In dit rapport tonen we de kleuring en analyse stappen van een fenotypering test uitgevoerd op vers volbloed aan grote aangeboren en adaptieve leukocyten populaties te sommen. Wij benadrukken overwegingen voor het uitvoeren van deze procedures in het kader van een multicenter klinische studie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Opsomming van belangrijke perifeer bloed leukocyten populaties voor Multicenter klinische proeven met behulp van een volbloed Fenotypering Assay
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cryopreservatie van perifeer bloed leukocyten wordt op grote schaal gebruikt om cellen voor immune reactie evaluaties te bewaren in klinische studies en biedt vele voordelen voor het gemak en de standaardisatie van immunologische evaluaties, maar nadelige effecten van dit proces zijn waargenomen op sommige cel subsets, zoals granulocyten, B-cellen en dendritische cellen 1-3. Analyseren verse leukocyten geeft een nauwkeuriger beeld van de in vivo toestand van de cellen, maar is vaak moeilijk uit te voeren in het kader van grote klinische studies. Verse cel assays zijn afhankelijk van vrijwilligers verplichtingen en termijnen, en zo tijdrovend, die toepassing niet kan onpraktisch zijn als gevolg van de werktijden nodig zijn van het laboratoriumpersoneel. Bovendien, als proeven worden uitgevoerd op meerdere centra, kunnen de laboratoria met de middelen en opleiding nodig zijn om de tests uit te voeren niet in voldoende nabijheid van klinische plaatsen. Om deze problemen aan te pakken, hebben we ontwikkeld een 11-kleurige antilichaamkleuring paneel dat kan met Trucount buizen (Becton Dickinson, San Jose, CA) gebruikt om fenotype en grote sommen leukocyt populaties in het perifere bloed, waardoor robuuster celtype specifieke informatie dan assays zoals complete bloedbeeld (CBC) of testen met de handel verkrijgbare panelen ontworpen voor Trucount buizen die vlek voor slechts een paar soorten cellen. De kleuring procedure is eenvoudig, vereist slechts 100 ul vers volbloed, en duurt ongeveer 45 minuten, waardoor het mogelijk is voor standaard bloed-processing laboratoria uit te voeren. Het is een bewerking van de BD Trucount buis technische fiche ( versie 8/2010 ). De kleuring antilichaam cocktail worden voorbereid in bulk in een centraal laboratorium assay en overgebracht naar de verwerking ter labs. Stained buizen kunnen worden vastgestelden ingevroren voor verzending naar de centrale test laboratorium voor veelkleurige flowcytometrie-analyse. De gegevens die uit deze kleuring paneel kan worden gebruikt om veranderingen in concentraties leukocyten tijd met betrekking tot interventie volgen en gemakkelijk verder worden ontwikkeld om activatie toestand van specifieke celtypen plaats beoordelen. In dit rapport tonen we de procedure die door bloed-processing laboranten om vlekken uit te voeren op vers volbloed en de stappen om deze gekleurde monsters te analyseren op een centrale test laboratorium ter ondersteuning van een multicenter klinische studie. De video beschrijft de procedure zoals deze wordt uitgevoerd in het kader van een klinische proef bloed trekken in de HIV Vaccine Trials Network (HVTN).
Protocol
Opmerking: Om de fluorofoor-geconjugeerde antilichamen beschermen tegen licht, voert u alle stappen in een bio-safety kast met het licht uit.
1. Antilichaamkleuring Panel Voorbereiding
- Het antilichaam kleuring panel vindt in tabel 1. Antilichaamconcentratie worden bepaald door titratie met volbloed en dezelfde flowcytometrie apparatuur en procedures die worden gebruikt om de gekleurde monsters fenotypering verwerven.
- Zodra geschikte kleuring titers worden bepaald, combineren antilichamen in een mengsel in een lock-cap tube. Toevoegen stroom wasbuffer (Dulbecco's PBS met 2% door hitte geïnactiveerd foetaal runderserum) het totale volume op 100 pl brengen. Schaal het mengsel voor het aantal monsters gekleurd. Dit mengsel kan worden opgeslagen bij 4 ° C tot acht weken.
