Imaging Calcium Reacties in GFP-gelabelde neuronen van de hypothalamus Mouse Brain Slices

Samenvatting

In dit protocol, updaten we de recente vooruitgang in de beeldvorming Ca ^{2 +} Signalen van GFP-gemerkte neuronen in hersenweefsel plakjes met een rode fluorescerende Ca ^{2 +} Indicator kleurstof.

Samenvatting

Ondanks de enorme toename van de kennis van de onderliggende mechanismen van het coderen van informatie in de hersenen, een centrale vraag over de precieze moleculaire stappen en de activiteit van bepaalde neuronen in multifunctionele kernen van hersengebieden zoals de hypothalamus blijven. Dit probleem omvat de identificatie van de moleculaire componenten betrokken bij de regulatie van verschillende neurohormoon signaalcascades. Verhogingen van de intracellulaire Ca ^{2 +} spelen een belangrijke rol in het reguleren van de gevoeligheid van neuronen, zowel op het niveau van signaaltransductie en synaptische plaatsen.

Nieuwe instrumenten ontstaan ​​om neuronen in de veelheid van hersenneuronen identificeren door expressie green fluorescent protein (GFP) onder de controle van een specifieke promotor. Om zowel ruimtelijk als tijdelijk stimulus-geïnduceerde Ca ^{2 +} volgen responsen in GFP-gelabelde neuronen, een niet-green fluorescent Ca ^{2 +} n indicatorkleurstofeeds worden gebruikt. Bovendien is een confocale microscopie favoriete methode imaging individuele neuronen in weefselcoupes vanwege zijn vermogen om neuronen in verschillende vlakken diepte visualiseren in het weefsel en out-of-focus fluorescentie beperken. De ratiometrische Ca ^{2 +} indicator fura-2 werd gebruikt in combinatie met GFP-gelabelde neuronen ^1. Echter wordt de kleurstof geëxciteerd door ultraviolet (UV) licht. De kosten van de laser en de beperkte optische indringdiepte van UV licht belemmerd het gebruik in vele laboratoria. Bovendien kan GFP fluorescentie interfereren met de fura-2 signalen ^2. Daarom was een rode fluorescerende ^{Ca2 +} indicator kleurstof te gebruiken. De enorme Strokes verschuiving van fura red-maakt multicolor analyse van het rode fluorescentie in combinatie met GFP met een excitatiegolflengte. We hadden eerder goede resultaten met behulp van fura-rood in combinatie met GFP-gemerkte olfactorische neuronen ^3. De protocollen voor olfactorische weefselcoupes leek te e werkenqually goed in de hypothalamus neuronen ^4. Fura-red gebaseerd Ca ^{2 +} imaging werd eveneens met succes in combinatie met GFP-gelabelde pancreatische β-cellen en GFP-gemerkte receptoren tot expressie gebracht in HEK cellen ^5,6. Een beetje gril van fura-rood is dat de fluorescentie-intensiteit bij 650 nm is lager dan de indicator bindt calcium ^7. Daarom is de fluorescentie van rustende neuronen met lage ^{Ca2 +} concentratie relatief hoge intensiteit. Er zij opgemerkt dat andere rode Ca ^{2 +-indicatorkleurstoffen} bestaan ​​of zijn in ontwikkeling, zou dat een beter of betere resultaten in verschillende neuronen en hersengebieden.

Protocol

1. Bereiding van de oplossing en Agarose Gel

1. Bereid extracellulaire oplossing volgens de tabel met tweemaal gedestilleerd water. De pH is 7,3 ~ na 10 min beluchting met carbogen _(95% O2 / 5% CO _2), de osmolariteit 300 mOsm ^8. Indien een hogere osmolariteit vereist is, kan worden aangepast door meer glucose (1 mM gelijk aan 1 mOsm). De oplossing wordt tweemaal gefilterd met een 0,2 pm membraan filter om stofdeeltjes en mogelijke bacteriële besmettingen voorkomen.

Naam van het reagens	Afkorting	Mol. gewicht	Conc.	Vennootschap	Cat. N °
Natriumchloride	NaCl	58,44 g / mol	120 mM	VWR	27810
Natriumwaterstofcarbonaat	NaHCO3	84,01 g / mol	25 mM	Merck	106329
Kaliumchloride	KCl	74,55 g / mol	5 mM	Merck	104936
BES *	C 6 H 15 NO 5 S	213,25 g / mol	5 mM	Sigma	14853
Magnesiumsulfaat, watervrij	MgSO4	120,37 g / mol	1 mM	Sigma	M7506
Calciumchloridedihydraat	CaCl * 2H 2 O	147,02 g / mol	1 mM	Merck	102382
D (+)-glucosemonohydraat	C 6 H 12 O 8 * H 2 O	198,17 g / mol	10 mM	Merck	108342

*N, N-Bis (2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonic acid

2. De oplossing wordt bewaard bij 4 ° C, maar moet worden belucht met carbogen _(95% O2 / 5% CO ₂₎ gedurende 10 minuten voor gebruik.
3. Op dit moment ook bereiden ¹ cm3 blokken agar gel naar de hersenen stabiliseren tijdens het snijden procedure (zie stap 3). Eerst Los 4% (w / v) agar (Sigma) in dubbel gedestilleerd water door verwarmen van de oplossing tot ongeveer 60 ° C. De verwarmde opgeloste agar oplossing wordt uitgegoten in een vierkante petrischaal met een hoogte van 1 cm. Na afkoelen en uitharden wordt de 4% agar gel gesneden in blokjes van 1 cm ^3. Deze blokken worden opgeslagen tot 4 weken bij 4 ° C.

2. Dissectie van de hersenen van muizen

Zorg ervoor dat alle dierlijke experimentele procedures worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die door de comites voor dierenwelzijn van de respectieve instellingen.

1. Voordat sacrificing het dier, zorg ervoor dat de agargel blokken klaar zijn voor gebruik.
2. Verdoven de muis met isofluraan (1-4% isofluraan in zuurstof met een precisie vaporizer ongeveer 1 min). Het is belangrijk om hypoxie en daarom neuronale schade. Een nadeel van isofluraan is de kosten en de logistiek van het gebruik van precisie vaporizers. Een fatale overdosis in een open systeem zou een alternatief zijn, aangezien de muis worden opgeofferd. Veiligheid is in dit geval een ernstig probleem. De isofluraan moet direct worden afgevoerd uit de kamer. Daarom moet een overdosis in een open systeem worden uitgevoerd in een zuurkast.
3. Euthanaseren de muis door onthoofding na controle van de diepte van de anesthesie door het testen van de achterste voet reflex. Dit pedaal of poot snuifje reflex wordt uitgevoerd door stevig knijpen een poot of teen tussen je vingers om een ​​respons van terugtrekken door het dier te lokken. Een dier dat een reflex laat zien is niet op een chirurgische niveau van anesthesie en zeker niet ineen staat om euthanaseren.
4. Na onthoofding, de hoofdhuid centraal gesneden met een enkele rand scheermesje in sagittale richting, van de frontale bot naar de externe achterhoofdsknobbel. Verplaats de twee delen van de hoofdhuid, eerst van de mediale caudale uiteinde in rostrale dwarsrichting dan in ventraal (Figuur 1A-C).
5. Maak twee laterale en een rostrale verlaging van het foramen magnum met een kleine veer schaar (zie voor het snijden van de richting van de zwarte gestippelde pijlen in figuur 1C). Voorzichtig aanhangen uit de schedel van mediocaudal om laterale rostrale met stompe pincet (zie brede grijze pijlen in figuur 1C). Bij oudere dieren een kleine snee in de pijlnaad is nuttig en vaak noodzakelijk om te voorkomen dat schadelijke corticale lagen van de hersenen.
6. Op dit moment is de occipitale, interparietal en pariëtale botten moeten worden losgemaakt. Indien nog aanwezig is, moet de dura mater voorzichtig verwijderd met forceps om schade aan de br voorkomenain in de volgende stap.
7. Neem de squamosal bot, de voorste ethmoïdale en frontale foramen (figuur 1D).
8. De hersenen kunnen nu gemakkelijk worden verwijderd met een omgekeerde micro lepel spatel en doorsnijden de schedelzenuwen (figuur 1E).

3. Snijden Coronale hypothalamus Delen van de hersenen van muizen

1. Plaats de hersenen op de buikzijde op snijvast ondergrond en verwijder het cerebellum een beugelmes (Figuur 2A). Deze rechte snede oppervlak zal de basis vormen voor het monteren van de hersenen op een bord, zodat het snijden van coronale hersenen secties.
2. Lijm de hersenen met de doorsnede op de basisplaat van de microtoom (Zeiss, Hyrax V50) met behulp van kleine hoeveelheden van een snel uithardende hoogwaardige cyanoacrylaat lijm superlijm (Loctite 406; Figuur 1A). Bovendien lijm een 1 cm ³ agar gel blok (zie 1.5) aan de ventrale zijde van de hersenen (zie 'v' in Figuur 2B) op de basisplaat van de microtoom (Zeiss, Hyrax V50) te ondersteunen en te herstellen de hersenen tijdens het snijden. Zorg ervoor dat niet te veel lijm gebruiken, in die lijm doorkruist tussen hersenen en gel blok veroorzaakt problemen bij het verwijderen van weefsel plakjes na de cut te ontwijken. De gel blok zich aan de andere kant van het snijblad van de microtoom (Figuur 2B).
3. Na een paar seconden de band droog is, zet de plaat in het bad van uw microtoom gevuld met 6 ° C koud zuurstofrijk (95% O _2/5% CO ₂₎ extracellulaire oplossing (zie 1.1).
4. Gebruik de juiste lage snelheid snijden en snijd 300 urn dikke plakken. Bij onze microtoom we een frequentie van 60 Hz, een amplitude van 0,8 mm en een snelheid van 0,8 mm / s (Figuur 2C). De coronale hersencoupes worden ofwel direct verzameld na elke snede of kan worden achtergelaten in het bad tot de gehele hersenen is gesegmenteerd. De coronale hersencoupes worden zorgvuldig Transferred een beker met koud geoxygeneerd extracellulaire oplossing. Diverse gereedschappen zijn ontworpen om de overdracht (bijvoorbeeld cut breed plastic of glazen Pasteurpipetten of brede lepel spatels) uit te voeren. Het hangt van de experimentator die de voorkeur. Het belangrijkste is dat de plakjes zodanig worden gehanteerd schade te minimaliseren.
5. Als de microtoom kan worden geprogrammeerd om automatisch afgesneden plakjes, kunt u beginnen met de Ca ^{2 +-indicator} kleurstof laden oplossing te bereiden op dit moment. Anders wordt aanbevolen de bereiding van deze oplossing wordt uitgevoerd voordat de hersenen snijden beëindigd om vertragingen te minimaliseren voor het meten van Ca ^{2 +} responsen in de neuronen, namelijk voordat stap 2.

4. Bereiding van de Ca ^{2 +} indicatorkleurstof geladen Solution

Een kritische stap bij het laden neuronen blijft vaak de gezondheid van de cellen is afhankelijk van de hoeveelheid schade geïnduceerd door de snelheid vande dissectie procedure. Een essentiële stap lijkt het gebruik van verse Pluronic F-127 oplossing (zie 4.1). Het wordt aanbevolen om deze oplossing te maken in het laboratorium en niet op een premade oplossing van een leverancier gebruikt. Afhankelijk van de temperatuur, de vochtigheid en de levensduur van de plank Pluronic F-127 oplossing we opgemerkt afbraak van geur en hersenen neuronen tijdens de Ca ^{2 +} laadprocedure.

1. Bereid de 20% (w / v) Pluronic F-127 (Sigma) in dimethylsulfoxide (DMSO) door toevoeging van Pluronic F-127 poeder bovenop de DMSO oplossing. Direct ultrasone trillingen deze oplossing zonder voorafgaande vortex of mengen. Binnen 2 minuten sonificeren de Pluronic F-127 wordt opgelost. 100 pi Pluronic F-127 oplossingen worden bereid Wekelijkse.
2. Neem een ​​tube van 50 ug cel-permeabele fura-red/AM (Invitrogen, AM, acetoxymethylester) en voeg 5 pl 20% Pluronic F-127 oplossing. Meng de oplossing met behulp van de punt van de pipet.
3. Voeg 45 ul extracellulaire Solutiop (zie 1.1) aan de mix en vortex het binnenkort.
4. Een extra 325 ul extracellulaire oplossing en ultrasone trillingen de buis gedurende 3 minuten.
5. Na sonicatie voeg 1,156 ml geoxygeneerde _(95% O2 / 5% CO ₂₎ extracellulaire oplossing uiteindelijke Ca ^{2 +} indicatorkleurstof loading oplossing (30 uM fura-red/AM, 0,33% DMSO en 0,065% Pluronic F-127) krijgen . Bewaar de buis in een donkere plaats tot gebruik (zie 4.8).
6. Breng de coronale hersenplakjes een 6-well celkweekplaat (BD Falcon) gevuld met geoxygeneerde _(95% O2 / 5% CO ₂₎ extracellulaire oplossing (tot zes segmenten per well).
7. Zuigen uit de geoxygeneerde extracellulaire oplossing uit de kamers van de 6-wells plaat zorg ervoor dat u de hersenen plakjes beschadigen.
8. Pipet rechtstreeks 750 ul van de Ca ^{2 +} indicatorkleurstof loading oplossing elke well. De hersenen plakjes moeten worden gedekt door de oplossing die fura-red/AM (onderdompeling laden).
9. Incubate de plakken in een O ₂ / CO ₂ celkweek incubator (O _2: 23,5%; CO _2: 5%) gedurende 45 tot 60 min bij 37 ° C.
10. Aan het einde van de incubatie, plaats de Ca ^{2 +} indicatorkleurstof loading oplossing verse zuurstof extracellulaire oplossing om overbelasting van de cellen met fura-rood en beïnvloeden op subtiele wijze de Ca ^{2 +} meting via de chelerende werking van de kleurstof. Vervolgens worden de schijfjes worden bewaard in de O ₂ / CO ₂ incubator (zie voorgaande punt voor instellingen) tot gebruik levensvatbaar gedurende tot 3-6 uur.

5. Microscopie en analyse

In dit protocol wordt de fluorescentie-intensiteit van GFP, waardoor de cel van interesse identificeert, en de Ca ^{2 +} indicator kleurstof gelijktijdig gemeten in hersencoupes. Daarom moet de confocale microscoop uitgerust met de juiste laser, filters en twee fotovermenigvuldigingsbuizen de twee emissi verzamelenop signalen. GFP en de verandering in fluorescentie-intensiteit van fura-rood kan worden gemeten met een golflengte van 488 nm. Emissie fluorescentie van de fluoroforen kunnen worden verzameld met een 522/DF35 nm filter voor GFP en een long pass filter bij een golflengte groter dan 600 nm voor fura-rood.

1. Om de bewaking stimulus geïnduceerde veranderingen in de fluorescentie signaal dat een maat is voor de intracellulaire ^{Ca2 +} concentratie, start een van de fura red-loaded hersencoupes overgebracht naar een opname kamer (ie Warner Instruments RC-27 Open Bath kamer) die gemonteerd kan worden op de confocale microscoop setup (Figuur 3A, B).
2. Zet de hersenen plak met een harp (figuur 3C) om het segment te verplaatsen door de perfusie snelheid van de badoplossing voorkomen (zuurstofhoudende extracellulaire oplossing, zie stap 1.1). De harp (slice houder) is gemaakt van een parallelle reeks nylon draden (van elkaar gescheiden door ~ 1 mm) geregeneen U-vorm zilver of platina frame. De temperatuur van het bad oplossing in deze stap dient ten minste kamertemperatuur zijn. Indien hogere temperaturen nodig, passende zorg moet worden genomen om condensvorming aan microscoop lenzen en beweging van het vlak van focus als gevolg van verschuiving onderdelen in de microscoop.
3. Perfuseren de plak gedurende 10 min met zuurstof extracellulaire oplossing op een overschot van ^{extracellulair} Ca2 ⁺ indicator kleurstof te verwijderen. De stroomsnelheid van de perfusie moet worden aangepast aan ~ 100 ul / s (tips betrekking tot een passend perfusiesysteem zie ^9).
4. Kijk naar de slice door de microscoop bij een lage vergroting, een notitie maken van de oriëntatie van de plak voor uw administratie en vind uw gebied van interesse in de plak, in ons geval de hypothalamus gebied in de hersenen.
5. Veranderen hoge vergroting en vind de cel van interesse in het segment door het verzamelen GFP beelden en gelijktijdig controleren van de fluorescentie-intensiteit van de fura-redsignaal (Figuur 4A-C). Cellen in de buurt van het oppervlak kan beschadigd raken of dood. Daarom moeten de cellen op een diepte van meer dan 10 pm worden geselecteerd voor imaging. We betrouwbaar kon cellen te meten tot een diepte van 40-50 pm, waarna de signaalsterkte begon te dalen. Herinner dat de fura-rode signaal van cellen in rust laag ^{Ca2 +} concentratie relatief hoge fluorescentie-intensiteiten hebben. Deze hoge fluorescentie-intensiteit is in dit geval geen teken van dode cellen. De GFP signaal kan worden gebruikt om een drift of beweging van het weefsel segment of als indicator voor veranderingen in intracellulaire pH ¹⁰ detecteren.
6. Stel het laservermogen op een waarde die gemeten in de verandering van fura-rode fluorescentie maakt en voorkomt bleken van de twee fluoroforen. Derhalve beginnen met de laagste laservermogen en pas een voldoende signaal-ruisverhouding te verkrijgen door het veranderen zwartniveau (offset), detector diafragma, versterking en laser grijsfilters. Behalve het laservermogen moet hetzelfde worden gedaan voor het GFP-signaal.
7. Start om beelden met een snelheid te verwerven tussen de 0,5 - 2 Hz tot de fura-rood en GFP-signalen te verzamelen. De opnamesnelheid moet worden geoptimaliseerd de verwachte snelheid van de ^{Ca2 +} signaal. Spanningsafhankelijke Ca ^{2 +} spikes kan sneller en korter transiënten dan activering van sommige signaaltransductiecascades vereist activering van de verschillende second messengers veroorzaken. De lengte van de beeldopname moet geschikt zijn voor het doel van het experiment. Het GFP-signaal tijd helpen bepalen of beweging van de hersenen slice opgetreden.
8. Tijdens de verwerving en het experiment, alle aftastkop instellingen moeten constant worden gehouden om betrouwbare resultaten die kunnen worden vergeleken op te nemen.
9. De veranderingen in fluorescentie in de tijd kunnen worden geanalyseerd met verschillende wiskundige programma's, namelijk ImageJ (NIH, Bethesda, MD; http:/ / Rsb.info.nih.gov / ij /), Igor Pro (Wavemetrics) of MatLab (The MathWorks). Door rondom de somata van een GFP-gelabeld neuron geeft het gebied van belang (ROI) kan precies dezelfde regio worden geanalyseerd voor veranderingen in Ca ^{2 +} met de fura-rode fluorescentie signaal tijd.

Ca ^{2 +-signalen} kan als willekeurige fluorescentie-eenheden of als waarden (AF / F) van de relatieve verandering in fluorescentie-intensiteit (AF), genormaliseerd naar de basislijn fluorescentie (F). Deze procedure resulteert in een negatieve uitslag wanneer de intracellulaire ^{Ca2 +} concentratie toeneemt met fura-rood als Ca ^{2 +} indicator kleurstof. De interpretatie van de resultaten te vergemakkelijken, raden vermenigvuldigen de AF / F waarde met -1 positieve fluorescentiesignalen verkrijgen tot een toename ⁱⁿ Ca2 ⁺ (figuur 4C) weer.

Om resultaten te vergelijken tussen neuronen de amplitude en de frequentie van de Ca ^{2 + signalen worden meestal geanalyseerd. Maar sommige Ca2 +-signalen niet op een regelmatige periode of vergelijkbare amplitudes. Sommige signalen kunnen sterk worden beïnvloed door stochastische processen in de cel. Dus tot de totale verandering in Ca 2 + kwantificeren in een vak en een vergelijking van Ca2 + kunnen reacties tussen neuronen in verschillende hersengebieden, analyse van het gebied onder de curve (AUC) geschikter. Deze maat voor de hoeveelheid Ca2 + omvat een eerste Ca 2 + voorbijgaand tweede fase en langdurige verhoogde Ca 2 + reacties en oscillaties. In dit geval moet worden gezorgd voor dezelfde periode analyseren om de vergelijking tussen neuronen mogelijk te maken.}

6. Representatieve resultaten

Om te beginnen het karakteriseren van gonadotropin releasing hormone receptor (GnRHR) uitdrukken neuronen in de hypothalamus hebben we gebruik gemaakt van transgene muizen die uitdrukking GFP na Cre-gemedieerde excisie in GnRHR-expressie neuronen ^4,11. GFP fluorescentie neuronen werden geïdentificeerd in verschillende hersengebieden, zoals de hypothalamus. De fysiologische eigenschappen van deze neuronen GnRHR onderzoeken we eerst beschreven ^{Ca2 +} signalen in hypothalamus plakken met een confocale microscoop. Eerst hebben we coronale hersenplakjes verkregen uit deze muizen met de hierboven beschreven protocol. Figuur 1 illustreert de benodigde gereedschappen, materialen en stappen voor het uitsnijden van een muizenhersenen. De coronale hypothalamus hersencoupes werden gesneden (figuur 2) en vervolgens geladen volgens de stappen in punt 4 van het protocol. Single hersenen deel van het betreffende gebied worden in een opname kamer bevestigd met een harp (figuur 3) en afgebeeld met een confocale microscoop (zie stappen 5.1-5.9). Figuur 4 toont een voorbeeld van twee afzonderlijke coronale hersenplakjes identificeren van enkele GnRHR-τGFP cellichamen, de fluorescentie in rust na loading de hersenen segment met fura-red/AM en de samengevoegde confocaal beeld aangeeft dat de GFP neuron had voldoende mate fura-rood onderzoek stimulus geïnduceerde ^{Ca2 +-signalen} kunnen in deze cellen. Met onze protocol we eerst getest of GnRHR neuronen vergelijkbare Ca ^{2 +} signalen gebruiken voor detectie stimulus in verschillende gebieden van de hypothalamus in reactie op directe activering met GnRH (figuur 4E). Echter deze signalen verschilden in hun golfvorm afhankelijk stimulus sterkte en hersengebied ^4. De verandering in de dynamiek van de Ca ^{2 +} te kwantificeren, het gebied onder de curve (AUC) berekend worden als een maat voor de toename van de intracellulaire Ca ^{2 +} (Figuur 4E) ^4. Studies zijn momenteel aan de gang om de moleculaire basis die ten grondslag liggen van de Ca ^{2 +} golven en trillingen, hun afhankelijkheid van geslacht en hormonale status van het dier te onderzoeken, en of ze kan worden gemoduleerddoor andere natuurlijke stimuli.

Figuur 1. Gereedschap, materiaal en stappen voor het uitsnijden van een muis hersenen. A. Gereedschappen en materialen die worden gebruikt voor de hersenen dissectie: 1, Loctite 406 superlijm, 2, micro lepel spatel, 3, enkele rand scheermesje, 4, kleine en middelgrote lente schaar, 5, stompe tang, 6, schaar, 7, petrischaal met agar gel blok, 8, bodemplaat voor montage hersenen in microtoom. BF. Foto's van een aantal stappen die worden beschreven in punt 2 van het protocol. B. Foto van een muis hoofd aanduiding van de snijpositie van de hoofdhuid (rode lijn) en pijlen (oranje) die de richting van de huid moet worden weggetrokken van het bot (zie stap 2.4). C. Foto van de muis hoofd na de huid wordt weggetrokken met de botstructuren (zie stap 2.4). Snijrichting van de schaar en de richting voor het openbreken van de schedel met de stompe pincet wordt aangegeven met de zwartegestippelde pijlen of grijs broad arrows, respectievelijk. D. Foto van de muis hersenen na het elimineren van de verschillende botstructuren (zie Stap 2.5 - 2,7). E. Foto van het verwijderen van de hersenen nog op de schedel via de craniale zenuwen. F. Foto van een relatief onbeschadigd muizenhersenen.

Figuur 2. Het snijden van de coronale hypothalamus delen van de hersenen van muizen. A. Fotografeer die de positie van de enkele rand scheermesje voor het elimineren van de kleine hersenen (zie stap 3.1). B. Positie van agar gel blok ten opzichte van de hersenen gelijmd op de basisplaat van de microtoom (zie stap 3.2). C. Het snijden van coronale hersenen slice (let hier de locatie van de hersenen en gel blok posities met betrekking tot het snijblad van de microtoom, zie stap 3.4.). d-, rug-, v, ventrale.

Figuur 3. Brain slice gepositioneerd in de opname kamer. A, B. Overzicht (A) en hogere vergroting (B) van een Warner Instruments RC-27 open bad opname kamer geven brede toegang tot het hypothalamus gebieden van de hersenen coronale plak (zie stap 5.1). C. U-vormige metalen harp die parallel arrays van nylon draden die de plak wordt in positie in de opname kamer (zie stap 5.2).

Figuur 4. Ca ^{2 +} signalen in τGFP neuronen van muizen hypothalamus hersencoupes. AD. Identificatie van een GFP neuron en gelijktijdige aankoop van de fura-rode fluorescentie in coronale muizenhersenen plakjes. A. Confocale beeld van een coronale hersenen slice identificeren GnRHR-τGFP neuronen (groen). B. Relatief uniforme fluorescentie-signaal (rood) van de hersenen weergegeven gebied in A waargenomen na het laden van de hersenen slice met fura-red/AM. C. Samengevoegd beeld dat de neuRons afgebeeld in A geladen met de Ca ^{2 +} indicator kleurstof (geel). Grenzen van GFP neuron somata aangegeven in onderbroken witte lijnen, terwijl voorbeelden van twee niet-GFP somata (pijlen) zijn aangegeven in grijze lijnen. D. Voorbeeld van een GFP en niet-GFP neuron met hogere hoeveelheden rode fluorescentie vergeleken met de achtergrond. E. Voorbeelden van somatische stimulus-geïnduceerde Ca ^{2 +} antwoorden van individuele GFP-gemerkte neuronen in de verschillende hypothalame hersengebieden (Pe, periventriculaire kern; DM, dorsomediale hypothalamus, Arc, nucleus arcuatus). Gebied onder de curve (AUC) wordt weergegeven door de rode zone. De verschillende Ca ^{2 +-signalen} tussen GnRHR expressie neuronen van verschillende hypothalamische kernen kunnen worden vergeleken met de AUC als schatting voor de totale verandering in Ca ^{2 +} in een bepaalde cel in dezelfde periode. F. Schematische tekeningen en schema dat de ligging van het GFP-gelabelde neuronen geanalyseerd in AE Bovenste paneel:. Locatie van een coronale hersenen sectie met hypothalamische gebieden van de hersenen (rode lijn) Midden-en onderpaneel:. Schematische tekening van een brein slice (midden) en vergroting van de rode doos gebied (onderste paneel) dat aangeeft met rode stippen de globale positie van de opgenomen GFP-gelabelde neuronen van de Pe, DM en Arc weergegeven in E; zwarte gebied in onderste paneel schema: 3 ^e ventrikel. Onderste twee diagrammen zijn afgeleid van Paxinos en Franklin ^12. Linksonder nummer geeft de afstand (mm) van bregma.

Discussie

Een belangrijke vraag in de neurowetenschappen is om te begrijpen hoe de hersenen sociale informatie verwerkt. Een grote bron van informatie die nodig is voor de sociale erkenning wordt gecodeerd door olfactorische of feromooncommunicatie signalen. De detectie van deze signalen door neuronale populaties in de neus en de erkenning van de signalen in de hersenen, vooral de hypothalamus, spelen een belangrijke rol in vele maatschappelijke processen en invloed hormonen en andere factoren neuroendocrine ^13-16. Een...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam	Vennootschap	Cat. N °
Agar-agar	Sigma	A1296
Fura-red/AM	Invitrogen	F-3021
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Dimethylsulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Vibrerende-Blade Microtoom Hyrax V 50	Zeiss	9770170
Koeling CU 65 voor Microtoom Hyrax V 50	Zeiss	9920120
O 2 / CO 2-Incubator, CB210-UL	Binder	0019389
Super lijm, Loctite 406TM	Henckel	142580
Dubbele spatels, lepel vorm	Bochem	3182
Microlepel spatels, lepel vorm	Bochem	3344
Spring Schaar, Moria-Vannas-Wolff - 7mm Blades	Fine Science Tools	15.370-52
Spring Schaar, Vannas - 3mm Blades	Fine Science Tools	15.000-00
Wagner Schaar	Fine Science Tools	14.071-12
Medische tang, Dumont 7b	Fine Science Tools	11.270-20
Grote rechthoekige Open Bath Chamber (RC-27)	Warner Instruments	64-0.238
Confocale microscoop BioRad Radiance 2100	Zeiss	na