Methodenartikel

Synthese van Phase-shift Nanoemulsions met smalle Grootte Uitkeringen voor akoestische Droplet-verdamping en Bubble-enhanced Ultrasound-gemedieerde Ablation

10.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/4308

⸱

13 september 2012

 ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Boston University

In dit artikel

Samenvatting

Faseverschuiving nanoemulsions (PSNE) kan worden verdampt met behulp van High Intensity Focused Ultrasound bij plaatselijke verwarming te verbeteren en thermische ablatie in tumoren te verbeteren. In dit rapport wordt de bereiding van stabiele PSNE met een smalle grootteverdeling beschreven. Bovendien is de impact van de verdampte PSNE op echografie-gemedieerde ablatie aangetoond in weefsel-nabootsende fantomen.

Samenvatting

High-intensity focused ultrasound (HIFU) wordt klinisch gebruikt om thermisch ablatie tumoren. Om plaatselijke verwarming verhogen en thermische ablatie in tumoren, zijn lipiden gecoate perfluorkoolstof druppeltjes ontwikkeld die worden verdampt door HIFU. De bloedvaten in veel tumoren abnormaal lek vanwege hun snelle groei en nanodeeltjes kunnen de fenestraties dringen en passief accumuleren in tumoren. Zo kan het regelen van de grootte van de druppeltjes tot een betere accumulatie in tumoren. In dit rapport wordt de bereiding van stabiele druppeltjes in een faseverschuiving nanoemulsion (PSNE) met een smalle grootteverdeling beschreven. PSNE werden gesynthetiseerd door sonicatie een lipideoplossing in aanwezigheid van vloeistof perfluorkoolstof. Een smalle grootteverdeling werd verkregen door het extruderen van de PSNE meerdere keren met filters met poriegrootten van 100 of 200 nm. De grootteverdeling werd gemeten over een periode van 7 dagen met behulp van dynamische lichtverstrooiing. Polyacrylamide hydrogelen met PSNE werden voorbereid voor in vitro experimenten. PSNE druppeltjes in de hydrogelen werden verdampt met ultrageluid en het resulterende bellen versterkt plaatselijke verhitting. Verdampte PSNE laat sneller verwarmen en vermindert ook de ultrasone intensiteit nodig voor thermische ablatie. Aldus wordt verwacht PSNE thermische ablatie in tumoren bevorderen, mogelijk verbeteren van therapeutische resultaten van HIFU gemedieerde thermische ablatie behandelingen.

Protocol

1. Voorbereiding van Phase-shift Nanoemulsion (PSNE)

  1. Los 11 mg DPPC en 1,68 mg DSPE-PEG2000 in chloroform
  2. Damp het organisch oplosmiddel om een ​​droge lipide film vormen in een glazen rondbodemkolf
  3. 'S nachts Dessicate de lipide film
  4. Hydrateren de lipidefilm met 5,5 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)
  5. Warmte oplossing in een 45 ° C waterbad lipidefilm oplost, vortexen periodiek
  6. Breng lipideoplossing in 7 ml flacon
  7. Sonificeer lipideoplossing gedurende 2 minuten bij 20% amplitude
  8. Verdeel oplossing in twee injectieflacons met 2,5 ml per stuk (gooi de resterende 0,5 ml)
  9. Voeg 2,5 ml PBS aan elk flesje
  10. Plaats elke flacon in een 0 ° C bad met ijswater
  11. Voeg 50 ul DDFP aan elk flesje
  12. Sonificeer iedere injectieflacon in het ijs-waterbad met de volgende instellingen: 25% amplitude, gepulste mode (10 sec aan, 50 sec uit), 60 sec totaal op tijd
  13. Transfer PSNE oplossingen 20 ml scintillatieflesjes
  14. Voeg 5 ml PBS aan elk flesje, resulterend in 10 ml eindvolume
  15. Monteer extruder volgende aanwijzingen door de fabrikant
    1. Spoel elk deel met gedeïoniseerd water
    2. Plaats de roestvrijstalen plaat in het midden van de filter draagvlak
    3. De roestvrijstalen gaas boven de roestvrijstalen disc
    4. Met een pincet, het plaatsen van een extruder afvoer schijf membraan (glimmende kant naar boven) op de roestvrij stalen gaas
    5. Met een pincet, plaatst u de extruder filter (glimmende kant naar boven) op de afvoer schijf membraan
    6. Plaats de kleine O-ring op het filter en plaats de thermobarrel en extruder top boven het draagvlak
    7. Gedeeltelijk draai elke vleugel-moer, daarna volledig draai de vleugel-moeren met de hand in een afwisselend
    8. Sluit de extrudereen stikstof gasleiding
    9. Om de extruder, pipet 10 ml gedeïoniseerd water primen in de top monsterpoort, dop de opening en draai het ontluchtingsventiel
    10. Langzaam de stikstof gasleiding naar de druk te verhogen, waardoor het monster door de membranen en verzamel het monster uit de uitlaat buis
    11. Na gebruik, demonteren in omgekeerde volgorde, spoel de extruder delen met gedeïoniseerd water, en gooi de membraanfilter en membraan afvoer schijf
  16. Voor 100 nm druppels alleen, conditio sine qua non PSNE door het extruderen van 10 keer door middel van 200 nm filter
  17. Extrude PSNE 16 keer door middel van 100 nm of 200 nm filter om smalle grootteverdeling te verkrijgen

2. Bereiding van Polyacrylamide hydrogel die PSNE

  1. Bereid 24% BSA-oplossing door verdunning van 1,2 g BSA poeder in 5 ml gedeïoniseerd water
  2. Bereid 10% APS oplossing door verdunde 0,1 g APS poeder in 1 ml gedeïoniseerd water
  3. In deze volgorde mengen 2,1 ml acrylamide-oplossing, 1,2 ml Tris-buffer, 0,1 ml 10% APS, 4,5 ml 24% BSA oplossing en 3,6 ml gedeïoniseerd water in plastic kamer
  4. Verwarm tot 40 ° C en plaats onder vacuüm gedurende 1 uur
  5. Voeg 480 ul van PSNE en grondig mengen door voorzichtig schudden de plastic kamer.
  6. Voeg 12 ul TEMED en zet de kamer in een 12 ° C waterbad gedurende 2 uur

3. Representatieve resultaten

Een schema van de opstelling voor experimenten met ultrageluid weefsel gelijkende hydrogel fantomen wordt getoond in Figuur 1. Dit protocol resulteert in lipiden gecoate perfluorkoolstof druppeltjes met een smalle grootteverdeling die stabiel in oplossing zijn voor minstens een week. De grootteverdeling gemeten met dynamische lichtverstrooiing (90Plus Particle Size Analyzer, Brookhaven Instruments, Ronkonkoma) wordt getoond in figuur 2 voor PSNE geëxtrudeerd met 100 en 200nm filters. De effectieve diameter PSNE tijd, gemeten met dynamische lichtverstrooiing, is in tabel 1, waaruit blijkt dat PSNE stabiel zijn gedurende ten minste een week. B-modus beelden van PSNE voor en na verdamping in een polyacrylamide hydrogel worden getoond in Figuur 3. Ook een laesie gevormd door 15 sec van HIFU gemedieerde verwarming in een polyacrylamide hydrogel die albumine en PSNE is weergegeven in figuur 4. De asymmetrische vorm van de laesie is een gevolg van verwarming prefocal die optreedt door de aanwezigheid van de bel wolk in de ultrasone pad. Het is belangrijk dat prefocal verwarming en lesie door verstrooiing van bellen mee kan worden geminimaliseerd door het verminderen van de uitgezonden akoestische vermogen.

figure-protocol-1
Figuur 1. Schematische weergave van de experimentele opstelling voor ultrasone experimenten met weefsel-mimIcking hydrogelen.

figure-protocol-2
Figuur 2. Grootteverdeling van PSNE geëxtrudeerd door 100 nm of 200 nm filters, gemeten met dynamische lichtverstrooiing. De eenheden van de ordinaat assen gebaseerd op de intensiteit van het verstrooide licht uit deeltjes van een bepaalde grootte betrokken op het totale verstrooide lichtintensiteit van het monster.

figure-protocol-3
Figuur 3. B-modus beelden (a) vóór en (b) na verdamping PSNE in een polyacrylamide hydrogel. De pijl geeft de focale gebied waar een bel wolk gevormd door PSNE verdamping.

figure-protocol-4
Figuur 4. Beelden van polyacrylamide hydrogel die albumine en PSNE (a) vóór en (b) na verdamping en sonicatie met HIFU, waaruit lesie als gevolg van ultrageluid geïnduceerde verwarming. De ultrasone middenfrequentie was 3,3 MHz. Het ultrasone signaal bestond uit een eerste 30 cycli, 6,4 W puls PSNE verdampen, onmiddellijk gevolgd door 15 sec continu ultrageluid op 0,77 W.

Dagen na de extrusie Geëxtrudeerd met 200 nm filter Geëxtrudeerd met 100 nm filter
Mean Dia. (Nm) Std. Dev. (Nm) Mean Dia. (Nm) Std. Dev. (Nm)
1 182,9 4,9 118,0 0,9
7 177,7 2,5 124,8 3,1

Tabel 1. Gemiddelde diameter en standaarddeviatie van PSNE op een en zeven dagen na extrusie met 100 nm en 200 nm filters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

High-intensity focused ultrasound (HIFU) wordt klinisch gebruikt om thermisch ablatie tumoren. 1 Om plaatselijke verwarming te versterken en te verbeteren thermische ablatie in tumoren, hebben lipiden gecoate perfluorkoolstof druppels ontwikkeld die kunnen worden verdampt door HIFU. De bloedvaten in veel tumoren abnormaal lek vanwege hun snelle groei. '2, Nanodeeltjes kunnen de fenestraties dringen en passief verzamelen in tumoren, een proces dat de verhoogde permeabiliteit en retentie (EPR) ef...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een BU / CIMIT Toegepaste Gezondheidszorg Techniek Predoctoraal Fellowship, een National Science Foundation Verbreding van de deelname Onderzoek Initiatie Grant in de ingenieurswetenschappen (BRIGE) en de National Institutes of Health (R21EB0094930).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Common Name Fabrikant Cat. Aantal Volledige Naam / Beschrijving
DPPC Avanti Lipiden, Alabaster, AL, Verenigde Staten 850355P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine
DSPE-PEG2000 Avanti Lipiden, Alabaster, AL, Verenigde Staten 880120P 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[methoxy (polyethyleenglycol) -2,000] (ammoniumzout)
DDFP Fluoromed, Round Rock, TX, Verenigde Staten CAS: 138495-42-8 Dodecafluorpentaan (C 5 F 12)
PBS Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA P2194 Fosfaat gebufferde zoutoplossing
Chloroform Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 372978 Chloroform
Acrylamide Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9926 40% 19:1 acrylamide / bis-acrylamide
Tris buffer Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA T2694 1M, pH 8, Trizma hydrochloride en Trizma base
BSA Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A3059 Runderserumalbumine
APS Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A3678 Ammoniumpersulfaat oplossing
TEMED Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 87689 N, N, N ', N'-tetramethylethyleendiamine
Uitrusting
Sonicator (3 mm tip) Sonics & Materials, Inc, Newtown, CT, USA Vibra-Cell
Waterbad Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Verenigde Staten Neslab EX-7
Extruder Noord-Lipiden, Burnaby, BC, Canada Lipex
Extruder Filters Whatman, Piscataway, NJ, USA Nuclepore # 110605 en # 110606
Extruder Drain Disc Sterlitech Corporation, Kent, WA, Verenigde Staten # PETEDD25100
Plastic kamer VS Plastic Corporation, Lima, OH, Verenigde Staten # 55288, 1 3/16 "x1 3/16" x2 7/16 "

Referenties

  1. Hynynen, K., Darkazanli, A., Unger, E., Schenck, J. F. MRI-guided noninvasive ultrasound surgery. Med. Phys. 20, 107-115 (1993).
  2. Baban, D. F., Seymour, L. W. Control of tumour vascular permeability. Adv. Drug Deliv. Rev. 34, 109-119 (1998).
  3. Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J. Control. Release. 65, 271-284 (2000).
  4. Schadlich, A. Tumor accumulation of NIR fluorescent PEG-PLA nanoparticles: impact of particle size and human xenograft tumor model. ACS Nano. 5, 8710-8720 (2011).
  5. Williams, R. Convertible perfluorocarbon droplets for cancer detection and therapy. 2010 IEEE Ultrasonics Symposium. , (2010).
  6. Martz, T. D., Sheeran, P. S., Bardin, D., Lee, A. P., Dayton, P. A. Precision manufacture of phase-change perfluorocarbon droplets using microfluidics. Ultrasound Med. Biol. 37, 1952-1957 (2011).
  7. Giesecke, T., Hynynen, K. Ultrasound-mediated cavitation thresholds of liquid perfluorocarbon droplets in vitro. Ultrasound Med. Biol. 29, 1359-1365 (2003).
  8. Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and Acoustic Studies of a New Phase-Shift Agent for Diagnostic and Therapeutic Ultrasound. Langmuir. 27, 10412-10420 (2011).
  9. Sheeran, P. S. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound Med. Biol. 37, 1518-1530 (2011).
  10. Zhang, P. The Application of Phase-Shift Nanoemulsion in High Intensity Focused Ultrasound: An In Vitro Study [Doctoral Dissertation]. , (2011).
  11. Allen, T. M., Hansen, C., Martin, F., Redemann, C., Yau-Young, A. Liposomes containing synthetic lipid derivatives of poly(ethylene glycol) show prolonged circulation half-lives in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1066, 29-36 (1991).
  12. Klibanov, A. L., Maruyama, K., Beckerleg, A. M., Torchilin, V. P., Huang, L. Activity of amphipathic poly(ethylene glycol) 5000 to prolong the circulation time of liposomes depends on the liposome size and is unfavorable for immunoliposome binding to target. Biochim. Biophys. Acta. 1062, 142-148 (1991).
  13. Klibanov, A. L., Maryama, K., Torchilin, V. P., Huang, L. Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes. FEBS Lett. 268, 235-237 (1990).
  14. Gabizon, A. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of Doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54, 987-992 (1994).
  15. Awasthi, V. D., Garcia, D., Goins, B. A., Philips, W. T. Circulation and biodistribution profiles of long-circulating PEG-liposomes of various sizes in rabbits. Int. J. Pharm. 253, 121-132 (2003).
  16. Zhang, P., Porter, T. An in vitro study of a phase-shift nanoemulsion: a potential nucleation agent for bubble-enhanced HIFU tumor ablation. Ultrasound Med. Biol. 36, 1856-1866 (2010).
  17. Lafon, C. Gel phantom for use in high-intensity focused ultrasound dosimetry. Ultrasound Med. Biol. 31, 1383-1389 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

smalle grootteverdelingdynamische lichtverstrooiingextrusieprotocollipide gecoate druppelsbel versterkte verhittingHIFU thermische ablatiepolyacrylamide hydrogel

Gerelateerde artikelen