2. Kleuring
- Als het opgevangen bloed wordt gebruikt voor andere doeleinden in advoorwaarde deze assay stel een aliquot leggen terwijl meer tijdgevoelige procedures worden uitgevoerd op het resterende bloed. De hoeveelheid kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur tot 4 uur na venapunctie zonder significant celverlies.
- Controleer of er een intact kraal pellet onderaan de Trucount buis en de buis label identificeren monster gekleurd. In HVTN klinische studies, het Laboratorium Data Management Systeem (Frontier Science and Technology Research Foundation, Amherst, NY) wordt gebruikt om te labelen en te volgen gekleurd monsters.
- Noteer de lotnummers en vervaldata van alle reagentia. Noteer de Trucount buis kraal tellen nummer dat door de fabrikant op de zak van buizen, zorg ervoor dat het lotnummer op de zak overeenkomt met het lotnummer op de buis.
- Gebruik reverse pipetteren tot 100 ul volbloed nauwkeurig pipetteren in de Trucount buis, net boven de metalen houder. Vermijd smeren bloed langs de zijkant van de buis.
- Behulp van reguliere (forward) pipetteertechniek, Pipetteer 100 ul van de gemengde antilichaamkleuring panel (zie tabel 1) in de Trucount buis. Doe het buisje en vortex bij lage snelheid gedurende ongeveer 15 sec te mengen. Inspecteer de buis zodat de kraal pellet volledig is opgelost.
- Incubeer de Trucount buis gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (15-30 ° C) in het donker.
- Indien nodig, Verdun een hoeveelheid van 10 × FACS lyserende oplossing voor 1X met DIH 2 O. Voeg 900 ul 1 x FACS lyserende oplossing aan de buis.
- Grondig Doe het buisje dicht en vortex bij lage snelheid gedurende ongeveer 15 sec om te mengen. Druk de dop stevig in vergrendeling positie op de buis en afdichting met laboratorium film.
- Bewaar het buisje bij -65 ° C tot -95 ° C totdat het monster gereed is voor verzending naar de centrale analytisch laboratorium of voor analyse in huis. Monsters stabiel in dit stadium gedurende ten minste vier weken. Indien verzending of het testen onmiddellijkdellijk kan deze stap worden weggelaten.
3. Scheepvaart
Opmerking: De volgende instructies maken gebruik van een geïsoleerde verzendkosten systeem van Saf-T-Pak, Inc speciaal ontworpen voor de scheepvaart categorie B vrijgesteld biologische stoffen volgens de International Air and Transport Association (IATA) regelgeving. Als de analyse van de monsters op dezelfde locatie als de kleuring opgetreden, ga dan naar hoofdstuk 4.
- Monsters kunnen verzonden worden onmiddellijk na kleuring of nadat ze ingevroren bij -65 ° C tot -95 ° C. Volledig Wikkel elke buis in folie en plaats in de gekleurde monster box. Leg de gekleurde monster doos in een lekvrije poly-bag met absorberend materiaal.
- Plaats de lekvrij poly-bag en de inhoud in een Tyvek zak en sluit met zo weinig mogelijk lucht in de zak.
- Plaats het preparaat pakket (specimen in de secundaire verpakking) in de binnenste bruine doos.
- Plaats de binnenste bruine bos in de piepschuim borst, vastzetten in de inkeping op de veranderende voorkomen.
- Vul het piepschuim borst met droog ijs (circa 8 kg) en stevig leg het deksel op de borst.
- Veilig tape de doos en het schip als biologische stof, categorie B (UN3373) met de juiste Dry Ice (UN1845) markeringen; volg IATA PI-650-instructies.
- Na ontvangst monsters worden bewaard bij -65 ° C tot -95 ° C tot ze geanalyseerd.
