Methodenartikel
Een beeldvormende techniek voor de monitoring van membraanpotentiaal verandert met sub-micrometer ruimtelijke en minder dan een milliseconde tijdsresolutie wordt beschreven. De techniek is gebaseerd op laser-excitatie van voltage-sensitieve kleurstoffen, maakt metingen van signalen in de axonen en axon collateralen, terminal dendritische takken, en individuele dendritische spines.
Het begrijpen van de biofysische eigenschappen en functionele organisatie van enkele neuronen en hoe ze informatie verwerken is essentieel om te begrijpen hoe de hersenen werken. De primaire functie van een zenuwcel is om elektrische signalen te verwerken, gewoonlijk uit meerdere bronnen. Elektrische eigenschappen van neuronale processen buitengewoon complex dynamisch en, in het algemene geval, onmogelijk te voorspellen in afwezigheid van gedetailleerde metingen. Om een dergelijke meting zou worden verkregen, ideaal, wil graag in staat zijn om, monitoren op meerdere plaatsen, subdrempel gebeurtenissen als ze reizen van de sites van de oorsprong op de neuronale processen en summate op bepaalde locaties te actiepotentiaal initiatie beïnvloeden. Dit doel is niet bereikt in een neuron als gevolg van technische beperkingen van metingen die elektroden gebruiken. Te overwinnen dit nadeel is het zeer wenselijk om de patch-elektrode benadering vullen met beeldvormingstechnieken die uitgebreide parallel staan recordings uit alle delen van een neuron. We beschrijven een dergelijke techniek - optische registratie van membraanpotentiaal transiënten met organische spanningsgevoelige kleurstoffen (V m-imaging) - gekenmerkt door een milliseconde en sub-micrometer resolutie. De methode is gebaseerd op pionierswerk op spanningsgevoelige moleculaire probes 2. Veel aspecten van de initiële technologie zijn er continu verbeteringen over meerdere decennia 3, 5, 11. Bovendien eerder werk beschreven twee essentiële kenmerken van V m-imaging. Ten eerste fluorescentiesignalen zijn recht evenredig met membraanpotentiaal over het gehele fysiologische bereik (-100 mV tot +100 mV, 10, 14, 16). Ten tweede wordt geladen neuronen met de spanningsgevoelige kleurstof hier gebruikte (JPW 3028) geen detecteerbare farmacologische effecten. De opgenomen verbreding van de piek tijdens de kleurstof laden is volledig omkeerbaar 4, 7. Bovendien experimenten is aangetoond dat het mogelijk is te verkrijgeneen groot aantal (tot honderden) opnames vóór elke detecteerbare fototoxische effecten 4, 6, 12, 13. Er profiteren van de uitstekende helderheid en stabiliteit van een laser lichtbron met nagenoeg optimale golflengte de gevoeligheid van de V-m beeldvormingstechniek maximaliseren. De huidige gevoeligheid maakt het mogelijk meerdere locaties optische opnamen van V m transiënten uit alle delen van een neuron, met inbegrip van axonen en axon collateralen, terminal dendritische takken, en individuele dendritische spines. De verkregen gegevens over interacties signaal kwantitatief worden als direct gevisualiseerd in de vorm van een film geanalyseerd.
1. Plaatsing van het apparaat
Stap 1.1. Imaging setup
De sleutel tot het opnemen van spanning gevoelige kleurstof signalen geschikt setup ontwerp. We maken gebruik van een rechtopstaande microscoop (BX51WI Olympus of Zeiss AxioExaminer) uitgerust met drie camera's. De setup is ontworpen voor het verlichten van individuele neuronen in de hersenen plakjes door excitatie licht in epi-fluorescentie, wide-field microscopie-modus met behulp van Nikon 60X/1.0 NA of Zeiss 63X/1.0 NA water dompelen doelstellingen. Onze microscopen zijn met bouten aan een trillingsisolatie tafel en uitgerust met gemotoriseerde beweegbare trappen. Elke microscoop is uitgerust met drie camera-poorten. Een camera-poort heeft een standaard hoge ruimtelijke resolutie CCD camera voor infrarood DIC video-microscopie (IR-1000, Dage MTI, USA). De tweede camera haven heeft een snelle data-acquisitie camera (tot 20 kHz frame rate) met een relatief lage ruimtelijke resolutie (80 x 80 pixels), maar uitstekend dynamisch bereik (14 bits) en uitzonderlijk lage gelezenruis (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). De derde poort camera een CCD camera met hoge ruimtelijke resolutie (PixelFly, 1392x1024 pixels, PCO AG, Duitsland) op een draaiende schijf confocale scanner (CSU-10, Yokogawa, Japan) gebruikt om z-stapels confocale beelden te verzamelen voor gedetailleerde morfologische reconstructie van de gekleurde cel. Een frequentie-verdubbelde diode-gepompte Nd: YVO4 continue laser (400 mW) die uitzendt bij 532 nm (MLL-III/400 mW; CNI, Changchun, China) is de bron van excitatie licht. De 2 mm diameter laserbundel geregeld door een sluiter (LS6; Vincent Associates) is gericht op een lichtgeleider gekoppeld aan de microscoop via een enkele poort epifluorescentie condensor (TILL Photonics GmbH, Gräfelfing, Duitsland) om de rug van de opening te vol objectief zijn en in de buurt gelijkmatige verlichting van het object vliegtuig. Het laserlicht wordt gebruikt in plaats van een conventionele Xenon-lamp om de gevoeligheid van V m-imaging maximaliseren door: (1) met een monochroom excitation licht bij de rode vleugel van het absorptiespectrum aan V m gevoeligheid van de kleurstof 9, 10 en (2) de intensiteit van het excitatie licht boven het niveau dat kan worden bereikt door een boog-lamp te maximaliseren. Het excitatielicht werd gereflecteerd op het preparaat door een dichroïsche spiegel met een centrale golflengte van 560 nm en de gemeten fluorescentie werd door een 610 nm filter barrière (a Schott RG610). Het gecombineerde effect van een verhoging van de lichtintensiteit en het gebruik van vrijwel optimale monochromatische golflengten was een dramatische verbetering in de gevoeligheid van spanning beeldvorming met een factor van ongeveer 50 vergeleken met eerdere metingen 6.
Stap 1.2. Stel voor gelijkmatige verlichting
Gebruik een fluorescentie slide standaard (groen excitatie / rood emissie). Vermeld de betrokken grijsfilters in de laserstraal pad zodat de CCD niet verzadigd. Het doel gericht op het oppervlak vande dia. De positie van het ontvangende einde van de kwarts lichtgeleider voor de laser launcher doel en de positie van de uitgang van de lichtgeleider aan de microscoop met geschikte aandrijvingen op epi-fluorescentie condensor te bereiken gecentreerd en uniforme verlichting van het gezichtsveld.
Stap 1.3. Bepaal vibrationele geluid
Plaats een kleine zwarte inkt markering op het oppervlak van de fluorescentie dia. Record lichtintensiteit met NeuroCCD in de continue opnamemodus. Focus de doelstelling op een donkere rand van de zwarte inkt merk. Noteer de lichtintensiteit voor ongeveer 100 msec bij 2 kHz frame rate. Geven de ruimtelijke gemiddelde van de fractionele lichtintensiteit sporen (AF / F) van ~ 20 pixels Lichtontvangst van het gelijkmatig verlicht gebied en van ~ 20 pixels langs de rand van de inkt merk. De overmaat ruis in opnamen van pixels met een hoog contrast randen weerspiegelt de vibrationele geluid inhet systeem.
Stap 1.4. Trillingsisolatie
Het is verplicht om trillingen te verminderen door een Trillingsisolatie tafel tot onder het schot lawaai lichtintensiteiten vergelijkbaar experimentele opnameomstandigheden. Pas de trillingsisolatie tafel totdat de trilling geluid in de lichtintensiteit van pixels die de scherpe rand van de afbeelding is te verwaarlozen. Geen van de apparatuur met bewegende delen (mechanische sluiters, ventilatoren) worden aangebracht op de tafel. De kabels van de apparatuur op de tafel gehecht aan andere componenten die niet geïsoleerd zijn van trillingen moet los zijn, zodat ze niet mechanische trillingen doorgeven aan de microscoop.
2. Selectie van een geschikte Neuron voor V m-Imaging
Stap 2.1. Selectie van neuronen
Maken hersencoupes volgens standaard procedures. Gebruik een muis tot expressie EGFP in individuele zenuwcellen van iBELANG. Met een draaiende schijf confocale systeem, visualiseren EGFP gelabelde neuronen in de slice. Selecteer neuronen voor V m-beeldvorming met intact dendritische / axonale bomen en processen parallel en dicht bij het oppervlak van de plak. Dit kan niet worden bereikt in wild-type muizen door axonen en dendrieten dunne, voor het grootste deel, niet zichtbaar in DIC microscopie mode.
3. Laden Neuronen met voltage-gevoelige kleurstof
Stap 3.1. Het vullen van de patch pipet
Vul het glas patch pipetten van de tip met kleurstof-vrije intracellulaire oplossing door negatieve druk gedurende ongeveer 15 s tot 2/3 van de electrode taper. De kleurstof vrije oplossing in de punt moet de lekkage van kleurstof te voorkomen op het segment dat de achtergrond fluorescentie verhoogt en verlaagt de signaal-ruisverhouding. Back-vul de elektrode met de oplossing die het membraan impermeant voltagegevoelige kleurstof opgelost JPW3028in intracellulaire oplossing (0,8 mM).
JPW3028, de meest succesvolle voltage probe voor intracellulaire toepassing is een dubbel positief geladen analoog ANEP de reeks lipofiele styrylkleurstoffen nog voldoende water oplosbaar te worden gebruikt voor micro-injectie. De di-ethyl analoog van deze kleurstof heeft vrijwel dezelfde eigenschappen (zoals spanning-gevoeligheid) en is commercieel verkrijgbaar als JPW1114 (zie tabel 1). We bereiden 20 mM voorraad oplossing in gedestilleerd H 2 O. 50 ul aliquots van de stock oplossing worden ingevroren bij -20 ° C. Voor de uiteindelijke kleurstofconcentratie van 0,8 mM wordt 2 pi van de stock oplossing opgelost in 50 pi intracellulaire oplossing op de dag van het experiment. De voorraad kleurstofoplossing is stabiel en kan worden bewaard bij kamertemperatuur gedurende enkele maanden. Zo houden we 50 pi aliquot bij kamertemperatuur totdat het is uitgeput.
Stap 3.2. Snel een giga-seal
Patch vooraf gekozen neuron en laat vrije diffusie van de kleurstof uit een somatische patch pipet om de soma in de hele cel configuratie voor 20-45 min. Het is essentieel om een afdichting zo snel mogelijk te verkrijgen zodat de hoeveelheid kleurstof in oplossing zonder de tip te klein gehouden. Beginnen oefenen snel patchen zonder kleurstof in de elektrode. Vervolgens praktijk patching en laden neuronen met de kleurstof met als doel het gebruik van een minimale hoeveelheid kleurstof-vrije oplossing in de punt zonder contaminerende het omringende weefsel. Met de praktijk is het mogelijk om een afdichting vast binnen 1-2 min.
Stap 3.3. Toezicht op het niveau van kleuring
Tijdens kleurstofdiffusie in het whole-cell configuratie, de fysiologische toestand van de neuron door het opnemen opgewekte actiepotentialen in de stroom-modus klem. Daarnaast controleren het bedrag van vlekken door het opnemen van de rust lichtintensiteit (RLI) uit de cel soma op een frame rate van 2 k Hz en een fractie van volledige lichtintensiteit aangepast met grijsfilters (we 0,04% van de laser lichtintensiteit van een 400 mW laser). Blijven de kleurstof laden totdat de actiepotentiaal begint, verbreden gewoonlijk na 20-40 minuten, afhankelijk van de grootte van de elektrode en weerstand.
De verbreding van de piek is volledig omkeerbaar en waarschijnlijk door capacitieve belasting effect van de verzadigde concentratie van de kleurstof in de somatische membraan. De golfvorm van het spike volledig hersteld na de kleurstof concentratie geëquilibreerd gehele neuron.
Stap 3.4. Verwijder de kleurstof electrode
Aan het einde van periode kleuring voorzichtig trek de patch pipet uit de soma in spanningsklem configuratie zorgen dat de overgang van hele-cel outside-out patch configuratie wordt bereikt in het proces.
Stap 3.5. Wacht kleurstofdiffusie
ent "> Incubeer de plak tegen 1,5-2 uur bij kamertemperatuur te houden met de spanningsgevoelige kleurstof te verspreiden in neuronale processen. Na een aanzienlijke hoeveelheid kleurstof diffundeert weg van de soma naar dendritische en axonale processen, de golfvorm van het AP is volledig gerestaureerd.4. Optical Recording
Stap 4.1. Een cellulair compartiment voor imaging
Zoek de soma van de vlek neuron bij weinig licht niveau fluorescentie en re-patch de neuron met een standaard (geen kleurstof) patch elektrode onder DIC. Visualiseer neuronale processen onder lage lichtniveau op een frame rate van 10-40 Hz in de continue opnamemodus van de CCD voor spanning-imaging. Verminder het lichtniveau met grijsfilters tot het vereiste minimum om het object van belang te visualiseren. We gebruiken 0,01% 400 mW laser intensiteit tijdens het plaatsen van de gekleurde neuron. Met behulp van een XY-fase, de positie van de neuronale proces van belang in thij midden van het opnamegebied. Bescherm de soma van het excitatielicht met de gedeeltelijk gesloten veldstop iris van de microscoop. Afscherming van de soma van hoge intensiteit excitatie licht zal aanzienlijk verminderen van de fotodynamische schade tijdens het opnemen.
Stap 4,2 Record optische signalen met betrekking tot membraanpotentiaal transiënten
Neem optische signalen met betrekking tot backpropagated AP in individuele dendritische takken. Noteer optische signalen over AP in de axon. Neem optische signalen met betrekking tot backpropagating AP in dendritische spines. Gebruik frame rates geschikt voor nauwkeurige reconstructie van signaalgolfvorm en houden de opnameperiodes en blootstelling aan hoge intensiteit excitatielicht zo kort mogelijk kleurstof bleken en fotodynamische schade te minimaliseren. Bijvoorbeeld, het onderzoek van de sequentie van initiatie en propagatie van enkelvoudige actiepotentialen in de axon heeft opnameperiodes van 5-10 msec. De excitatie licht geïntensiveerdty tijdens opname is een compromis tussen de signaal-ruisverhouding enerzijds en de mate van kleurstof bleken en fotodynamische schade anderzijds. We gebruiken 100% van de intensiteit van 400 mW laser in opname van lange stukken axonen bij een gebied van 300 urn in diameter brandt. Wanneer het excitatielicht wordt gefocusseerd 30 urn diameter gebied dendritische spine imaging gebruiken we 10-25% van de laser lichtintensiteit. De vereiste duur van de opname is een belangrijke determinant van de optimale excitatie lichtintensiteit; kortere opname periodes kunnen hogere lichtniveaus. De optimale lichtintensiteit is best empirisch bepaald voor elke bereiding en meetpunt.
5. Data-analyse
Stap 5.1. Corrigeer de ruwe gegevens voor bekende fouten
De analyse en weergave van gegevens werden uitgevoerd met behulp van het NeuroPlex programma (RedShirtImaging) geschreven in IDL (ITT Visual Information Solutionen, Boulder, Colorado) en aangepaste Visual Basic routines. Onder de voorwaarden van lage lichtniveaus, de achtergrond fluorescentie wordt een belangrijke determinant van de AF / F-signaal grootte. De ruwe gegevens werden eerst gecorrigeerd voor dit effect door de gemiddelde achtergrond fluorescentie-intensiteit van een bepaald gebied op de unstained slice. Vervolgens werd het signaal uitlijning software gebruikt om te corrigeren voor tijdelijke jitter in AP initiatie en voor eventuele kleine bewegingen van het preparaat tijdens gemiddeld. In het tijdsdomein werden AP signalen uitgelijnd kruiscorrelatie van het elektrisch opgenomen AP in elk onderzoek het referentiesignaal verkregen bij het begin van middelen (Figuur 1B). In het ruimtelijke domein, werden beelden uitgelijnd in twee dimensies offline door image kruiscorrelatie te compenseren voor mogelijke kleine laterale bewegingen van het preparaat. De juiste focus van het beeld in de z-dimensie werd gecontroleerd voordat elke individuele proces; smal l aanpassingen waren vaak noodzakelijk. De tijd en ruimte uitgelijnd signalen werden gemiddeld zie figuur 1B. Langzame veranderingen in lichtintensiteit door bleken van de kleurstof gecorrigeerd door het data met een geschikte dubbele exponentieel afgeleid van de opname trials zonder stimulatie (Figuur 1B). De golfvorm van het AP signaal gereconstrueerd uit een reeks gegevenspunten met Cubic spline-interpolatie, een stuksgewijze continue curve die door elk gegevenspunt. Te bevestigen dat de spanningsgevoelige kleurstofsignaal membraanpotentiaal nummers zonder significante vervorming in de milliseconde tijdschaal, werd het elektrische signaal van de AP soma vergeleken met de optische AP signaal van de aangrenzende axon heuvel zie figuur 3B. De twee signalen superponeren voet, waardoor het schot ruis in optical recording.
les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg "/>
Figuur 1. Data-analyse (animatie). (A) Bovenste paneel: hoge resolutie confocale beeld van een gekleurd neuron met axon in de opname stand. Registratie-elektrode aan soma en extracellulaire stimulerende elektrode naast basale dendriet schematisch weergegeven. Actiepotentialen opgeroepen door extracellulaire, synaptische stimulatie. Onderpaneel: lage ruimtelijke resolutie fluorescentiebeeld van het axon verkregen CCD voor V m imaging (B) Electrode opnames van soma (zwarte sporen), optische opnamen van AIS (rode sporen), en van knooppunt van Ranvier (groen sporen). . Top sporen: ruwe data van 9 studies waaruit blijkt tijdelijke jitter in AP initiatie. Tweede rij sporen: tijdelijk uitgelijnd signalen. Derde rij van sporen: gemiddelde signaal. Vierde rij van sporen: bleekmiddel correctie. Bottom sporen: cubic spline interpolatie met een pass van tijdelijke smoothing.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Succesvolle confocale microscopie moet tot duidelijke identificatie van intact neuronale processen die dicht bij het oppervlak van de plak en in een vlak van focus. De selectie van zenuwcellen die geschikt zijn voor spanning beeldvorming voorafgaand aan de voltage-gevoelige kleurstof laden is van cruciaal belang. Een voorbeeld van confocale beelden van L5 piramidale neuronen die EGFP in een corticaal segment (Crym transgene muizenlijn) wordt getoond in figuur 2. Axonen van individuele neuronen duidelijk...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit artikel beschrijft een spanningsgevoelige kleurstof registreerwerkwijze voor Electrical activiteit van individuele neuronen met sub-micrometer en een milliseconde spatiotemporele resolutie. Laserexcitatie bij vrijwel optimale golflengte (over signaalgrootte) verbeterde de gevoeligheid van opname met een factor ~ 50 over eerdere benaderingen. De huidige gevoeligheid maakt de controle elektrische signalen uit alle delen van individuele neuronen, met inbegrip van dendrieten, axonen, axon collateralen en axon terminals ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dejan Zecevic verklaart dat hij een mede-eigenaar van RedShirtImaging nuttig., Een bedrijf gespecialiseerd in high-speed, low noise CCD-camera's worden gebruikt in voltage-gevoelige kleurstof opname. Alle andere auteurs melden geen financiële belangen of mogelijke belangenconflicten met betrekking tot de huidige studie.
Wij danken onze medewerkers Knut Holthoff, Arthur Konnerth en Marco Canepari die in de initiële ontwikkeling van deze techniek alsook aan Leslie M. Loew deelgenomen voor vriendelijk het verstrekken van kleurstoffen. Ondersteund door NSF subsidie IOS-0817969, NIH beurzen NS068407 en M136043 en door Kavli Instituut voor Neurowetenschappen aan de Yale University.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het onderdeel | Vennootschap | Catalogusnummer | Opmerkingen (optioneel) |
| Setup componenten | |||
| Upright Microscoop | Olympus Inc | BX51WI | Met drie camera-poorten |
| Gemotoriseerde verplaatsbaar podium | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescentie Condensor voor Olympus BX51 | TILL Fotonica | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscoop | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | Met drie camera-poorten |
| Gemotoriseerde Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescentie Condensor voor Zeiss AxioExaminer | TILL Fotonica | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | Hoge snelheid, lage ruis lezen |
| CCD voor IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocale Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| Hoge ruimtelijke resolutie CCD op Confocale Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392x1024 pixels |
| DPSS CW laser (532 nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co, Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitatielichtbron |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TOT Fotonics | 0000-515-11524 | |
| Sluiter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Tabel | Minus k Technology | MK26 | |
| Specifieke reagentia | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltagegevoelige kleurstof |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg (Crym-EGFP) GF82Gsat/Mmcd | Dun uitdrukken EGFP in Laag 5 corticale neuronen |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen