Meting van antilichaam Effecten op cellulaire functie van geïsoleerde cardiomyocyten

Summary

De onderhavige methode biedt een manier om functioneel effectieve cardiotropic auto-antilichamen te detecteren in het plasma van patiënten met gedilateerde cardiomyopathie, ongeacht de specifieke antigen, door analyse van het effect van geïsoleerde patiënt immunoglobuline op cellulaire verkorten en intracellulair calcium transiënten in geïsoleerde cardiomyocyten van de rat.

Abstract

Gedilateerde cardiomyopathie (DCM) is een van de belangrijkste oorzaken van hartfalen bij jongere volwassenen ^1. Hoewel genetische aanleg en blootstelling aan toxische stoffen bekende oorzaken van deze ziekte bij ongeveer eenderde van de patiënten, de oorsprong van DCM grotendeels onduidelijk. In een groot aantal van deze patiënten hebben autoantilichamen tegen cardiale epitopen gedetecteerd en wordt vermoed een centrale rol spelen bij de ontwikkeling en progressie van de ziekte ^2,3. Het belang van cardiale autoantilichamen wordt onderstreept door een hemodynamische verbetering waargenomen met DCM patiënten na verwijdering van auto-antistoffen door immunoadsorptie ^3-5. Een verscheidenheid van specifieke antigenen zijn reeds geïdentificeerd ^2,3 en antilichamen tegen deze targets worden gedetecteerd door immunoassays. Maar deze assays geen onderscheid maken tussen stimuleren (en dus functioneel effectief) en blokkeren autoantilichamen. Er steeds evidence dat dit onderscheid is cruciaal ^6,7. Ook kan worden uitgegaan dat de targets voor een aantal cardiotropic antilichamen nog niet geïdentificeerd zijn en dus niet worden gedetecteerd door immunoassays. Daarom hebben we een methode voor de detectie van antilichamen functioneel actief cardiotropic, onafhankelijk van hun antigen. De achtergrond van de werkwijze is de hoge homologie meestal waargenomen voor functionele regio van cardiale eiwitten in zoogdieren tussen ^8,9. Dit suggereert dat cardiale antilichamen gericht tegen humane antigenen zullen kruisreageren met niet-menselijke doelwitcellen die testen van IgG kunnen uit DCM patiënten volwassen cardiomyocyten van de rat. De methode bestaat uit drie stappen: eerst IgG geïsoleerd uit patiënten met plasma sepharose gekoppelde anti-IgG antilichamen verkregen uit immunoadsorptie kolom (PlasmaSelect, Teterow, Duitsland). Tweede volwassen hartspiercellen worden geïsoleerd door collagenase perfusie in een Langendorff perfusie inrichting met apROTOCOL gewijzigd ten opzichte van eerdere werken ^10,11. De verkregen hartspiercellen zijn aan laminine beklede chambered coverglasses en gekleurd met Fura-2, een calcium-selectieve fluorescerende kleurstof die gemakkelijk kunnen worden gebracht in de cel om intracellulaire calcium nemen (Ca ^{2 +)} inhoud ^12. In de laatste stap, het effect van IgG patiënt op de cel verkorten en Ca ^{2 +} transiënten van gebied gestimuleerde cardiomyocyten wordt online gevolgd met een commerciële myocyte calcium en contractiliteit controlesysteem (IonOptix, Milton, MA, USA) aan een standaard inverse fluorescent microscoop.

Protocol

1. IgG Isolatie uit monsters van patiënten

1. Bereid mini-immunoadsorptie kolommen door het invullen van 3 ml anti-IgG sepharose per 2 ml patiënt EDTA plasma in een lege Econo Pac kolom. IgG isolatie vereist ten minste 2 ml van de patiënt plasma.
2. Plaats een filter bovenop de anti-IgG sepharose, opengesneden het laagste punt van de kolom en druk het een debiet van ongeveer 1 druppel / sec bereiken. Laat de preservatievloeistof opraken van de kolom.
3. Was de kolom met 3 volumes 0,9% NaCl per volume plasma.
4. Pipetteer de plasma op de kolom. Wanneer het plasma volledig is ondergedompeld in de anti-IgG sepharose, wassen met hetzelfde volume 0.9% NaCl.
5. Pipetteer een plasmavolume van 0,2 M glycine HCl, pH 2,8 op de kolom en laat onderdompelen in de sepharose. Voeg een volume van glycine HCl op de kolom. Verzamel de stroming door in een 15 ml buis en breng de pH op 7,3 met 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0.
6. Om de kolom te regenereren, Wassen met 3 plasma volumes glycine HCl. Na een laatste wassing met 2 volumes 0,9% NaCl, kan de kolom worden gebruikt voor de volgende plasmamonster. Als alternatief kan de kolom worden gevuld met preservatievloeistof en bij 4 - 8 ° C tot 4 weken.
7. Voor gebruik op cardiomyocyten, de verzameld IgG fractie wordt gedialyseerd tegen experimentele buffer (EB). Voor de bereiding van EB, voeg 117 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 mM _MgCl2, 1,2 mM KH _{2PO 4,} 1,2 mM _CaCl2, 10 mM HEPES en 20 mM glucose tot 1 L gedistilleerd water op een magnetische roerder en de pH tot 7.3.
8. Vul de IgG fractie naar een cellulose ester dialysemembraan buis met een molecuulgewicht cut off van 100 kDa. Plaats de buis in 1 L EB en roer langzaam met een magnetische roerder bij 4 ° C. Na 8 uur en spoel de dialysebuis in 3 L verse EB en dialyseer nog 20 uur bij 4 ° C.
9. Na dialyse Verwarm het monster gedurende 30 minuten bij 57 ° C in een waterbad tot inactivate aanvulling factoren. Bepaal totale IgG-concentratie en de voorbereiding van monsters met 330 mg IgG per stuk. Bij het toevoegen van het monster voor de meting cardiomyocyten (stap 4.3), vul de aliquots van 1 ml met EB. Onverdunde aliquots kan worden opgeslagen bij -20 ° C tot verder gebruik.

2. Isolatie van cardiomyocyten van de rat

1. Voor de bereiding ^van Ca2 ^+-vrije buffer isolatie (IB), voeg 110 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM _MgSO4, 1,2 mM KH _{2PO 4,} 20 mM HEPES en 11 mM glucose tot 1 L gedestilleerd water met een magnetische roerder. Breng de pH op 7,4 op kamertemperatuur en filtreer door een 0,2 um flesje bovenste filter voor sterilisatie.
2. Vul 80 ml IB in het bovenste reservoir van een thermostaat Langendorff perfusiesysteem. Pas thermostaatinstellingen een buffer van 37 ° C behouden en beluchten buffer met _95% O2 / 5% _CO2 gedurende 30 minuten.
3. Weeg ongeveer 10.000 - 12.000 U van collagenase type II, 175 mg BSA vrije vetzuren en opgelost in 20 ml IB bevattende 22,5 ul van een 100 mM _CaCl2 voorraadoplossing. Controleer de pH van de isolatie buffer in het bovenste reservoir en pas indien nodig.
4. Verdoven een Wistar rat van 175 - 200 g met 375 ug / kg lichaamsgewicht thiopental. Voeg 2500 IU heparine thiopental oplossing. Na thoracotomie, accijnzen het hart voorzichtig met een intacte aortaboog en breng deze over in ijskoud 0,9% NaCl. Reinig het hart van bloed en het omringende weefsel en overdracht naar vers 0,9% NaCl. Bloot de aorta, opent de stroming van het verloopstuk Langendorff systeem een ​​dalende snelheid 2-3/sec verkrijgen en het hart hechten aan de canule.
5. Perfuseren het hart tot 3 minuten met een stroomsnelheid van 1 druppel / sec te wassen resterende bloed. Start om het IB in het Langendorff systeem circuleren. Verwijder 20 ml buffer van de bovenste reservoir, vul de collagenase oplossing en vul zo veel buffer als nodig is om 80 ml te bereiken. Circulate de c ollagenase oplossing voor 27 min. Debiet moet periodiek worden gecontroleerd en gehandhaafd op 1 druppel / sec met behulp van de flow reducer.
6. Maak het hart van de canule, vrij van atria en de aorta en hak ze in kleine stukjes. Laat de collagenase oplossing te lopen in het onderste reservoir, het volume maximaal 40 ml en na de gehakte ventrikels verteren gedurende 10 - 15 min onder continue beluchting met _95% O2 / 5% CO _2. Daarna filter de celsuspensie door een 200 pm maaswijdte gaas in een 50 ml buis.
7. Herstel de Ca ^{2 +} inhoud van de cellen in 3 stappen: centrifugeer de celsuspensie bij 43 x g 2 minuten bij kamertemperatuur en resuspendeer cellen in 10 ml IB met 200 pM _CaCl2. Centrifugeer opnieuw cellen en resuspendeer in 10 ml IB met 500 pM _CaCl2. Na een laatste centrifugatie cardiomyocyten in steriel gefiltreerd EB (zie 1.8) mengen tot een dichtheid van 50.000 cellen / ml.

e_title "> 3. Fura-2 Kleuren van cardiomyocyten

1. Coat een 4 goed chambered dekglaasje met 10 ug laminine per putje en wacht tot deze volledig is gedroogd.
2. Vul 1 ml van de cardiomyocyt suspensie in elk putje met behulp van een micropipet met een cut tip. Laat de cellen hechten gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
3. Verdun 10 ul van 1 mg / ml Fura-2 AM voorraadoplossing in 5 ml EB. Houd de kleuroplossing in het donker.
4. Opstijgen buffer en ongebonden cellen van het dekglaasje en pipet 0,5 ml van de kleuroplossing in elk putje. Incubeer de cellen gedurende 10 min onder matig schudden. Vervolgens neemt u de kleuroplossing, een keer wassen cellen met 1 ml EB en uiteindelijk 0,5 ml EB te vullen in elk putje. Vermijd direct licht tijdens het beitsen en altijd de gekleurde cellen te houden in het donker.

4. Opname van Cell Verkorting en Ca ^{2 +} Transients

1. Plaats de chambered dekglaasje op een inverse fluorescentie microscope verbonden met een myocyte calcium en contractiliteit opnamesysteem. Plaats een op maat gemaakte elektrode met een-en uitstroom buis in het eerste putje. Superfuse cardiomyocyten met 1 ml / min EB en start de elektrische stimulatie (20 V, 1 Hz, 5 msec duur). Laat de cellen zich aanpassen aan de stimulering ongeveer 2 minuten.
2. Kies een intacte staafvormige cardiomyocyten met duidelijke strepen en constante contractie. Plaats de cel in het midden van het gezichtsveld van de camera en open kanaal. Horizontaal Oriënteer de cel binnen het video-oppervlak door het draaien van de cel framing adapter en het verplaatsen van de microscoop podium.
3. Stel de randen te detecteren bedieningselementen van de video gebied (figuur 2), opent u de fluorescerende kanaal en opnemen 10 tot 15 contracties om de eerste cel verkorten en Ca ^{2 +} van voorbijgaande aard te verkrijgen.
4. Sluit de microscoop licht kanaal om te voorkomen dat het bleken van de fluorescentie vlek. Schakel de stroom door van EB tot het monsterbypass met een 3-weg klep en superfuse cardiomyocyten met 1 ml van de patiënt IgG. Stop de pomp net voor lucht de put bereikt.
5. Open het licht kanaal en opnemen van een 10 tot 15 contracties om de acute cel respons te verkrijgen. De opname te pauzeren en weer te sluiten het licht kanaal. Herhaal de opname na 2 en 5 minuten.
6. Neem de elektrode van de put. Reinig de buizen met EB en ga verder met de volgende put van de chambered dekglaasje.
7. Analyseer de cel verkorten en Ca ^{2 +} voorbijgaande aard, met de IonWizard software met behulp van de "Edge-Length/Length" en de "fura 2-Numeriek afgetrokken / Ratio" venster, respectievelijk. De procentuele verandering van de initiële cel bakvet en Ca ^{2 +} transient van de piekhoogte verwezen naar de basislijn (bl% piek h) voor de acute, de 2 min 5 min en de reactie.

Results

Twee voorbeelden voor het meten van cellulaire inotropie in veld gestimuleerde volwassen hartspiercellen (figuur 2) met een myocyte Ca ^{2 +} en contractiliteit registratiesysteem worden hieronder gegeven. Figuur 3 geeft een indruk van een controlemeting, terwijl in figuur 4 de invloed van antilichamen cardiodepressieve van een patiënt met DCM getoond.

In beide voorbeelden initiële cel bakvet en Ca ^{2 +} transient tijdens su...

Discussion

De gepresenteerde methode biedt een geschikte manier om functioneel effectieve cardiale autoantilichamen te sporen bij patiënten met DCM van onduidelijke herkomst. In vergelijking met andere methoden, de detectie van functionele actieve antilichamen tegen de β1-adrenoceptor bijvoorbeeld door het effect op cAMP niveaus ^6, onze methode is onafhankelijk van een specifiek epitoop. Natuurlijk zijn er andere epitoop onafhankelijke proeven in de literatuur beschreven, namelijk het tellen van de gew...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het reagens / apparatuur	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Immunosorba preservatievloeistof	Fresenius Medical Care	903609211
Collagenase type 2	Cell System	LS004176
BSA, vrije vetzuur	Sigma-Aldrich	A6003
Laminine	Sigma-Aldrich	L2020
Fura-2 AM	Sigma-Aldrich	F0888	1 mg / ml in DMSO
Econo Pac chromatografiekolommen	BioRad	732-1010
Spectra / Por Biotech cellulose-ester Dialyse Membrane	Spectrumlabs	131417
4 goed Chambered coverglass	Nunc	155383
Myocyten Calcium en contractiliteit opnamesysteem	IonOptix
IonWizard 6,0 ​​analysesoftware	IonOptix