4. Ontdooien en flowcytometrie-analyse
- Verwijder het gekleurde monster uit de diepvries bij kamertemperatuur in het donker ontdooien voor het verzamelen op de flowcytometer. Als het verzamelen van gegevens over meer dan een monster, standaardiseren van het proces voor alle buizen door spreiden ontdooien, zodat de buizen niet zitten bij kamertemperatuur gedurende meer dan 1 uur.
- Monster wordt verkregen met een vier laser stromingscytometer uitgerust met geschikte filters, zoals BD LSRII. Gebruik standaard cytometer kalibratie en fluorescentie vergoeding methoden voor het verzamelen van gegevens 4.
Opmerking: Gebruik geen vooruit gezet verstrooien of zijwaartse verstrooiing drempels tijdens het verzamelen 5. Trucount kralen kunnen beneden de laagste drempelwaarde voor deze parameters veroorzaken van een subset van kralen niet meegeteld tijdens de analyse. Indien vereist door het instrument op een drempel vast te stellen, stelt u de laagst mogelijke Am Cyan kanaal drempel. Omdat CD45 + leukocyten gekleurd met het panel zal worden Am Cyaan positief, en Trucount kralen ook fluoresceren in het Am Cyaan kanaal, moet dit zorgen voor alle relevante gegevens op passende wijze worden verzameld.
- Vortex het monster buis gedurende 5 sec voordat u op de flowcytometer. Trucount kralen fluoresceren zeer in veel kanalen. Poort de kralen tijdens het verzamelen door het vinden van de bevolking die sterk dubbel positief is voor PE Cy5 en APC (de twee colors dat het gemakkelijkst de kralen onderscheiden van de cellen is afhankelijk van instrumentatie). Selecteer de kraal poort als uw stoppen poort, en opnemen van gegevens tot ten minste 20.000 kralen zijn verworven.
- Analyseren van de gegevens met behulp van geschikte software, zoals FlowJo (Treestar, Ashland, OR). Figuur 1 toont de gating systeem gebruikt voor analyse van verschillende leukocyt populaties zijn van een controle bloedafname.
5. Trucount Berekeningen
- Elke Trucount buis bevat een gevriesdroogd pellet van fluorescerende kralen. Na het toevoegen in de buis en vortexen moeten de korrels worden gelijkmatig verdeeld in het monster. Het aantal kralen in de pellet varieert enigszins door het lot nummer en is te vinden op de opbergzak voor de buizen.
- Gate Trucount de kralen en celpopulaties zoals getoond in figuur 1 naar event tellingen te bepalen voor elke populatie. Vergelijken van het aantal events in de kraal gate het totale aantal kralen oorspronkelijk in de buis kunt u de verhouding van monster verzameld, die vervolgens kunnen worden gebruikt om de absolute concentratie (dwz cellen / pl) bepalen voor elke populatie te bepalen. De volgende vergelijking kan worden gebruikt voor dit doel: celconcentratie (# cellen / ul volbloed) = [# populatie events / (# bead events / # totaal beads in pellet)] / 100 pl.
6. Representatieve resultaten
Figuur 1. Gating regeling gebruikt voor de analyse van grote populaties leukocyten met representatieve gegevens van een gezonde vrijwilliger. A) Trucount kralen (i) zijn gated en uitgesloten van cellen. Granulocyten (ii) worden afgebakend en lympohcytes en monocyten zijn onderverdeeld in 3 popluations: CD14negatieve lymfocyten (iii) alle CD14 negatieve cellen (iv), en niet-lymfocyten (v). B) CD14 negatieve lymfocyten gated om CD4 + T-cellen (vi), CD8 + T-cellen (vii), B-cellen (viii), CD56 bright NK cellen (ix), CD56 dim NK cellen (x) en CD56 negatieve NK cellen onderscheiden (xi). C) Alle CD14 negatieve cellen te gated myeloïde (xii) en plasmacytoïde (xiii) dendritische cellen onderscheiden. D) niet-lympocytes zijn gated aan niet-klassieke (xiv), intermediair (xv), en klassieke (xvi) monocyten te onderscheiden. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Meer specifieke cel subsets die niet worden getoond in Figuur 1 (bijv. NKT cellen of neutrofielen) kan ook worden onderscheiden met het paneel we presenteren en de gating regeling kan worden uitgebreid of aangepast voor specifieke studie behoeften. Bepaalde stappen zijn weergegeven gating uniek voor deze methode. Van bijzonder belang, de opneming poort enuitsluiting gate getrokken rond de Trucount kralen en bovenop elkaar, een aan de gate korrels te tellen, en een aan de beads sluiten van de cellulaire analyse (Figuur 1A). Ook omdat lymfocyten, monocyten en granulocyten niet zo gemakkelijk onderscheiden in volbloed als in perifeer bloed mononucleaire cellen door voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing, gating deze cellen met CD45 expressie en zijwaartse verstrooiing vaak noodzakelijk (Figuur 1A). Verontreinigende granulocyten (omcirkeld) die niet konden worden gescheiden van lymfocyten en monocyten met CD45 en zijwaartse verstrooiing te onderscheiden in sommige plaatsen met hoge CD16 expressie (Figuur 1C en fig. 1D). Het aantal verontreinigende granulocyten meestal klein en ze niet interfereren met monocyt en NK cel gating.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit rapport presenteren we een kraal-gebaseerde methode voor het opsommen van leukocyten populaties in vers volbloed door flowcytometrie en hebben betrekking op de parameters die nodig zijn voor het gebruik ervan in een multicenter klinische studie met gecentraliseerde monsteranalyse. Deze methode is gebaseerd op en optimaliseert de BD Trucount protocol en maakt het zijn betrouwbaar gebruik in een multicenter klinische studie setting. De kleuring test is eenvoudig en duurt ongeveer 45 minuten uit te voeren, waardoor ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij danken Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain en Stephen Voght voor hun hulp bij de ontwikkeling van deze methode, manuscript en video.
Dit werk werd ondersteund door de Bill en Melinda Gates Foundation CAVD subsidie 38.645 (MJM) en National Institutes of Health subsidies UM1 AI068618 en U01 AI069481 (MJM). EA-N. wordt ondersteund door NIH Grant T32 AI007140. Wij danken de James B. Pendleton Charitable Trust voor hun genereuze uitrusting donatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagens Naam | Vennootschap | Catalogusnummer | |
| Trucount Absolute telbuizen | BD Biosciences | 340334 | |
| 10X FACS lyserende oplossing | BD Biosciences | 349202 | |
| Categorie B & Vrijgesteld Shipping Systeem, Geïsoleerde | Saf-T-Pak | STP-320 | |
| CD45 monoklonaal antilichaam AmCyan | BD Biosciences | 339192 | |
| CD3 FITC monoklonaal antilichaam | BD Biosciences | 349201 | |
| PerCP CD8-Cy 5,5 monoklonaal antilichaam | BD Biosciences | 341051 | |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoklonale Antibody | BD Biosciences | 557922 | |
| HLA-DR ECD monoklonaal antilichaam | Beckman Coulter | IM3636 | |
| CD14 monoklonaal antilichaam V450 | BD Biosciences | 560349 | |
| CD19 monoklonaal antilichaam PE | BD Biosciences | 555413 | |
| CD16 APC-H7 monoklonaal antilichaam | BD Biosciences | 560195 | |
| CD56 PE-Cy7 monoklonaal antilichaam | BD Biosciences | 335791 | |
| CD11c APC monoklonaal antilichaam | BD Biosciences | 559877 | |
| CD123 PE-Cy5 monoklonaal antilichaam | BD Biosciences | 551065 |
Referenties
- Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories. Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).
- Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure. Blood. 56, 237-245 (1980).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).
- Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42, 327-346 (2000).
- Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials. J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).
- Kantor, A. B., Roederer, M. The handbook of Experimental Immunology. Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. 43, 1-49 (1996).
- Hulspas, R. Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates. Cytometry A. 75, 966-972 (2009).
- Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism. Cytometry A. 75, 882-890 (2009).
- Mandy, F., Brando, B. Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6(2001).
- Vuckovic, S. Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay. J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).
- Lichtner, M. Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response. Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).
- Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram. Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
