Compact Quantum Dots voor Single-molecule Imaging

Summary

We beschrijven de bereiding van colloïdale quantum dots met minimale hydrodynamische grootte voor single-molecule fluorescentie beeldvorming. Vergeleken met conventionele quantum dots, deze nanodeeltjes zijn vergelijkbaar in grootte met globulaire eiwitten en zijn geoptimaliseerd voor single-molecule helderheid, stabiliteit tegen afbraak en resistentie tegen specifieke binding aan eiwitten en cellen.

Abstract

Single-molecule beeldvorming is een belangrijk instrument voor het begrijpen van de mechanismen van biomoleculaire functie en voor het visualiseren van de ruimtelijke en temporele heterogeniteit van moleculaire gedrag dat cellulaire biologie ^{1 tot 4} ten grondslag liggen. Om een ​​afzonderlijk beeld molecuul van belang, is het meestal geconjugeerd aan een fluorescerend label (kleurstof, eiwit, kraal, of quantum dot) en waargenomen met epifluorescentie of totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie. Terwijl kleurstoffen en fluorescerende eiwitten zijn de steunpilaar van de fluorescentie beeldvorming voor tientallen jaren, hun fluorescentie is niet stabiel onder hoge foton flux die nodig zijn om individuele moleculen te observeren, waardoor slechts een paar seconden van observatie voordat volledig verlies van signaal. Latex kralen en kleurstof gemerkte korrels een verbeterde signaal stabiliteit, maar ten koste van grotere hydrodynamische grootte drastisch, wat nadelig kan veranderen de verspreiding en het gedrag van de moleculen onder studie. ntent "> Quantum dots (QD's) bieden een evenwicht tussen deze twee problematische regimes. Deze nanodeeltjes zijn samengesteld uit halfgeleidende materialen en kunnen worden gemanipuleerd met een hydrodynamisch compacte afmetingen met een uitzonderlijke weerstand tegen fotodegradatie ^5. Aldus in de afgelopen jaren QDs zijn geweest bij zodat op lange termijn observatie van complexe macromoleculaire gedrag op de single molecule-niveau. Maar deze deeltjes hebben nog steeds is gebleken dat een verminderde diffusie vertonen in drukke moleculaire omgevingen, zoals de mobiele cytoplasma en de neuronale synaptische spleet, waar hun maten zijn nog steeds te groot ^{4,6 , 7.}

Onlangs hebben wij de engineering van de kernen en oppervlaktecoatings van QDs voor minimale hydrodynamische grootte, terwijl de afweging van offsets aan colloïdale stabiliteit, fotostabiliteit, helderheid en niet-specifieke binding dat het nut van compacte QDs hebben gehinderd in het verleden ^8,9. Het doel van dit artikel is aan te tonende synthese, modificatie en karakterisering van deze geoptimaliseerde nanokristallen, bestaande uit een gelegeerd Hg _x Cd _1-x Se kern bekleed met een isolerende Cd _y Zn _1-y S shell, verder bekleed met een multidentaat ligand polymeer gemodificeerd met korte polyethyleenglycol ( PEG) ketens (figuur 1). Vergeleken met conventionele CdSe nanokristallen, Hg _x Cd _1-x Se legeringen bieden meer kwantumopbrengsten van fluorescentie, fluorescentie bij rode en nabij-infrarode golflengten verbeterde signaal-ruisverhouding in cellen en excitatie bij niet-cytotoxische zichtbare golflengten. Multidentaat polymeer coatings binden aan het oppervlak nanokristallen in een gesloten vlakke conformatie om hydrodynamische grootte minimaliseren en PEG neutraliseert de oppervlaktelading om niet-specifieke binding minimaliseren cellen en biomoleculen. Het eindresultaat is een helder fluorescerende nanokristallen met emissie tussen 550 tot 800 nm en een totale hydrodynamische afmeting in de buurt 12 nm. Dit is in de same groottebereik zoveel oplosbare globulaire eiwitten in cellen en aanzienlijk kleiner dan conventionele PEGylated QDs (25-35 nm).

Protocol

De volgende synthese procedures omvatten standaard luchtvrije technieken en het gebruik van een vacuüm / inert gas spruitstuk gedetailleerde methodologie kan worden gevonden in referenties 10 en 11. MSDS voor alle potentieel toxische en ontvlambare stoffen moet worden geraadpleegd voor gebruik en alle brandbare en / of lucht-labiele verbindingen dienen te worden in hoeveelheden verdeeld in septum afgesloten flacons in een zuurkast of een handschoen zak.

1. Synthese van Mercurius cadmiumselenide (Hg _x Cd _1-x Se) Quantum Dot Cores

1. Bereid een 0,4 M oplossing van selenium in trioctylphosphine (TOP). Voeg selen....

Results

Figuur 2 geeft representatieve absorptie en fluorescentie spectra voor CdSe nanokristallen, Hg _x Cd _1-x Se nanokristallen na kationuitwisseling, en Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S nanokristallen na shell groei. De kern CdSe nanokristallen hebben een quantum opbrengst van fluorescentie bij 15% (inclusief lange-golflengte diep-trap emissie), maar dit rendement daalt tot minder dan 1% na kwik uitwisseling, waarschijnlijk te wijten aan de drag.......

Discussion

Vergeleken met conventionele CdSe quantum dots, kan ternaire legering Hg _x Cd _1-x Se nanokristallen worden afgestemd in grootte en fluorescentie golflengte onafhankelijk van elkaar. De grootte wordt eerst geselecteerd tijdens de synthese van CdSe nanokristallen kernen en de fluorescentie golflengte wordt gekozen in een secundaire kwik kationuitwisselingsstap, die niet wezenlijk veranderen de nanokristallen maat ^9. Het is belangrijk om de gezuiverde Hg _x Cd _1-x Se na.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
Selenium	Sigma-Aldrich	229865
Tri-n-octylphosphine	Strem	15-6655	97% zuiver, stabiel in lucht
Cadmiumoxide	Sigma-Aldrich	202894	Zeer giftig: Wees voorzichtig
Tetradecylphosphonic zuur	PCI Synthese	4671-75-4
Octadeceen	Alfa Aesar	L11004	Technische kwaliteit
Hexadecylamine	Sigma-Aldrich	H7408
Difenylfosfine	Sigma-Aldrich	252964	Pyrofore
Mercury acetaat	Sigma-Aldrich	456012	Zeer giftig: Wees voorzichtig
1-Octanethiol	Sigma-Aldrich	471836	Sterke geur
Oliezuur	Sigma-Aldrich	W281506
Zinkacetaat	Alfa Aesar	35792
Cadmiumacetaat hydraat	Sigma-Aldrich	229490	Zeer giftig: Wees voorzichtig
Oleylamine	Fisher Scientific	AC12954	Instabiel lucht
Zwavel	Sigma-Aldrich	344621
Trioctylphosphine oxide	Strem	15-6.661	99%
Pyridine	VWR	EM-PX2,012-6	Watervrij
Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M1753	Sterke geur
Triethylamine	Sigma-Aldrich	471283	Watervrij
Dialysebuis	Spectrum Labs	131342	20 kDa cutoff
Centrifugaalfilter	Millipore	UFC801024	10 kDa cutoff
Monoamino-PEG	Rapp Polymere	12 750-2	750 Da
DMTMM, 4 - (4,6-Dimethoxy-1 ,3,5-triazine-2-yl)-4-methylmorpholinium hydraat	Alfa Aesar	H26333
AKTAprime Plus Chromatografie System	GE Healthcare
Superose 6 10/300 GL chromatografiekolom	GE Healthcare	17-5172-01
Agarose, OmniPur	VWR	EM-2120
			Bijlage Synthese van kwik octanethiolate: langzaam een methanoloplossing van kwik acetaat (. 1 eq) toe aan een geroerde oplossing van 1-octanethiol (3 eq.) En kaliumhydroxide (3 eq.) In methanol bij kamertemperatuur. Isoleer het kwik (II) octanethiolate precipitaat door filtratie, wassen tweemaal met methanol en eenmaal met ether en droog onder vacuüm. Synthese van multidentate polymeer: ​​Los polyacrylzuur (1 g, 1.773 Da) in 25 ml dimethylformamide (DMF) in een 150 ml driehalskolf en bel met argon gedurende 30 minuten. Toevoegen watervrije oplossing van cysteamine (374 mg, 4,87 mmol) in 10 ml DMF. Bij kamertemperatuur onder krachtig roeren, langzaam watervrije diisopropylcarbodiimide (DIC, 736 mg, 5,83 mmol) over 30 minuten, gevolgd door triethylamine (170 pl, 1,22 mmol) en laat de reactie gedurende 72 uur doorgaan bij 60 ° C. Voeg mercaptoethanol (501 mg, 6,41 mmol) om de reactie te blussen en gedurende 2 uur geroerd bij kamertemperatuur. Verwijder DMF via rotatieverdamping en isoleren het polymeer met de toevoeging van een 2:1 mengsel van ijskoude aceton: chloroform, gevolgd door centrifugatie. Los het polymeer in ~ 5 ml watervrij DMF, filter, opnieuw neerslaan met diethylether en herhaal. Droog het product onder vacuüm en bewaar onder argon. Bepaling van CdSe kerndiameter: Uit de UV-Vis-absorptiespectrum bepalen de golflengte van de eerste piek exciton (λ in nm), de langste golflengte piek (bijvoorbeeld ongeveer 498 nm voor CdSe in figuur 2a), en gebruik de dimensionering curve van Mulvaney en medewerkers 12: Bepaling van CdSe nanokristallen concentratie: Van een achtergrond-gecorrigeerde, UV-Vis spectrum van een optisch heldere oplossing van CdSe nanokristallen, de absorptie te bepalen bij 350 nm golflengte. Seriële verdunningen worden gebruikt om te bepalen of de optische absorptie in het lineaire bereik van de wet van Beer. De nanokristallen concentratie (QD, in M) kan worden bepaald door de stekker in de nanokristallen diameter (D, in nm), de optische absorptiewaarde (A 3SA) en de cuvette padlengte (l, in cm) in de volgende vergelijking van de empirische correlatie van Bawendi en medewerkers 13: