vijl langs de gekartelde tanden van alle drie paar van de tang. Het doel is om saai de tanden, niet om ze te verwijderen.
8. Canule voor toediening van collagenase / protease mengsel: 27G ½ inch naald, 30 ½ inchnaald, PE50 leidingen gesneden in 12 inch stukken. Bestand beide naalden tot een gladde afgeronde einde dat geen scherpe randen heeft. Steek de 27G naald in het ene uiteinde van een 12 inch stuk PE50 leidingen. Verwijder de 30G naald uit de behuizing door het inslaan van de behuizing met een tang, het draaien van de behuizing ¼ draai per keer. Verwijder de naald met de tang uit de behuizing en plaats deze in het andere uiteinde van de buis PE50 onder een dissectie microscoop. Zorg ervoor dat u geen knikken in de slang als je de naald in de PE50 slang. De 27G naald is het einde dat u de spuit van collagenase hechten.
9. Collagenase (CI zyme MA) en neutraal protease (CI zyme BP). Reconstitueer de TDE volgens de instructies van de fabrikant. Raadpleeg de veel specifieke Analysecertificaat om de enzymactiviteit concentratie te berekenen. Breng een totaal van 350.000 collageen afbrekende activiteit (CDA) eenheden van de gereconstitueerde collagenase en 100.000 neutraal protease eenheden van de reconstitdeeld BP Protease in een conische buis en verdund tot 15 ml totaal in HBSS (P / S)

B. Stap-voor-stap protocol

1. De inflatie van de alvleesklier met collagenase / Protease Mengsel

1. Euthanaseren de muis door cervicale dislocatie, verzadigen de muis torso met 70% EtOH, open buikholte volledig uit anus te membraan met een dissectie schaar en pincet.
2. Plaats de muis op het platform van een dissectie microscoop.
3. Trek het caecum en colon ascendens uit en zet ze buiten het lichaam holte aan uw linkerhand. Zie figuur 1 voor een overzicht van de volgende stappen.
4. Plaats de lobben van de lever tegen het membraan, en moet er blijven als de lichaamsholte ver genoeg geopend. Vind de leverslagader, poortader en galgang bundel die naar de lever door het vastgrijpen van de twaalfvingerige darm met gebogen tang. Met een paar gebogen forceps, handen onder de slagader, ader en kanaal bundle en trek een 2 ¾ inch stuk van 4-0 hechtdraad onder de slagader, ader, galgang en een keer bind het en trek deze strak zo dicht mogelijk bij de lever mogelijk te maken.
5. Gebruik van twee paar gebogen forceps voorzichtig pak de duodenum en vindt de galbuis aan de twaalfvingerige darm in de papil. Gebruik een tang van de tang te porren door de alvleesklier en het bindweefsel vlak onder de galwegen in de buurt van de papil. Snel Poke uw pincet door het orgaan van een gat te maken en zet beide tangen van een tang door en pak nog eens 2 ¾ inch stuk van 4-0 hechtdraad door en bind het een keer en trek hem naar een kleine cirkel, maar trek dan niet strak.
6. Ga naar de 90 ° forceps en de Superfine Vannas schaar. Met de 90 ° tang voorzichtig knijpen en trek de dunne darm tot de galwegen strak staat. Maak een horizontale snede over de papil met de schaar door steken de open schaar in de darm en dan snijden met een beweging. Probeer alleen one dwars door de papil zonder loskomen van de galwegen van de papil.
7. Terwijl u de darm van de 90 ° forceps, de canule op te voegen in de galbuis aan de halve lengte van de galwegen, en trek de hechtdraad strak om de canule.
8. Vul een 3 ml spuit met 2,0 ml collagenase / protease mengsel en injecteren in de canule langzaam en constant tempo.
9. Na het opblazen van de alvleesklier is voltooid, verwijdert de canule uit galwegen en het gebruik van de gebogen tang en gebogen veer schaar om de opgeblazen alvleesklier te verwijderen door te beginnen bij de colon descendens en knippen het bindweefsel als je trek de darmen omhoog. Blijf de alvleesklier te verwijderen uit de darmen tot aan de galwegen, verwijder vervolgens de alvleesklier van de milt, dan is de maag en vervolgens van de ingewanden van de buikholte. Eindig het verwijderen van door knippen weg de hechtingen. Voeg de pancreas een 50 ml buis met 5 ml HBSS(P / S). Deze buis moet op ijs.
10. Herhaal de procedure hierboven voor elk dier tot vier dieren. Voor een optimaal resultaat, dissociëren slechts vier pancreata in een keer. Typisch, terwijl de eerste vier in de 37 ° C waterbad we opgeblazen eens vier pancreata.

