Compact Quantum Dots voor Single-molecule Imaging

Summary

We beschrijven de bereiding van colloïdale quantum dots met minimale hydrodynamische grootte voor single-molecule fluorescentie beeldvorming. Vergeleken met conventionele quantum dots, deze nanodeeltjes zijn vergelijkbaar in grootte met globulaire eiwitten en zijn geoptimaliseerd voor single-molecule helderheid, stabiliteit tegen afbraak en resistentie tegen specifieke binding aan eiwitten en cellen.

Abstract

Single-molecule beeldvorming is een belangrijk instrument voor het begrijpen van de mechanismen van biomoleculaire functie en voor het visualiseren van de ruimtelijke en temporele heterogeniteit van moleculaire gedrag dat cellulaire biologie ^{1 tot 4} ten grondslag liggen. Om een ​​afzonderlijk beeld molecuul van belang, is het meestal geconjugeerd aan een fluorescerend label (kleurstof, eiwit, kraal, of quantum dot) en waargenomen met epifluorescentie of totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie. Terwijl kleurstoffen en fluorescerende eiwitten zijn de steunpilaar van de fluorescentie beeldvorming voor tientallen jaren, hun fluorescentie is niet stabiel onder hoge foton flux die nodig zijn om individuele moleculen te observeren, waardoor slechts een paar seconden van observatie voordat volledig verlies van signaal. Latex kralen en kleurstof gemerkte korrels een verbeterde signaal stabiliteit, maar ten koste van grotere hydrodynamische grootte drastisch, wat nadelig kan veranderen de verspreiding en het gedrag van de moleculen onder studie. ntent "> Quantum dots (QD's) bieden een evenwicht tussen deze twee problematische regimes. Deze nanodeeltjes zijn samengesteld uit halfgeleidende materialen en kunnen worden gemanipuleerd met een hydrodynamisch compacte afmetingen met een uitzonderlijke weerstand tegen fotodegradatie ^5. Aldus in de afgelopen jaren QDs zijn geweest bij zodat op lange termijn observatie van complexe macromoleculaire gedrag op de single molecule-niveau. Maar deze deeltjes hebben nog steeds is gebleken dat een verminderde diffusie vertonen in drukke moleculaire omgevingen, zoals de mobiele cytoplasma en de neuronale synaptische spleet, waar hun maten zijn nog steeds te groot ^{4,6 , 7.}

Onlangs hebben wij de engineering van de kernen en oppervlaktecoatings van QDs voor minimale hydrodynamische grootte, terwijl de afweging van offsets aan colloïdale stabiliteit, fotostabiliteit, helderheid en niet-specifieke binding dat het nut van compacte QDs hebben gehinderd in het verleden ^8,9. Het doel van dit artikel is aan te tonende synthese, modificatie en karakterisering van deze geoptimaliseerde nanokristallen, bestaande uit een gelegeerd Hg _x Cd _1-x Se kern bekleed met een isolerende Cd _y Zn _1-y S shell, verder bekleed met een multidentaat ligand polymeer gemodificeerd met korte polyethyleenglycol ( PEG) ketens (figuur 1). Vergeleken met conventionele CdSe nanokristallen, Hg _x Cd _1-x Se legeringen bieden meer kwantumopbrengsten van fluorescentie, fluorescentie bij rode en nabij-infrarode golflengten verbeterde signaal-ruisverhouding in cellen en excitatie bij niet-cytotoxische zichtbare golflengten. Multidentaat polymeer coatings binden aan het oppervlak nanokristallen in een gesloten vlakke conformatie om hydrodynamische grootte minimaliseren en PEG neutraliseert de oppervlaktelading om niet-specifieke binding minimaliseren cellen en biomoleculen. Het eindresultaat is een helder fluorescerende nanokristallen met emissie tussen 550 tot 800 nm en een totale hydrodynamische afmeting in de buurt 12 nm. Dit is in de same groottebereik zoveel oplosbare globulaire eiwitten in cellen en aanzienlijk kleiner dan conventionele PEGylated QDs (25-35 nm).

Protocol

De volgende synthese procedures omvatten standaard luchtvrije technieken en het gebruik van een vacuüm / inert gas spruitstuk gedetailleerde methodologie kan worden gevonden in referenties 10 en 11. MSDS voor alle potentieel toxische en ontvlambare stoffen moet worden geraadpleegd voor gebruik en alle brandbare en / of lucht-labiele verbindingen dienen te worden in hoeveelheden verdeeld in septum afgesloten flacons in een zuurkast of een handschoen zak.

1. Synthese van Mercurius cadmiumselenide (Hg _x Cd _1-x Se) Quantum Dot Cores

1. Bereid een 0,4 M oplossing van selenium in trioctylphosphine (TOP). Voeg selenium (0,316 g, 4 mmol) in een 50 ml 3-halskolf, dan evacueren en vullen met argon via een Schlenk-lijn. Onder lucht-vrije omstandigheden (droge stikstof of argon atmosfeer), 10 ml TOP en verhit tot 100 ° C onder roeren gedurende 1 uur tot een heldere, kleurloze oplossing opleveren. Koel de oplossing tot kamertemperatuur en zet het flesje.
2. Aan een 250 ml 3-hals kolf, voeg cadmiumoxide (CdO 0,0770 g, 0,6 mmol), tetradecylphosphonic acid (TDPA, 0,3674 g, 1,32 mmol) en octadeceen (ODE, 27,6 ml) en de oplossing evacueren met een Schlenk-lijn onder roeren. Verhoog de temperatuur tot 100 ° C en evacueren nog 15 min met een laag kookpunt onzuiverheden te verwijderen.
3. Onder argon of stikstofgas, verwarm het mengsel tot 300 ° C gedurende 1 uur volledig oplossen van de CdO. De oplossing verandert van een roodachtige kleur helder en kleurloos. Koel de oplossing tot kamertemperatuur.
4. Voeg hexadecylamine (HDA, 7,0 g) aan de oplossing cadmium, warmte tot 70 ° C en evacueren. Zodra een constante druk is bereikt, de temperatuur stijgen tot 100-110 ° C en reflux de oplossing gedurende 30 minuten. Schakel de Schlenk-lijn klep inert gas en direct plaats de thermokoppel in de oplossing.
5. Onder lucht-vrije omstandigheden, voeg difenylfosfine (DPP, 100 pl) aan de oplossing en verhogen de temperatuur tot 310 ° C. Verwijder 7,5 ml van de 0,4 M TOP-Se-oplossing(3 mmol selenium) in een wegwerpbare plastic spuit bevestigd aan een 16 gauge naald.
6. Zodra de temperatuur evenwicht bereikt bij 310 ° C, zet de temperatuurregelaar op 0 ° C en snel direct te injecteren de TOP-Se oplossing in het cadmium oplossing. De oplossing zal veranderen van kleurloos tot geel-oranje en de temperatuur zal snel dalen en nemen weer toe tot ~ 280 ° C. Na 1 min reactie Verwijder de kolf uit de verwarmingsmantel en snel koelen met een luchtstroom totdat de temperatuur minder dan 200 ° C.
7. Wanneer de temperatuur ~ 40 ° C bereikt, verdunnen met 30 ml hexaan, de meeste van de resterende cadmium voorloper zal vestigen van de oplossing. Verwijder het precipitaat door centrifugeren (5.000 xg, 10 min).
8. In zes 50 ml polypropyleen conische centrifugebuis Verdun 12 ml van het ruwe nanokristallen oplossing met 40 ml aceton, centrifuge (5.000 g gedurende 10 min) en decanteer zorgvuldig en verwijder het supernatant.
9. Los het nanocrystal pellets in hexaan (25 ml totaal volume). Extract deze oplossing 3 keer met een gelijk volume methanol, behouden de bovenste fase. Voor de derde extractie, kan de hoeveelheid methanol worden aangepast aan ~ 15 ml van een geconcentreerde oplossing van hexaan pure CdSe QDs verkrijgen op ongeveer 200 uM. De typische opbrengst van deze reactie is 3 pmol CdSe nanokristallen met een diameter van 2,3 nm (50-60% reactieopbrengst).
10. Bepaal de nanokristallen diameter en concentratie door het meten van de UV-Vis-absorptiespectrum en de raadpleging van de grootte-fitting grafiek van Mulvaney en collega's ¹² en het uitsterven correlaties van Bawendi en collega's ^13. Zie bijlage voor meer informatie.
11. Mercury kationenuitwisseling: de nanokristallen kunnen gedeeltelijk worden uitgewisseld met kwik tot rood-verschuiving van de absorptie en fluorescentie-emissie. Meng de volgende om in een 20 ml glazen flesje met roerstaaf (deze reactie kan worden geschaald naar keuze): 3 ml hexaan, 2 ml chloroform, 1 ml 200 pM CdSe QD oplossing (200 nmol), 15 pl oleylamine (OLA) en 500 ul van een 0,1 M oplossing van Hg (OT) ₂ in chloroform. Kwik octanethioate (HgOT ₂₎ kunnen worden bereid door kwik acetaat en octanethiol in methanol (zie appendix). De kationenuitwisselingsreactie verloopt, kan de mate van roodverschuiving worden bewaakt met UV-Vis absorptiespectrofotometrie. Nadat de gewenste absorptieband is bereikt, meet de absorptie van de nanokristallen oplossing bij 350 nm en het nieuwe extinctiecoëfficiënt, aannemende dat de concentratie nanokristallen niet veranderd (30,7 uM in dit voorbeeld). Quench de reactie door het verwijderen van de niet-gereageerde kwik: voeg 5 ml decaan, 10 ml hexaan en 7 ml methanol en pak de oplossing, het bijhouden van de bovenste fase die de nanokristallen. Extraheer tweemaal met hexaan en methanol, en het volume van methanol zodat de bovenste fase ~ 7 ml. Als de fasen te scheiden traag, kan de oplossing gecentrifugeerd (5000 xg,10 min). Voeg 100 ul TOP, 100 pl OLA, en 100 pl oliezuur de nanokristallen gevolgd door 40 ml aceton precipitatie te induceren. Verzamel de nanokristallen via centrifugeren en verspreiden in 3 ml hexaan. Centrifugeer opnieuw om onoplosbare componenten te verwijderen en opnieuw bepalen nanokristallen concentratie met de nieuwe extinctiecoëfficiënt bij 350 nm. Laat de oplossing nanokristallen leeftijd ten minste 24 uur bij kamertemperatuur alvorens de volgende stap.

2. De groei van Cadmium Zink Sulfide (Cd _y Zn _1-y S) Shell

1. Bereid 0,1 M shell voorloper oplossingen in 50 ml 3-hals kolven. Cadmium precursor: cadmiumacetaat hydraat (230,5 mg, 1 mmol) en 10 ml oleylamine (OLA). Zinc precursor: zinkacetaat (183,5 mg, 1 mmol) en 10 ml OLA. Zwavel precursor: zwavel (32,1 mg, 1 mmol) en 10 ml ODE. Onder vacuüm, verwarmen elke oplossing tot reflux gedurende 1 uur tot heldere oplossingen opleveren, en dan opladen met argon. De oplossing van zwavel kanworden afgekoeld tot kamertemperatuur, maar de cadmium en zink precursors worden gehandhaafd op ongeveer 50 ° C. Berekeningen van shell voorloper hoeveelheden zijn te vinden in referentie 14.
2. In een 3-halskolf: Hg _x Cd _1-x Se QDs (120 nmol, 2,3 nm diameter), ODE (2 ml) en trioctylphosphine oxide (TOPO, 250 mg). Evacueer uit het hexaan bij kamertemperatuur met behulp van de Schlenk-lijn. Verhoog de temperatuur tot 100 ° C en reflux gedurende 15 minuten. Verander de Schlenk lijn klep argon of stikstofgas en plaats het thermokoppel in de nanokristallen oplossing.
3. Verhoog de temperatuur tot 120 ° C, voeg 0,5 monolagen van zwavel precursor oplossing (140 ul) en laat de reactie doorgaan gedurende 15 minuten. Kleine porties (<50 ul) kunnen worden verwijderd met een glazen spuit om de voortgang van de reactie via fluorescentie en / of UV-Vis spectrofotometrie controleren. Verhoog de temperatuur tot 140 ° C, voeg 0,5 monolagen van cadmium voorloperoplossing (140 pl) en laat de reactie doorgaan gedurende 15 minuten. Voeg 500 pl watervrije OLA aan de reactieoplossing.
4. Bij 160 ° C voeg 0,5 monolagen zwavel precursor oplossing (220 pl) gevolgd door een gelijke hoeveelheid zink precursor oplossing bij 170 ° C met 15 min tussen elke toevoeging. Vervolgens bij 180 ° C voeg 0,25 monolagen zwavel precursor oplossing (150 pl) en zink precursor oplossing 15 min intervallen.
5. Koel de oplossing tot kamertemperatuur en opnieuw berekent een nieuwe extinctiecoëfficiënt voor deze deeltjes met een UV-Vis spectrum, ervan uitgaande dat het aantal nanokristallen niet veranderd (120 nmol in 3,8 ml reactieoplossing). Bewaar de reactieoplossing als een ruw mengsel in een vriezer, de nanokristallen worden ontdooid en gezuiverd als nodig met dezelfde methode beschreven in paragraaf 1.8 en 1.9.
6. De nanokristallen kan worden gekarakteriseerd met behulp van elektronenmicroscopie, UV-Vis absorptie spectroscopie en fluorescentiespectroscopie. Kwantumopbrengst kangeheel berekend met een integrerende bol of relatief ten opzichte van een bekende standaard met de referentiemethoden 15.

