Een Galvanotaxis Assay voor Analyse van neurale precursoren celmigratie Kinetics in een extern aangelegd Direct Current Electric Field

Samenvatting

In dit protocol we zien hoe aangepaste kamers die de toepassing van een gelijkstroom elektrisch veld op time-lapse beeldvorming van volwassen hersenen afgeleide neurale voorlopercel translocatie in galvanotaxis schakelen mogelijk te construeren.

Samenvatting

De ontdekking van neurale stamcellen en progenitorcellen (gezamenlijk aangeduid neurale voorlopercellen) (NPC) in de volwassen hersenen van zoogdieren heeft geleid tot een hoeveelheid onderzoek gericht op het gebruik multipotente en proliferatieve eigenschappen van deze cellen voor de ontwikkeling van strategieën neuroregeneratieve. Een kritische stap voor het succes van deze strategieën is de mobilisatie van NPCs naar een laesie na transplantatie exogene of de reactie van de endogene precursors die worden gevonden in de periventriculaire gebied van de CNS verbeteren. Derhalve is het essentieel om de mechanismen bevordering, leiden en verbeteren NPC migratie. Ons werk richt zich op het gebruik van gelijkstroom elektrische velden (dcEFs) het bevorderen en directe NPC migratie - een fenomeen dat bekend staat als galvanotaxis. Endogene fysiologische elektrische velden functioneren als kritische aanwijzingen voor celmigratie tijdens de normale ontwikkeling en wondheling. Farmacologische verstoring van detrans-neurale buis potentieel in axolotl embryo's veroorzaakt ernstige ontwikkelingsstoornissen afwijkingen ^1. In de context van wondheling, is de snelheid van herstel van verwonde hoornvlies direct gecorreleerd met de grootte van de wond epitheliale potentieel dat ontstaat na verwonding, zoals blijkt uit farmacologische versterking of verstoring van dit dcEF ^2-3. We toonden aan dat volwassen subependymale NPCs snel en gericht kathodische migratie ondergaan in vitro bij blootstelling aan een extern aangebracht dcEF. In dit protocol beschrijven we ons lab de technieken voor het creëren van een eenvoudige en effectieve galvanotaxis test voor hoge resolutie lange termijn observatie van gericht cellichaam translocatie (migratie) op een single-cell niveau. Deze test zou geschikt zijn voor het onderzoeken van de mechanismen die in cellulaire transductie dcEF motiliteit reguleren door het gebruik van transgene of knock-out muizen, korte interfererende RNA, of specifieke receptor agonisten / antagonisten.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren behandeling werden goedgekeurd door de Universiteit van Toronto Animal Care Comite in overeenstemming met de institutionele richtlijnen (protocol nr. 20009387). De volgende methoden worden uitgevoerd met steriele instrumenten en technieken, in een laminaire stroming kap indien van toepassing.

In het protocol onderstaande tekst de uitdrukking "EFH-SFM" verwijst naar serumvrij medium, aangevuld met epidermale groeifactor, basische fibroblast groeifactor en heparine. EFH-SFM wordt gebruikt bij het ​​onderzoek naar de galvanotaxis van ongedifferentieerde NPCs omdat deze mitogenen behouden NPC's in hun ongedi....

Resultaten

Kinematische analyse blijkt dat in de aanwezigheid van een 250 mV / mm dcEF, ongedifferentieerde NPCs zeer gericht en snelle galvanotaxis naar de kathode (Figuur 5A, Movie 1) vertonen. In afwezigheid van een dcEF wordt willekeurige beweging van de cellen waargenomen (Figuur 5B, Movie 2). Dit veldsterkte> 98% van ongedifferentieerde NPCs migreren voor de gehele 6-8 hr waarvoor zij worden afgebeeld, en aangezien er dode cellen migreren niet suggereert dat zij levensvatbaar blijven gedu.......

Discussie

Dit protocol is aangepast van de reeds lang gevestigde methoden van eerdere studies ^7-9. Galvanotactic kamers kunnen worden geconstrueerd met een verscheidenheid van verschillende technieken, waaronder de bouw van een aparte glazen goed voor opsluiting van cel zaaien of met CO ₂ laser ablatie voor microfabricage van de centrale trog ^10,11. Sommige technieken kunnen omslachtiger of duurder dan andere. Wij hebben er een eenvoudige en kosteneffectieve test voor de bouw van een NPC galvanota.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van item	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
			Neurale Precursor Cell Isolation
2M NaCl	Sigma	S5886	11,688 g opgelost in 100 ml dH 2 O
1M KCl	Sigma	P5405	7,456 g opgelost in 100 ml dH 2 O
1M MgCl2	Sigma	M2393	20,33 g opgelost in 100 ml dH 2 O
155 mM NaHCO3	Sigma	S5761	1,302 g opgelost in 100 ml dH 2 O
0,5 M glucose	Sigma	G6152	9,01 g opgelost in 100ml dH 2 O
108 mM CaCl2	Sigma	C7902	1,59 g opgelost in 100 ml dH 2 O
Penicilline-streptomycine	Gibco	15070
Runderpancreas trypsine	Sigma	T1005
Schapen hyaluronidase	Sigma	H6254
Kynurenic zuur	Sigma	K3375
Ovomucoïde trypsineremmer	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% Glucose	Sigma	G6152
7,5% NaHCO3	Sigma	S5761
1M HEPES	Sigma	H3375	23,83 g opgelost in 100 ml dH 2 O
L-glutamine	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	Reconstitueer in 1 ml van hormoon mix en in 20 pi aliquot eenheden.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Einde in 0,5 ml hormoon mix en in 20 pi aliquot eenheden.
Heparine	Sigma	H3149
Apo-transferrine	R & D Systems	3188-AT	0,1 g opgelost in 4 ml 2 0 dH
Putrescine	Sigma	P7505	Los 9,61 mg in Apo-transferrine zolutie
Insuline	Sigma	I5500	Los 25 mg in 0,5 ml 0,1 N HCl en voeg 3,5 ml van 2 0 dH
Selenium	Sigma	S9133
Progesteron	Sigma	P6149
Standaard Dissectiemateriaal	Fine Science Tools
Dissectie microscoop	Zeiss	Stemi 2000
			Galvanotaxis Kamer Voorbereiding
Vierkante glazen dekglaasjes	VWR	16004
6N zoutzuur	VWR	BDH3204-1
Hoog vacuüm vet	Dow Corning
60 mm Petrischalen	Fisher Scientific	0875713A
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Ontdooien en aliquot in 150 pi-eenheden
FBS	Invitrogen	10082139	Gebruik alleen als het induceren van NPC differentiatie nodig, anders gebruikt SFM + EFH cultuur media zoals hierboven aangegeven
Tellen microscoop	Olympus	CKX41
			Leef Cell Time-Lapse Imaging
Zilverdraad	Alfa Aesar	11434
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Warmte inactiefated FBS	Sigma	16140071
PVC buis	Fisher Scientific	80000006	3/32 "ID x 5/32" OD
Bleekmiddel	Clorox
10 cc spuit	BD	309604
18 gauge naald	BD	305195
Dremel boormachine	Dremel	Model 750
Omgekeerde microscoop uitgerust met bevochtigde, bebroede kamer	Zeiss	Axiovert-200M
			Recepten Item Volume 2M NaCl 6,2 ml 1M KCl 0,5 ml 1M MgCl2 0,32 ml 155mm NaHCO3 16,9 ml 1M Glucose 1 ml 108 mM CaCl2 0,09256 ml Penicilline-streptomycine 1 ml Geautoclaveerd water 74 ml Kunstmatige cerebrospinale vloeistof Item Volume of de massa Kunstmatige cerebrospinale vloeistof 30 ml Runderpancreas trypsine 40 mg Schapen hyaluronidase 22,8 mg Kynurenic zuur 5 mg trypsine-oplossing Item Volume of de massa SFM 15 ml Ovomucoïde trypsineremmer 10 mg Trypsineremmer Solution Item Volume Geautoclaveerd water 37 ml 10X DMEM/F12 10 ml 30% Glucose 2 ml 7,5% NaHCO3 1,5 ml 1M HEPES 0,5 ml Transferrine, Putrescine oplossing 4 ml 25 mg insulineoplossing 4 ml Selenium 100 & mu; L Progesteron 100 pi Hormoon Mix (100 ml totaal, bewaar bij -20 ° C) Item Volume Geautoclaveerd water 37,5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml 30% Glucose 1 ml 7,5% NaHCO3 0,75 ml 1M HEPES 0,25 ml Hormoon mix 5 ml L-glutamine 0,5 ml Penicilline-streptomycine 0,5 ml Serum Free Media EFH-SFM: voeg 10 ul van EGF, 10 pl van FGF, en 3,66 pi van Heparine FBS-SFM: voeg 0,5 ml FBS
Item	Volume
Matrigel	150 pi
SFM	3,6 ml

Matrigel Solution Matrigel aliquot wordt geplaatst in een doos ijs en mocht langzaam ontdooien gedurende 4-5 uur om een viskeuze vloeistof te vormen alvorens te mengen met SFM. Dit zal de vorming van een gladde laag Matrigel substraat. Zo niet langzaam ontdooid, zal het resulterende substraat bevatten bosjes Matrigel eventueel belemmeren celmigratie.

Item	Volume of de massa
UltraPure Agarose	300 mg in 10 ml 2 0 ddH
SFM Hitte geïnactiveerd FBS	8 ml 2 ml

MatrigelOplossing Mix 8 ml SFM met 2 ml warmte geïnactiveerd FBS in een 15 cc falcon buis. Mix agarose met 10 ml ddH ₂ 0 in een Erlenmeyer en warmte in een magnetron gedurende 30 seconden in 10 sec-intervallen, waarbij de oplossing uit de magnetron na elke 10 sec interval en meng. Naar aanleiding van de laatste 10-sec magnetron periode, meng de agarose oplossing met de SFM / FBS oplossing en op te slaan in een 57 ° C waterbad.