2. Pancreas Dissociatie

1. Plaats de 50 ml buisjes met de pancreata in een 37 ° C waterbad gedurende 15 minuten.
2. Schud de buis en controleer weefsel dissociatie, lees dan zeker weefsel komt gemakkelijk uit elkaar, dan wervelen de buizen 12 keer terwijl u houden van de buis door het deksel.
3. Voeg niet meer dan 30 ml HBSS (BSA) (dit kan een kleinere hoeveelheid zijn, afhankelijk van hoeveel moet de buizen balans voor de centrifugestap) en centrifugeer bij 290 xg gedurende een min.
4. Zorgvuldig aspireren supernatant en laat een kleine hoeveelheid supernatant (2-3 ml) onder om zo niet de cel pellet te verstoren.
5. Met behulp van een 30 ml spuit attached tot 14G naald, voeg niet meer dan 10 ml HBSS (BSA) en zuig de suspensie op en neer 2 keer.
6. Filtreer het mengsel door een cel plastic theezeefje in een 50 ml buis en spoelen met nog eens 10 ml HBSS (BSA).
7. Centrifugeer bij 330 xg gedurende 2 minuten.
8. Decanteer supernatant en omkeren buizen uitlekken op een absorberende papieren handdoek gedurende 1 min.
9. Resuspendeer elke buis in 10 ml koud 1100 Histopaque.
10. Bedekken de Histopaque met 10 ml HBSS (BSA) en centrifugeer bij 900 xg gedurende 18 min.
11. Verwijder de gehele 20 ml van de bovenstaande met behulp van een grote boring 25 ml pipet en laat de bovenstaande vloeistof op een omgekeerde 70 pm filter.
12. Spoel de eilandjes in een 10 cm Petrischaal door pipetteren 10 ml eilandje media door het filter terwijl u hem rechtop over het gerecht.
13. Cultuur de eilandjes in een 37 ° C, _5% CO2 weefselcultuurincubator tot aan experimenten. Typisch, worden eilandjes met de hand geplukt en voorafgaand aan de expertise geteldimentation.

3. Representatieve resultaten

Islet opbrengsten, morfologie, en kwaliteit zijn de algemene parameters die worden gebruikt om het succes van eilandje isolatie te beoordelen. In onze handen eilandje opbrengst van de gemiddelde C57BL / 6 muis in het bereik van 150-250 eilandjes met dit protocol (zie tabel 2) en vergelijkbaar gegevens verkregen met geoptimaliseerde Sigma type XI collagenase. Echter kunnen de opbrengsten variëren afhankelijk van de gebruikte muizenstam en de leeftijd van de muis. De meeste dieren we gebruiken zijn in de week 8-16 leeftijd Dit protocol is getest op meerdere muizenstammen, waaronder C57BL / 6 (180-250 eilandjes / muis), CD1 (200-300 eilandjes / muis), 129 / B6 (200-300 eilandjes / muis), BLKS-db/db (120-200 eilandjes / muis), NOD (10 weken oud, 100-150 eilandjes / muis) en NOD-SCID (100-150 eilandjes / muis ). Typische eilandje morfologie weergegeven in figuur 2, waarin eilandjes een ronde vorm te langwerpig met relatief uniforme grootte (hoewel size uniformity kan variëren van stam tot) stam. Figuur 3 toont onze typische analyse van glucose-gestimuleerde insulinesecretie uit C57BL / 6 muizen die eilandjes met gezuiverd TDes vs Sigma type XI collagenase. Typisch een hoge kwaliteit eilandje preparaat resulteert in een insulinestimulatie bij 25 mM glucose die 6-20 maal groter dan waargenomen bij 2,5 mM glucose. Andere toepassingen kunnen ook worden gebruikt om de kwaliteit van geïsoleerde eilandjes testen en deze omvatten het gebruik van technieken perifusion, Ca ^{2 +} imaging (met fura2) en reverse-transcriptie PCR, onder anderen ^11.

Figuur 1. Een samenvatting van de canulatie van de galwegen.

Figuur 2. Typisch uiterlijk van C57BL / 6 eilandjes op 24 uur na isolatie. Beelden werden verkregen op een inomgezet microscoop bij 40X vergroting.

Figuur 3. Glucose-gestimuleerde insuline secretie van C57BL / 6 eilandjes. Na 24 uur na isolatie werden 100 eilandjes geïncubeerd in een 12-well schaal 1 uur bij 37 ° C in Krebs-Ringer-HEPES gebufferde oplossing die 2,5 mM glucose. Eilandjes werden vervolgens overgebracht naar Krebs-Ringer HEPES bij 2,5 mM glucose tegen uur, waarna de supernatant werd verzameld voor insuline meting met een twee-site immuunkleuring enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Crystal Chem). Dezelfde eilandjes werden vervolgens overgebracht naar Krebs-Ringer-HEPES gebufferde oplossing die 25 mM glucose en insuline in het medium werd gemeten door ELISA na 1 uur incubatie.

Discussie

In dit protocol hebben we onze procedure beschreven voor de canules, collagenase perfusie en dissociatie van de muizen pancreas, met als doel het isoleren van de eilandjes van Langerhans. Technisch onze methode eenmaal beheerst, dienen van pancreas isolatie binnen 4 min van euthanasie de dieren en op 1 uur moet leiden tot de isolatie van eilandjes van een dier. De snelheid van de techniek kunnen we isoleren van eilandjes tot 12 muizen in een typisch stuk, hetgeen resulteert in de isolatie tot 3.000 eilandjes.

In tegenstelling tot andere protocollen die ruwe preparaten van collagenase gebruiken ons protocol biedt het gebruik van gezuiverde proteasen, CI zyme Collagenase MA en CI zyme BP Protease. Variaties in de samenhang van TDE preparaten die in de handel verkrijgbaar is dat elke partij afzonderlijk worden getest en geoptimaliseerd voor algemeen gebruik. Dit lot-to-lot variabiliteit leidde ons naar het gebruik van puri overwegenceerde TDES van VitaCyte. Deze sterk gezuiverde TDes worden gekenmerkt door verschillende methoden met inbegrip van het gebruik van gevoelige fluorescentie gemerkt substraat assays. De fluorescentie CDA assay is gevoelig voor verschillende moleculaire vormen van collagenase dat verschillende kinetiek in verval natief collageen. Historische peptidesubstraat testen leveren een onvolledige beoordeling van de collagenase. Kenmerkend collagenase door meerdere methoden zorgt voor een grotere enzymactiviteit tussen partijen.

Gebaseerd op onze eigen test met verschillende collagenase commercieel verkrijgbare preparaten, bleek dat het gezuiverde enzym combinaties reproduceerbaar lot-tot-lot resultaten opgeleverd. De belangrijkste voordelen van het gebruik van zeer zuiver en streng gekenmerkt TDES in deze toepassing worden eenmaal de optimale enzymsamenstelling is gedefinieerd, wordt het lot-to-lot prestaties consistentie verzekerd. Deze consistentie elimineert de arbeidsintensieve proces van veel kwalificatie vereist bij normaal gebruikvoor ruwe of verrijkte collagenase producten. Gezuiverd TDes ook een extra modificaties van de samenstelling om de opbrengst en kwaliteit van eilandjes teruggewonnen uit verschillende muizenstammen verbeteren. Rapportage optimale enzymsamenstellingen voor isolatie van eilandjes van verschillende muizenstammen kunnen veel effectiever gecommuniceerd. Dit op zijn beurt leidt tot beter gebruik van middelen en verbeterde flexibiliteit in proefopzet.

Er zijn vele kritische stappen dat het resultaat van gebruik van onze eilandje isolaties protocol kunnen beïnvloeden. De eerste is de noodzaak effectieve opblazen van de pancreas die gedurende de perfusie van het enzympreparaat. Het is belangrijk om inflatie te beginnen met zachte kracht op de spuit en de kracht als de pancreas opgeblazen verhogen. Het is nuttig om de darmen te verplaatsen en de alvleesklier te tillen tijdens het opblazen zodat de collagenase perfuses het gehele orgaan. Een andere belangrijke stap is de kracht waarmee men schudt de buizen after incubatie bij 37 ° C (Stap 2.2). We hebben gevonden dat de pancreas schudden hard tegen de schroefdop fragmentatie van eilandjes veroorzaakt, maar zonder enige vorm van mechanische dissociatie tijdens deze stap eilandje opbrengst kan aanzienlijk dalen. Het is ook noodzakelijk dat tijdens de dissociatiestap met de spuit (stap 2,5), een middel-kracht wordt uitgeoefend tijdens de op en neer beweging van de plunjer, hetgeen zorgt voor voldoende weefsel dissociatie voor de filtratiestap (2,6), waar weinig weefsel moet worden bewaard op het theezeefje filter. Ten slotte is de laatste stap zorgvuldig volgen is het streven van de gehele 20 ml van het Histopaque gefractioneerde eilandjes. Hoewel eilandjes zijn meestal op het grensvlak van de Histopaque en HBSS, hebben we ontdekt dat we eilandjes te verliezen wanneer we proberen om alleen de interface te verwijderen, in plaats daarvan hebben we nu verwijderen van de hele 20 ml met behulp van een grote boring 25 ml pipet. We hebben de filtratie door de omgekeerde 70 urn filter (stap 2.11) aan de noodzaak om cherhaaldelijk entrifuge de eilandjes weg te wassen de Histopaque.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van de Reagens	Vennootschap		Catalogus #
10X HBSS	Life Technologies	14065
RPMI	Fisher Scientific	10 tot 040
BSA	Sigma Aldrich	een
Histopaque 1077	Sigma Aldrich	10771
Histopaque 1119	Sigma Aldrich	11191
4-0 Suture 100 m rol	McKesson	451521
14 g stomp uiteinde naald	Fisher Scientific	14-8216M
Vannas Superfine schare	Fisher Scientific	501778
Gebogen Spring Schaar	Fisher Scientific	14127
Gebogen tang (2)	Fisher Scientific	15914G
Gebogen pincet (voor 90 °)	Fine Science Tools	11.052-10
27G 1/2 inch naald	Fisher Scientific	305109
30G 1/2 inch naald	Fisher Scientific	305106
PE buis	Becton Dickinson	427411
Collagenase MA	Vitacyte, LLC	001-2030
BP Protease	Vitacyte, LLC	003-1000
3 ml spuit	Fisher Scientific	309585
30 ml spuit	Fisher Scientific	309650
70 urn filter	Fisher Scientific	352350
10 cm 2 Petrischaal	Fisher Scientific	351005
Plastic theezeefje	Elke keuken levering
			Tabel 1. Reagentia en apparatuur
			Sigma type XI (L010M8618) MA (100615) BP (110,329) MA (081104) BP (100,823) MA (091211) BP (101109) 216 (± 74) 260 (± 45) 157 (± 37) 200 (± 4)
			Tabel 2. Gemiddelde eilandje opbrengst (± SD) met behulp van verschillende TDE veel * * Gegevens zijn gemiddelde islet opbrengst van ten minste 10 muizen. Lot getallen tussen haakjes