3. Phase Transfer

1. Voeg gezuiverd kern / schil Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S QDs (5 ml, 20 uM) in een 50 ml 3-halskolf en verwijderen hexaan onder hoog vacuüm om een droge film werd verkregen. De kolf met argon, voeg watervrije pyridine (3 ml) aan de nanodeeltjes film en verhit slurry tot 80 ° C. In de loop van 1-2 uur de nanodeeltjes zal volledig oplossen.
2. Voeg 1-thioglycerol (1 ml) aan de oplossing en geroerd bij 80 ° C gedurende 2 uur. Afkoelen van de oplossing tot kamertemperatuur en voeg triethylamine (0,5 ml) aan thioglycerol deprotoneren. Roer gedurende 30 minuten. De oplossing kan troebel worden na toevoeging van triethylamine vanwege de slechte oplosbaarheid van polaire nanokristallen in dit oplosmiddelmengsel.
3. Breng de QD oplossing in een 50 ml conische centrifugebuis containing een mengsel van 20 ml hexaan en 20 ml aceton en meng goed. Isoleer het neergeslagen nanokristallen via centrifugatie (5.000 xg, 10 min), en was het pellet met aceton.
4. Los het pellet QD in DMSO (5 ml) met bad sonicatie en centrifuge (7000 xg, 10 min) om mogelijke aggregaten te verwijderen. Bepaal de nanodeeltjes concentratie van een UV-Vis-absorptiespectrum. Deze oplossing zuivere QDs moet binnen 3 uur, het oppervlak thiolen langzaam kan oxideren onder omgevingsomstandigheden in lucht.
5. Verdun de QD die 10 micrometer of minder met DMSO en overbrengen naar een 50 ml kolf. Bereid een 5 mg / ml oplossing van gethioleerd polyacrylzuur (synthese beschreven in Appendix) in DMSO. Voeg de polymeeroplossing (0,15 mg polymeer per nmol QDs) druppelsgewijs aan de oplossing onder roeren QD en ontgas de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
6. Spoel de QD / polymeeroplossing met argon en verhit tot 80 ° C gedurende 90 minuten. Afkoelen van de oplossing tot kamertemperatuur eend druppelsgewijs een gelijk volume van 50 mM natriumboraat, pH 8. Roer gedurende 10 minuten.
7. Zuiver het QDs via dialyse (20 kDa cutoff) in 50 mM natriumboraat, pH 8, en dan concentreren de deeltjes met een centrifugaal filter (10 kDa cutoff). Het gehalte van een UV-Vis-absorptiespectrum.

4. PEG Coating

1. In een 4 ml glazen flesje met roerstaaf, 1 nmol QDs in boraatbuffer mengen met een 40.000 x molaire overmaat van 750 Da monoamino-polyethyleenglycol (30 mg, 40 umol). Indien een specifieke chemische functionaliteit wordt toegevoegd aan de nanokristallen (bijvoorbeeld hydrazide of maleïmide) kan worden geïntroduceerd door vervanging van een deel van de amino-PEG met een heterobifunctionele amino-PEG (30% molfractie werkt meestal goed). Verdun de nanokristallen oplossing 1 uM met boraatbuffer. Deze reactie kan worden geschaald naar wens.
2. Bereid een verse oplossing van DMTMM (20 mg, 72 umol) in DMSO (144 ul). Deze oplossing kan in het kort worden verwarmd under een stroom van warm tapwater of ondergedompeld in een badsonicator volledig oplossen van de DMTMM. Voeg snel een 25.000 x molaire overmaat van deze 0,5 M DMTMM oplossing (50 pl) van de QD oplossing en geroerd bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
3. Herhaal stap 4.2 vier keer aan de nanokristallen oppervlak verzadigen met PEG. Voeg tenslotte 200 pi 1 M Tris buffer om de reactie te blussen en zuiveren nanokristallen met dialyse, centrifugale filters of ultracentrifugatie.
4. De nanokristallen worden geanalyseerd monodispersiteit, hydrodynamische grootte, oppervlaktelading en met vloeistofchromatografie, agarose gel elektroforese en fluorescentie microscopie. Hydrodynamische grootte en grootteverdeling gebruik van een geautomatiseerd systeem vloeistofchromatografie (GE AKTAprime Plus) bepalen met een Superose 6 kolom, een stroomsnelheid van 0,5 ml / min met PBS buffer eluens en absorptie detectie bij 260 of 280 nm. Vergelijk nanodeeltjes elutietijden met die van molecuulgewichtstandaarden. Voor agarose gel electrophoweerstand Bereid een 0,5% agarosegel in 50 mM natriumboraatbuffer (pH 8,5) of 50 mM natriumfosfaat buffer (pH 7,4), 1 uM monsters te mengen met 10% glycerol en belasting in putten, en lopen bij 100 V gedurende 30 min . Afbeelding van de nanokristallen in de gel met behulp van een UV-hand-wand of UV-transilluminator en voor fluorescentie excitatie. Het afbeelden van de nanokristallen op single molecule niveau met fluorescentiemicroscopie de deeltjes tot 0,2 nM verdund in 10 mM fosfaatbuffer, 2,5 ul druppel van de oplossing op een dekglaasje bedekt en voorzichtig een tweede dekglaasje bovenop de vloeistof te verspreiden kraal een film tussen de dekglaasjes. Beeld aan het oppervlak gebonden deeltjes met een hoge numerieke apertuur doel (bij voorkeur ten minste 1,40) hetzij in epifluorescentie of TIRF mode met excitatie golflengte van 400-580 nm en een elektronen vermenigvuldigende CCD camera. Exacte imaging parameters zullen variëren tussen microscopie setup.

Results

Figuur 2 geeft representatieve absorptie en fluorescentie spectra voor CdSe nanokristallen, Hg _x Cd _1-x Se nanokristallen na kationuitwisseling, en Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S nanokristallen na shell groei. De kern CdSe nanokristallen hebben een quantum opbrengst van fluorescentie bij 15% (inclusief lange-golflengte diep-trap emissie), maar dit rendement daalt tot minder dan 1% na kwik uitwisseling, waarschijnlijk te wijten aan de drag...

Discussion

Vergeleken met conventionele CdSe quantum dots, kan ternaire legering Hg _x Cd _1-x Se nanokristallen worden afgestemd in grootte en fluorescentie golflengte onafhankelijk van elkaar. De grootte wordt eerst geselecteerd tijdens de synthese van CdSe nanokristallen kernen en de fluorescentie golflengte wordt gekozen in een secundaire kwik kationuitwisselingsstap, die niet wezenlijk veranderen de nanokristallen maat ^9. Het is belangrijk om de gezuiverde Hg _x Cd _1-x Se na...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
Selenium	Sigma-Aldrich	229865
Tri-n-octylphosphine	Strem	15-6655	97% zuiver, stabiel in lucht
Cadmiumoxide	Sigma-Aldrich	202894	Zeer giftig: Wees voorzichtig
Tetradecylphosphonic zuur	PCI Synthese	4671-75-4
Octadeceen	Alfa Aesar	L11004	Technische kwaliteit
Hexadecylamine	Sigma-Aldrich	H7408
Difenylfosfine	Sigma-Aldrich	252964	Pyrofore
Mercury acetaat	Sigma-Aldrich	456012	Zeer giftig: Wees voorzichtig
1-Octanethiol	Sigma-Aldrich	471836	Sterke geur
Oliezuur	Sigma-Aldrich	W281506
Zinkacetaat	Alfa Aesar	35792
Cadmiumacetaat hydraat	Sigma-Aldrich	229490	Zeer giftig: Wees voorzichtig
Oleylamine	Fisher Scientific	AC12954	Instabiel lucht
Zwavel	Sigma-Aldrich	344621
Trioctylphosphine oxide	Strem	15-6.661	99%
Pyridine	VWR	EM-PX2,012-6	Watervrij
Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M1753	Sterke geur
Triethylamine	Sigma-Aldrich	471283	Watervrij
Dialysebuis	Spectrum Labs	131342	20 kDa cutoff
Centrifugaalfilter	Millipore	UFC801024	10 kDa cutoff
Monoamino-PEG	Rapp Polymere	12 750-2	750 Da
DMTMM, 4 - (4,6-Dimethoxy-1 ,3,5-triazine-2-yl)-4-methylmorpholinium hydraat	Alfa Aesar	H26333
AKTAprime Plus Chromatografie System	GE Healthcare
Superose 6 10/300 GL chromatografiekolom	GE Healthcare	17-5172-01
Agarose, OmniPur	VWR	EM-2120
			Bijlage Synthese van kwik octanethiolate: langzaam een methanoloplossing van kwik acetaat (. 1 eq) toe aan een geroerde oplossing van 1-octanethiol (3 eq.) En kaliumhydroxide (3 eq.) In methanol bij kamertemperatuur. Isoleer het kwik (II) octanethiolate precipitaat door filtratie, wassen tweemaal met methanol en eenmaal met ether en droog onder vacuüm. Synthese van multidentate polymeer: ​​Los polyacrylzuur (1 g, 1.773 Da) in 25 ml dimethylformamide (DMF) in een 150 ml driehalskolf en bel met argon gedurende 30 minuten. Toevoegen watervrije oplossing van cysteamine (374 mg, 4,87 mmol) in 10 ml DMF. Bij kamertemperatuur onder krachtig roeren, langzaam watervrije diisopropylcarbodiimide (DIC, 736 mg, 5,83 mmol) over 30 minuten, gevolgd door triethylamine (170 pl, 1,22 mmol) en laat de reactie gedurende 72 uur doorgaan bij 60 ° C. Voeg mercaptoethanol (501 mg, 6,41 mmol) om de reactie te blussen en gedurende 2 uur geroerd bij kamertemperatuur. Verwijder DMF via rotatieverdamping en isoleren het polymeer met de toevoeging van een 2:1 mengsel van ijskoude aceton: chloroform, gevolgd door centrifugatie. Los het polymeer in ~ 5 ml watervrij DMF, filter, opnieuw neerslaan met diethylether en herhaal. Droog het product onder vacuüm en bewaar onder argon. Bepaling van CdSe kerndiameter: Uit de UV-Vis-absorptiespectrum bepalen de golflengte van de eerste piek exciton (λ in nm), de langste golflengte piek (bijvoorbeeld ongeveer 498 nm voor CdSe in figuur 2a), en gebruik de dimensionering curve van Mulvaney en medewerkers 12: Bepaling van CdSe nanokristallen concentratie: Van een achtergrond-gecorrigeerde, UV-Vis spectrum van een optisch heldere oplossing van CdSe nanokristallen, de absorptie te bepalen bij 350 nm golflengte. Seriële verdunningen worden gebruikt om te bepalen of de optische absorptie in het lineaire bereik van de wet van Beer. De nanokristallen concentratie (QD, in M) kan worden bepaald door de stekker in de nanokristallen diameter (D, in nm), de optische absorptiewaarde (A 3SA) en de cuvette padlengte (l, in cm) in de volgende vergelijking van de empirische correlatie van Bawendi en medewerkers 13: