Een Galvanotaxis Assay voor Analyse van neurale precursoren celmigratie Kinetics in een extern aangelegd Direct Current Electric Field

Samenvatting

In dit protocol we zien hoe aangepaste kamers die de toepassing van een gelijkstroom elektrisch veld op time-lapse beeldvorming van volwassen hersenen afgeleide neurale voorlopercel translocatie in galvanotaxis schakelen mogelijk te construeren.

Samenvatting

De ontdekking van neurale stamcellen en progenitorcellen (gezamenlijk aangeduid neurale voorlopercellen) (NPC) in de volwassen hersenen van zoogdieren heeft geleid tot een hoeveelheid onderzoek gericht op het gebruik multipotente en proliferatieve eigenschappen van deze cellen voor de ontwikkeling van strategieën neuroregeneratieve. Een kritische stap voor het succes van deze strategieën is de mobilisatie van NPCs naar een laesie na transplantatie exogene of de reactie van de endogene precursors die worden gevonden in de periventriculaire gebied van de CNS verbeteren. Derhalve is het essentieel om de mechanismen bevordering, leiden en verbeteren NPC migratie. Ons werk richt zich op het gebruik van gelijkstroom elektrische velden (dcEFs) het bevorderen en directe NPC migratie - een fenomeen dat bekend staat als galvanotaxis. Endogene fysiologische elektrische velden functioneren als kritische aanwijzingen voor celmigratie tijdens de normale ontwikkeling en wondheling. Farmacologische verstoring van detrans-neurale buis potentieel in axolotl embryo's veroorzaakt ernstige ontwikkelingsstoornissen afwijkingen ^1. In de context van wondheling, is de snelheid van herstel van verwonde hoornvlies direct gecorreleerd met de grootte van de wond epitheliale potentieel dat ontstaat na verwonding, zoals blijkt uit farmacologische versterking of verstoring van dit dcEF ^2-3. We toonden aan dat volwassen subependymale NPCs snel en gericht kathodische migratie ondergaan in vitro bij blootstelling aan een extern aangebracht dcEF. In dit protocol beschrijven we ons lab de technieken voor het creëren van een eenvoudige en effectieve galvanotaxis test voor hoge resolutie lange termijn observatie van gericht cellichaam translocatie (migratie) op een single-cell niveau. Deze test zou geschikt zijn voor het onderzoeken van de mechanismen die in cellulaire transductie dcEF motiliteit reguleren door het gebruik van transgene of knock-out muizen, korte interfererende RNA, of specifieke receptor agonisten / antagonisten.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren behandeling werden goedgekeurd door de Universiteit van Toronto Animal Care Comite in overeenstemming met de institutionele richtlijnen (protocol nr. 20009387). De volgende methoden worden uitgevoerd met steriele instrumenten en technieken, in een laminaire stroming kap indien van toepassing.

In het protocol onderstaande tekst de uitdrukking "EFH-SFM" verwijst naar serumvrij medium, aangevuld met epidermale groeifactor, basische fibroblast groeifactor en heparine. EFH-SFM wordt gebruikt bij het ​​onderzoek naar de galvanotaxis van ongedifferentieerde NPCs omdat deze mitogenen behouden NPC's in hun ongedifferentieerde toestand ^4. Bij het onderzoek van de galvanotaxis NPCs geïnduceerd om te differentiëren tot rijpe celtypen, "FBS-SFM" verwijst naar serumvrij medium aangevuld met 1% foetaal runderserum. FBS bevordert de differentiatie van NPC's in rijpe neurale fenotypes ^5.

1. Isolatie en Cultuur van Neurale Voorlopers (Nietgetoond in video)

1. Verdoven van een CD1 muizen (6-8 weken oud) met isofluorane en opoffering via cervicale dislocatie.
2. Doven het hoofd in 70% ethanol en onthoofden van het dier met scherpe dissectie schaar.
3. Terwijl de kop met chirurgische forceps, verwijder de huid op het dorsale oppervlak van de schedel bloot te leggen.
4. Met een scalpel en geen. 11 messen, scoren de schedel bij de voorhoofdsholte langs de mediolaterale as en ook langs de pijlnaad in de rostrocaudal richting.
5. Schil de pariëtale botten uit de buurt van het hoofd met geen. 7 gebogen tang, zorg ervoor dat u doorboren het hersenweefsel.
6. Steek een dunne spatel onder de hersenen vanaf onder de kleine hersenen en het bevorderen van de richting van de olfactorische bollen. Terwijl de schedel op zijn plaats met een pincet, trek de hersenen uit de schedel en onmiddellijk te plaatsen in ijskoud kunstmatige cerebrospinale vloeistof (zie recepten).
7. Onder een dissectie microscoop met sterieledissectie schaar en pincet snijd de hersenen in de helft over de middellijn. Draai elk halfrond, zodat de mediale (cut) oppervlak naar boven wijst.
8. Selecteer een halve bol, en met de mediale oppervlak naar boven, zoek de splenium van het corpus callosum (achterste gedeelte van het corpus callosum).
9. Een insnijding van het oppervlak van de cortex de splenium van het corpus callosum langs de dorsoventrale as.
10. Schillen ingesneden cortex naar de bulbus olfactorius tot de mediale en laterale wanden van de laterale ventrikel bloot.
11. Draai het halfrond, zodat het dorsale oppervlak naar boven is gericht, en gebruiken gebogen microscissors uit te snijden en het verzamelen van de blootgestelde mediale en laterale muren, die de periventriculaire regio waar NPC's wonen ⁶ bevatten.
12. Herhaal stappen 1.8-1.11 voor de andere halfrond.
13. Pipetteer de geïsoleerde weefsel in 7 ml trypsine-oplossing (zie recept hieronder) in een 15 cc tube, en plaats de buis op een rocker in een 37 ° Cincubator gedurende 25 min.
14. Centrifugeer het buisje bij 1500 rpm gedurende 5 min, zuig de supernatant en resuspendeer het weefsel in 2 ml trypsine inhibitor oplossing (zie recept).
15. Voorzichtig het weefsel voorzichtig fijnstampen met een klein boorgat Pasteur pipet 30 tot 50 keer om luchtbellen te voorkomen.
16. Centrifugeer het buisje bij 1500 rpm gedurende 5 min, zuig de supernatant en resuspendeer in 1-2 ml SFM (zie recept) door tritureren de pellet 3-5 keer.
17. Centrifugeer het buisje bij 1500 rpm gedurende 3 min, aspireer het supernatant en resuspendeer in 1 ml SFM + EFH.
18. Tellen leven celdichtheid met een hemocytometer en plaat cellen in een T25 kweekkolf bij een dichtheid van 10 cellen per ul in SFM + EFH.
19. Laat de cultuur te groeien gedurende 7 dagen ongestoord aan vrij zwevende primaire neurosferen bestaat uit NPCs opleveren.

2. Galvanotaxis Kamer Voorbereiding

1. Plaats 3 vierkante glas niet. 1 dekglaasjes (22 x 22 x 0,17 mm) ina fles 6 N zoutzuur 's nachts.
2. De volgende dag met een diamant-tip glas-cutter tot 6 rechthoekige stroken (22 x 5 x 0,17 mm) van glas gesneden van niet vierkant. 1 dekglaasjes.
3. Breng de zuurgewassen vierkante en rechthoekige slips glijdt in een laminaire stroming kap. Was de rechthoekige en vierkante strips eerst met 70% ethanol dan, met weefselkweek-grade geautoclaveerd water en laten drogen op een Kim Wipe (voor extra steriliteit, kan het glas worden toegestaan ​​aan de lucht drogen).
4. Toepassing vacuum vet aan de omtrek van een oppervlak van het vierkant objectglaasjes en verzegelen met de basis van 60 mm plastic petrischalen.
5. Toepassing vacuum vet langs de lengteas van een oppervlak van de rechthoekige glazen strips en verzegelen om de randen van de vierkante objectglaasjes (zodanig dat zij evenwijdig aan elkaar) om een ​​centrale trog maken.
6. UV-steriliseer de kamers ten minste 15 min in de laminaire flow kast.
7. Pipetteer 250-300 pl poly-L-lysine op de centrale holte van de kamers en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
8. Ongeveer 15 min vóór het einde van de incubatieperiode bereiden Matrigel oplossing (zie recept).
9. Zuig het poly-L-lysine, was de centrale troggen met 1 ml van geautoclaveerd water en pipet 250-300 pi Matrigel oplossing op de centrale troggen.
10. Incubeer de kamers bij 37 ° C gedurende 1 uur.
11. Zuig het Matrigel oplossing en voorzichtig de centrale troggen wassen met 1-2 ml SFM.
12. Pipetteer 100 ul van EFH-SFM of FBS-SFM op de centrale troggen en breng de galvanotaxis kamers op het toneel van een tellende microscoop.
13. Pipetteer 3-4 ml van de neurosfeer cultuur bevattende in een 60 mm petrischaal en breng de petrischaal in het stadium van het tellen microscoop.
14. Op een bezichtiging doel van 5x, gebruik maken van een P10 pipet tot 5-8 gehele neurosferen (maximaal vier per keer) over te dragen op de centrale dal van elk galvanotaxiskamer zonder dissociëren ze, en voorzichtig uit de neurosferen rond de centrale trog zonder verstoring van de Matrigel substraat.
15. Voeg een extra 150 tot 200 ul van EFH-SFM of FBS-SFM op de centrale dalen.
16. Breng de galvanotaxis kamers in een 37 ° C, _5% CO2, 100% bevochtigde incubator voor 17-20 uur (indien analyseren ongedifferentieerde NPC) om de neurosferen te houden aan de Matrigel substraat en in enkele cellen los zoals getoond in figuur 1 . Als analyse gedifferentieerde NPCs dient de incubatietijd te worden verlengd tot 69-72 uur om de differentiatie van de cellen mogelijk.

3. Leef Cell Time-Lapse Imaging

1. De live cell imaging systeem equilibreren bij 37 ° C, _5% CO2 gedurende ten minste 30 minuten voor aanvang van de time-lapse opname.
2. Knip twee 12 cm stukken van 1 mm diameter Zilver draad, spoel ze van het ene uiterste, en plaats ze in Clorox bLeach gedurende 20 min tot Ag / AgCl elektroden vormen.
3. Breng de galvanotaxis kamers op het stadium van een microscoop geteld en selecteren welke kamer wordt gebruikt voor live-cell imaging migratie analyse gebaseerd op de volgende criteria: i) de neurosferen moet bijna volledig gedissocieerd tot afzonderlijke cellen en ii) de cellen moeten beschikken ronde morfologie met weinig tot geen processen die zich vanaf de cellichamen.
4. Overdracht van de geselecteerde galvanotaxis kamer in een laminaire stroming kap, maar ook een afzonderlijk vierkante no. 1 glas dekglas en vacuüm vet.
5. Was de afdekkap slip met 70% ethanol dan met geautoclaveerd water en breng een strook vacuum vet op twee parallelle randen van het dekglaasje.
6. Zuig het kweekmedium van de centrale dal van de kamer, dan snel plaats het deksel slip (vet-kant naar beneden) op de kamer, zodat het vet strips rusten op de twee parallelle rechthoekige glazen stroken effectief, een dak makennaar de kamer.
7. Pipetteer 100 ul van verse EFH-SFM of FBS-SFM in de centrale trog via capillaire werking.
8. Gebruik vacuum vet grenzen voor pools van kweekmedia maken op elk uiteinde van de centrale goot, zoals weergegeven in figuur 2.
9. Knip twee 15 cm stukken van PVC-buizen, en gebruik een 10 cc spuit met een 18 gauge naald aan agarose oplossing zorgvuldig te injecteren in de slang, zodat er geen luchtbellen ontstaan ​​in de buizen, en laat de gel te stollen gedurende 5 minuten.
10. Breng de galvanotaxis kamer naar de live cell imaging systeem, samen met de agarose gel buizen, Ag / AgCl elektroden en een paar lege 60 mm petrischalen die wordt gebruikt als kweekmedium reservoirs en bevat de Ag / AgCl elektroden. Laat de galvanotaxis kamer te rusten binnen de 37 ° C, _5% CO2 omgeving voor 20-30 min.
11. Gedurende deze tijd, de voorbereiding van de deksels van de 2 lege petrischalen en het deksel van de petrischaal galvanotaxis kamer is door het boren van gatenin hen met een Dremel of iets dergelijks zoals getoond in figuur 3.
12. Pipetteer 1 tot 1,5 ml EFH-SFM of FBS-SFM op beide zijden van de centrale trog en 7-8 ml SFM in elke lege petrischaal. Plaats een petrischaal aan elke kant van de centrale galvanotaxis kamer van de trog en plaats een Ag / AgCl elektrode in elk gerecht. De kloof tussen de galvanotaxis kamer en de petrischalen op elektrische continuïteit te leggen met de agarose gel bruggen, zoals weergegeven in figuur 4.
13. Sluit de Ag / AgCl elektroden op een externe voeding, met een ampèremeter in serie met elektrische stroom te meten, en schakel de voeding. Gebruik een voltmeter om de sterkte van het elektrische veld meten direct aan de centrale trog en het uitgangsniveau van de voeding totdat de gewenste elektrische veldsterkte bereikt (de assays uitgevoerd in dit laboratorium gebruik van een dcEF sterkte van 250 mV / mm met elektrische stroom tussen de 1 en 1,5 mA).
14. Initiate de time-lapse-module op de live-cell imaging systeem, en dat het experiment uit te voeren voor de gewenste hoeveelheid tijd. Na voltooiing van de test vast de cellen in 4% paraformaldehyde voor standaard immunokleuring analyse.

Resultaten

Kinematische analyse blijkt dat in de aanwezigheid van een 250 mV / mm dcEF, ongedifferentieerde NPCs zeer gericht en snelle galvanotaxis naar de kathode (Figuur 5A, Movie 1) vertonen. In afwezigheid van een dcEF wordt willekeurige beweging van de cellen waargenomen (Figuur 5B, Movie 2). Dit veldsterkte> 98% van ongedifferentieerde NPCs migreren voor de gehele 6-8 hr waarvoor zij worden afgebeeld, en aangezien er dode cellen migreren niet suggereert dat zij levensvatbaar blijven gedu...

Discussie

Dit protocol is aangepast van de reeds lang gevestigde methoden van eerdere studies ^7-9. Galvanotactic kamers kunnen worden geconstrueerd met een verscheidenheid van verschillende technieken, waaronder de bouw van een aparte glazen goed voor opsluiting van cel zaaien of met CO ₂ laser ablatie voor microfabricage van de centrale trog ^10,11. Sommige technieken kunnen omslachtiger of duurder dan andere. Wij hebben er een eenvoudige en kosteneffectieve test voor de bouw van een NPC galvanota...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van item	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
			Neurale Precursor Cell Isolation
2M NaCl	Sigma	S5886	11,688 g opgelost in 100 ml dH 2 O
1M KCl	Sigma	P5405	7,456 g opgelost in 100 ml dH 2 O
1M MgCl2	Sigma	M2393	20,33 g opgelost in 100 ml dH 2 O
155 mM NaHCO3	Sigma	S5761	1,302 g opgelost in 100 ml dH 2 O
0,5 M glucose	Sigma	G6152	9,01 g opgelost in 100ml dH 2 O
108 mM CaCl2	Sigma	C7902	1,59 g opgelost in 100 ml dH 2 O
Penicilline-streptomycine	Gibco	15070
Runderpancreas trypsine	Sigma	T1005
Schapen hyaluronidase	Sigma	H6254
Kynurenic zuur	Sigma	K3375
Ovomucoïde trypsineremmer	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% Glucose	Sigma	G6152
7,5% NaHCO3	Sigma	S5761
1M HEPES	Sigma	H3375	23,83 g opgelost in 100 ml dH 2 O
L-glutamine	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	Reconstitueer in 1 ml van hormoon mix en in 20 pi aliquot eenheden.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Einde in 0,5 ml hormoon mix en in 20 pi aliquot eenheden.
Heparine	Sigma	H3149
Apo-transferrine	R & D Systems	3188-AT	0,1 g opgelost in 4 ml 2 0 dH
Putrescine	Sigma	P7505	Los 9,61 mg in Apo-transferrine zolutie
Insuline	Sigma	I5500	Los 25 mg in 0,5 ml 0,1 N HCl en voeg 3,5 ml van 2 0 dH
Selenium	Sigma	S9133
Progesteron	Sigma	P6149
Standaard Dissectiemateriaal	Fine Science Tools
Dissectie microscoop	Zeiss	Stemi 2000
			Galvanotaxis Kamer Voorbereiding
Vierkante glazen dekglaasjes	VWR	16004
6N zoutzuur	VWR	BDH3204-1
Hoog vacuüm vet	Dow Corning
60 mm Petrischalen	Fisher Scientific	0875713A
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Ontdooien en aliquot in 150 pi-eenheden
FBS	Invitrogen	10082139	Gebruik alleen als het induceren van NPC differentiatie nodig, anders gebruikt SFM + EFH cultuur media zoals hierboven aangegeven
Tellen microscoop	Olympus	CKX41
			Leef Cell Time-Lapse Imaging
Zilverdraad	Alfa Aesar	11434
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Warmte inactiefated FBS	Sigma	16140071
PVC buis	Fisher Scientific	80000006	3/32 "ID x 5/32" OD
Bleekmiddel	Clorox
10 cc spuit	BD	309604
18 gauge naald	BD	305195
Dremel boormachine	Dremel	Model 750
Omgekeerde microscoop uitgerust met bevochtigde, bebroede kamer	Zeiss	Axiovert-200M
			Recepten Item Volume 2M NaCl 6,2 ml 1M KCl 0,5 ml 1M MgCl2 0,32 ml 155mm NaHCO3 16,9 ml 1M Glucose 1 ml 108 mM CaCl2 0,09256 ml Penicilline-streptomycine 1 ml Geautoclaveerd water 74 ml Kunstmatige cerebrospinale vloeistof Item Volume of de massa Kunstmatige cerebrospinale vloeistof 30 ml Runderpancreas trypsine 40 mg Schapen hyaluronidase 22,8 mg Kynurenic zuur 5 mg trypsine-oplossing Item Volume of de massa SFM 15 ml Ovomucoïde trypsineremmer 10 mg Trypsineremmer Solution Item Volume Geautoclaveerd water 37 ml 10X DMEM/F12 10 ml 30% Glucose 2 ml 7,5% NaHCO3 1,5 ml 1M HEPES 0,5 ml Transferrine, Putrescine oplossing 4 ml 25 mg insulineoplossing 4 ml Selenium 100 & mu; L Progesteron 100 pi Hormoon Mix (100 ml totaal, bewaar bij -20 ° C) Item Volume Geautoclaveerd water 37,5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml 30% Glucose 1 ml 7,5% NaHCO3 0,75 ml 1M HEPES 0,25 ml Hormoon mix 5 ml L-glutamine 0,5 ml Penicilline-streptomycine 0,5 ml Serum Free Media EFH-SFM: voeg 10 ul van EGF, 10 pl van FGF, en 3,66 pi van Heparine FBS-SFM: voeg 0,5 ml FBS
Item	Volume
Matrigel	150 pi
SFM	3,6 ml

Item	Volume of de massa
UltraPure Agarose	300 mg in 10 ml 2 0 ddH
SFM Hitte geïnactiveerd FBS	8 ml 2 ml