Techniek skeletspier weefsel van muizen myoblast progenitorcellen en toepassing van elektrische stimulatie

Samenvatting

Engineered spierweefsel heeft een groot potentieel in de regeneratieve geneeskunde, als de ziekte model en ook als een alternatieve bron voor vlees. Hier beschrijven we de constructie van een spier construct, in dit geval van muis myoblast progenitor cellen en stimulering van elektrische pulsen.

Samenvatting

Ontworpen spierweefsel kan worden gebruikt voor verschillende doeleinden, waaronder de productie van weefsel voor gebruik als een ziektemodel in vitro, bijv. decubitus bestuderen voor regeneratieve geneeskunde en als vlees alternatief ^1. De eerste melding 3D spier constructen zijn vele jaren geleden gemaakt en pioniers op het gebied zijn Vandenburgh en collega's ^2,3. Vooruitgang in spierweefsel engineering zijn niet alleen het gevolg van de enorme winst in kennis van de biochemische factoren, stamcellen en progenitorcellen, maar zijn met name gebaseerd op inzichten die door de onderzoekers dat de fysieke factoren een essentiële rol in de controle van cel gedrag spelen en weefsel ontwikkeling. State-of-the-art ontworpen spier bouwt bestaan ​​momenteel uit cel-bevolkte hydrogel constructen. In ons lab deze over het algemeen bestaan ​​uit murine myoblast progenitorcellen, geïsoleerd uit muizen achterste ledematen spieren of een muizen myoblast cellijn C2C12, mixed met een mengsel van collageen / Matrigel en uitgeplaat tussen twee ankerpunten, nabootsen van de spier ligamenten. Andere cellen kunnen eveneens worden overwogen, bijvoorbeeld alternatieve cellijnen zoals L6 myoblasten rat ⁴ neonatale spier afgeleide progenitorcellen ^5, cellen afkomstig van volwassen spierweefsel van andere species zoals humaan ⁶ of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS cellen) ⁷ . Cell contractiliteit veroorzaakt uitlijning van de cellen langs de lengteas van de construct ^8,9 en differentiatie van de spier progenitorcellen na ongeveer een week van cultuur. Bovendien is de toepassing van elektrische stimulatie kan de differentiatie verbeteren enigszins ^8. Vanwege de beperkte omvang (8 x 2 x 0,5 mm) het volledige weefsel kan worden geanalyseerd met behulp van confocale microscopie zoals levensvatbaarheid, differentiatie en celuitlijning controleren. Afhankelijk van de specifieke toepassing van voorschriften voor de engineerood spierweefsel variëren, bijvoorbeeld bij gebruik voor regeneratieve geneeskunde is het opschalen van weefsel grootte en vascularisatie, terwijl om als vleesvariatie vertaling naar andere soorten noodzakelijk.

Protocol

1. Cultuur van Murine myoblast Progenitor Cellen of C2C12 Cellen

1. Isoleer cellen volgens het protocol oorspronkelijk gepubliceerd Shefer en collega's ¹⁰ en later aangepast door Collins et al.. ¹¹ en Boonen et al.. ¹² en bewaar deze in vloeibare stikstof. Dit vereist muizen, bijv. C57Bl / 6. Alternatieve methoden worden in andere laboratoria, bijvoorbeeld een methode, gepubliceerd in Journal of Gevisualiseerde Experimenten door Li Y et al.. ^13. Voor de reagentia en apparatuur wordt verwezen naar de tabel op pagina 7 en 8. Van de spier van een muis kunt u over het algemeen het verkrijgen van voldoende cellen tot ongeveer 20 flesjes in vloeibare stikstof cryopreserveren. Vervolgens beginnen we het protocol bij de cellen van de vloeibare stikstof opslag ontdooien.
2. Plaats de cellen van een flacon in een 25 cm ² Matrigel (1 mg / ml) bekleed weefselkweekfles en voeg groeimedium (GM) bestaande uit (335 ml DMEM advanced, 100 ml foetale bovine serum (FBS), 50 ml HS, 5 ml penicilline / streptomycine, 5 ml L-glutamine, 5 ml kippenembryo extract (CEE)).

Let op: jas voor 2 uur bij kamertemperatuur en de Matrigel door aspiratie te verwijderen.

3. Subcultuur van de cellen ongeveer 01:03 om de 3 dagen.
   Dit betekent: op dag 3: Passage cellen van een 25 cm ² bij een 75 ^cm2 fles, op dag 6: passage cellen van een 75 ^cm2 fles met twee 150 ^cm2 flessen (met 30 min preplating in ongecoate kolven). Op dag 9 overdracht een 150 ^cm2 kolf tot 1 triple ¹⁵⁰ cm2 kolf, of bij ontstentenis drie 150 ^cm2 flessen (indien nodig preplate weer afhankelijk van het fenotype van de cellen). Op dag 12 de cellen klaar voor het zaaien in een spier construct.

Opmerkingen: - Per triple 150 cm ² het aantal cellen zal ongeveer 4,5 x 10 ⁶ cellen.
- Gebruik vials uit verschillende isolaten te mengen tot een gemengde populatie van cellen te verkrijgen op het moment van zaaien.

Opmerking: Als u ervoor kiest niet te werken met primaire cellen, C2C12 myoblasten zijn een goed alternatief.

2. Techniek Skeletal spierweefsel

1. Bereid siliconenlijm door mengen van de "elastomeer" de "hardingsmiddel" (10:1). Cut + / - 5 mm vierkant segmenten van klittenband met een driehoekige kant (huis-achtige vorm; Figuur 1). Lijm het klittenband in de putjes van een 6-wells plaat cultuur in een ruimte van ongeveer 12 mm tussen de pleinen.

Opmerkingen: - Gebruik alleen de zachte kant van het klittenband en het gezicht van deze kant naar boven.
- Zorg ervoor dat de daken naar elkaar toe.
- Alleen de klittenband te bedekken met siliconenlijm, verspreiden zich niet lijmen in de put.
- Voor elektrostimulatie later is relevant voor de constructen lijnen in verticale richting van de put platen (langs de lange as).

2. Laat een nacht drogen in een vacuümoven, niet verwarmd, vooral om luchtbellen te verwijderen. Steriliseer door toevoeging 70% EtOH aan de putjes en incubeer gedurende 15 minuten. Spoel 3x met PBS en onder UV gedurende 15 minuten. Verwijder alle PBS uit de putjes en de klittenband en in incubator tot gebruik.
3. Ontdooien Matrigel oplossing in de koelkast en bereiden collageenoplossing tot de gewenste concentratie kort voordat de 3D constructen. Verdun de stock collageen met steriel 0,02% azijnzuur (eindconcentratie 3,2 mg / ml).

Let op: laat alles op ijs.

4. Trypsinize de cellen, resuspendeer in GM en tellen. Laat cellen in centrifugebuis in de incubator.
5. Voeg de gewenste hoeveelheid Collageen voorraad oplossing voor het aantal constructies die u wilt maken op een buis (volgens tabel 1), voeg 0,5 M NaOH aan deze collageen oplossing totdat een licht roze color aangeeft een pH van 7,5. Meng voorzichtig door en neer te pipetteren zonder blaasjes vorming. Voeg dan de Matrigel en meng zeer grondig, maar voorzichtig. Voeg ten slotte de GM de Collagen / Matrigel mengsel (voor de juiste hoeveelheden zie Tabel 1).

Opmerkingen: - Voer elke stap op het ijs! Matrigel en collageen gel zal gemakkelijk bij toenemende temperatuur.
- Let op dat de kleur inderdaad roze is! Een toename van pH zal induceren snelle gelering.
- Eindconcentratie van collageen: 1,6 mg / ml.

6. Centrifugeer de gewenste hoeveelheid cellen bij 1000 rpm gedurende 5 min en verwijder het supernatant.

Opmerking: - Afhankelijk van de activiteit van de cellen het aantal cellen per construct moet worden aangepast. Typisch, het aantal cellen ligt tussen 750.000 en 1.250.000 cellen per construct.

7. Voor sommige gel mengsel de cel pellet te resuspenderenen breng de cellen in de resterende mengsel en meng grondig, maar zonder dat er luchtbellen.
8. Neem de voorverwarmde well platen uit de incubator en pipet 0,35 -0,4 ml van de cel-gel mengsel in de klittenband eerst. Vervolgens beginnen het mengsel pipet uit het midden tussen de bevestigingsplaatsen en de Velcro verlengen. Gebruik ten slotte de rest van gel op te vullen het gat tussen de twee klittenband ankers en pipet om de klittenband stukken.
9. Controleer zorgvuldig na 5-10 min als de gels zijn solide genoeg om te worden overgedragen, dat wil zeggen tik de gerechten en inspecteer visueel als de gel is stijf. Als dat zo is, plaatst u voorzichtig de schalen in een incubator. Meestal kunnen ze worden opgehaald na tien minuten. Dan, na 1-2 uur voorzichtig bedekken elke gel met 4 ml warm GM.

Let op:-Maak geen krachtige bewegingen bij het ​​hanteren van de platen.

10. Vervang GM door differentiatie medium (groeimediumzonder kippenembryo-extract) na 24 uur, en te vervangen door vers medium om de 2-3 dagen. Op dag 7 moet verkregen rijpe georiënteerde spiervezels, zoals kan worden geëvalueerd met kleuring voor cross strepen ontwikkeling in de gesmolten spiervezels.

3. Elektrische Stimulatie

1. Steriliseer de elektroden van de ionoptix plaat (zie tabel van de reagentia en apparatuur) voor gebruik met 70% ethanol en vervolgens droog onder UV in een veiligheidskabinet. Plaats de plaat met elektroden op de cultuur plaat met de constructen en dek af met het deksel van de petrischaal en overdracht aan een incubator. Sluit de Ionoptix C-pacer met de juiste kabels.

Opmerking: elektroden parallel geplaatst naast de spier construct (figuur 2).

2. Breng de stimulatie protocol zoals verwacht.

Opmerking: We gebruiken over het algemeen 4 V / CM,6ms pulsen met een frequentie van 2 Hz. Wijzig kweekmedium om de 24 uur tijdens de stimulatie.

Resultaten

Het eindproduct wordt spier constructen zoals aangegeven in figuur 3. De grootte van het weefsel zal ongeveer 8 mm lang en 2 mm breed en 0,5 mm dik. Elektrische stimulatie tijdens differentiatie verandert de expressie van myosine zware keten isovormen, maar niet sterk verbeteren van de differentiatieproces zoals geïnduceerd door de differentiatie medium 8, maar elektrische stimulatie kan ook worden toegepast op het einde van het proces om te controleren functionaliteit van de spier omdat een spier met v...

Discussie

De engineering van spierweefsel heeft een groot potentieel voor het gebruik als een ziekte model, voor drug discovery, in de regeneratieve geneeskunde en voor de vleesproductie. Echter, de eisen voor deze toepassingen variëren. We kozen voor werken met een combinatie van collageen en Matrigel, omdat collageen maakt celuitlijning en omdat de myoblast progenitor cellen vereisen de aanwezigheid van basale membraan eiwitten afkomstig zoals bepaald in eerdere studies 2D ^12. Bovendien zijn fibrinegelen getest in on...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
Matrigel-groeifactor verminderd	Beckton en Dickinson
DMEM (hoog glucose) *	Gibco	42430
Geavanceerde DMEM	Gibco	12491
Paardenserum	Gibco	65050-122
Foetaal runderserum	Greiner	758075
0,45 en 0,22 urn spuitfilter *	Whatmann (Schleicher en Scheull)	10462100
L-glutamine	Gibco	25030024
Penicilline / streptomycine	Gibco	10378016
Amfotericine	Gibco	15290-018
Cultuur kunststof	Greiner		Inclusief cultuur kolven en pipetten
Kippenembryo-extract	United States Biological	C3999
Pasteur pipet *	Hilgenberg		Pasteurpipetten, met een vernauwing, met katoen, open tip L: 230 mm met tip diameter van 0,9 - 1,1 mm
Pasteur pipet *	Hilgenberg		Pasteurpipetten, met een vernauwing, met katoen, open tip L: 230 mm met tip diameter van 1,4 - 1,6 mm
Pasteur pipet	VWR	612-1702
Collagenase type I*	Sigma	C0130-16
40 um cel zeef *	BD Falcon	352340
19G naald
Elastomeer	Dow Corning Corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4.210 #
Verharder	Dow Corning Corporation		Silastic MDX 4-4.210 #
Klittenband	Reguliere winkel		U kunt deze kopen bij een reguliere winkel, alleen de zachte kant
Collageen type I, rattenstaart	BD Biosciences	3544236
C-Pace EP Cultuur Pacer	Ionoptix
6-well kweekplaten voor elektrische stimulatie	Beckton Dickinson-Falcon	BD Falcon # 353846
C-Dish cultuur schotel elektroden	Ionoptix
			* Nodig voor de isolatie van cellen (punt 1.1) # Samen in een kit