Methodenartikel

Mobiele Tracking Met behulp van Photoconvertible eiwitten tijdens ontwikkeling van de zebravis

DOI:

10.3791/4350

⸱

28 september 2012

 ,  , 
1Max Delbrück Center for Molecular Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een methode voor de fotogeactiveerde omschakeling van fotoconverteerbare fluorescente eiwitten (PCFP's) in het levende zebravis-embryo en verder volgen van fotogeconverteerd eiwit op specifieke tijdstippen tijdens de ontwikkeling. Deze methodologie maakt het mogelijk om celbiologische gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan verschillende ontwikkelingsprocessen in een levend gewerveld organisme te monitoren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embryogenese is een dynamisch proces dat het beste kan worden bestudeerd met behulp van technieken die het mogelijk maken om ontwikkelingsveranderingen in vivo te documenteren. Het gebruik van genetisch gecodeerde fluorescente eiwitten heeft zich bewezen als een waardevolle strategie voor het verduidelijken van dynamische morfogenetische processen zoals ze zich voordoen in het intacte organisme. Gedurende het afgelopen decennium heeft de ontwikkeling van fotoactiveerbare en fotoconverteerbare fluorescente eiwitten de mogelijkheid geopend om het lot van discrete subpopulaties van gelabelde eiwitten te onderzoeken1. In tegenstelling tot fotoactiveerbare eiwitten, kunnen fotoconverteerbare fluorescente eiwitten (PCFP's) gemakkelijk worden gevolgd en geïmagineerd in hun native emissietoestand voorafgaand aan fotoconversie, waardoor het gemakkelijker wordt om regio's te identificeren en te selecteren door optische inspectie. PCFP's, zoals Kaede2, KikGR3, Dendra4 en EosFP5, kunnen van groen naar rood worden verschoven na blootstelling aan UV of blauw licht als gevolg van een His-Tyr-Gly tripeptidesequentie die een groen chromofoor vormt dat kan worden fotogeconverteerd naar een rood chromofoor door een licht-gekatalyseerde β-eliminatie en daaropvolgende uitbreiding van een π-geconjugeerd systeem3. PCFP's en hun monomere varianten zijn nuttige hulpmiddelen voor het volgen van cellen6-10 en respectievelijk voor het bestuderen van eiwitdynamica11-14. In de afgelopen jaren zijn PCFP's geëxprimeerd in verschillende diermodellen, zoals zebravis6, kip7,8 en muis9,10 voor celbestemmingstracering. Hier rapporteren we een protocol voor celspecifieke fotoconversie van PCFP's in het levende zebravis-embryo en verder volgen van fotogeconverteerde eiwitten in latere ontwikkelingsstadia. Deze methodologie maakt het mogelijk om, op weefselspecifieke wijze, cellibiologische gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan morfogenese in het diermodel van zebravis te bestuderen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Verkrijgen van embryo's voor de fotoconversietest

Bij het inkruisen van transgene zebravissen die een PCFP tot expressie brengen, worden de helderste homozygote embryo's gekozen en gekweekt op 28,5 °C tot het gewenste embryonale stadium15.

Opmerking 1: Deze preselectie maakt het mogelijk om embryo's te scannen met een lage laservermogen en zodoende fototoxiciteit en fotobleken te voorkomen.

Opmerking 2: We raden aan om een licht met lage intensiteit te gebruiken bij het visualiseren van embryo's en om ze in het donker te houden vanwege de hoge gevoeligheid van PCFP's, zoals Kaede en KikGR, voor lichtblootstelling, inclusief daglicht.

2. Insluiting

  1. Dechorioneer embryo's in een glazen bak met eierwater onder een stereomicroscoop met behulp van een pincet.
  2. Verdoof de embryo's door een dechorioneerde embryo over te brengen in een oplossing van 0,16 mg/ml Tricaine (3-amino benzoëzuurethylester, Sigma-Aldrich) (40μl van een 4 mg/ml stockoplossing in 1 ml E3 medium 1X).

Opmerking 1: Breng embryo's over met een glazen pipette of een afgesneden tip (P1000) om het risico op beschadiging van de embryo's te minimaliseren.

Opmerking 2: Jonge gedechorioneerde embryo's mogen niet worden blootgesteld aan lucht of opgetild tot het water/lucht grensvlak, omdat de eieren gemakkelijk scheuren wanneer ze worden onderworpen aan mechanische stress.

  1. Breng het verdoofde embryo over op het deksel van een kweekschaal en houd het embryo binnen het kleinst mogelijke volume medium.
  2. Breng het embryo over in agarose door het embryo te pipetten met 1% lage smelttemperatuur agarose (LMA, Lonza) bij 30 °C bevattend 0,16 mg/ml Tricaine, en plaats het op de dekglas van een kweekschaal met dekglasbodem (MatTek Corp. Ashland MA VS). Orienteer vervolgens het embryo met behulp van een gladde kunststof tip (bijv. een afgesneden Microloader Pipette Tip, Eppendorf) en bedek, wanneer de LMA gepolymeriseerd is, agarose met 0,16 mg/ml Tricaine-oplossing.

Opmerking 1: Smelt 1% LMA bij 60 °C en houd gesmolten agarose bij 30 °C.

3. Fotoconversie

  1. Op een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een 405 nm, 488nm en 561nm laserbron, zoals de Zeiss LSM 710, visualiseer het monster door een z-Stack-scan die de hele structuur van het specimen dat later zal worden gefotoconverteerd en gevolgd, te bestrijken met behulp van de 488 nm laser (d.w.z., 30 mW Ar laser, bij 5-7% intensiteit, detector ingesteld op 493-540 nm) en de 561 nm laser (d.w.z., 10 mW DPSS 561 laser, bij 7-9% intensiteit, detector ingesteld op 587-651) om het weefsel/orgaan te scannen op groene en rode fluorescentie van de fotoconverteerbare eiwitten, respectievelijk.

Opmerking 1: Voor de scan vóór fotoconversie, gebruikten we een Plan Apochromat 20x/NA 0.8 objectief.

Opmerking 2: Scan altijd naar rode fluorescentie vóór het experiment om uit te sluiten dat er eventueel gegenereerde rode geconverteerde PCFP aanwezig is.

  1. Selecteer het Tijdsreeks gereedschap en stel het in voor 2 cycli zonder interval (een voor pre- en een voor post-fotoconversie).
  2. Selecteer het Gebieden gereedschap en definieer een of meer gebieden van interesse (ROI) voor fotoconversie.

Opmerking 1: We raden aan om eerst te bepalen hoe nauwkeurig het gebied dat daadwerkelijk door de scanlaser in de ROI wordt gefoto-geconverteerd overeenkomt met het geselecteerde ROI in de software, door het gebied van fotogeconverteerd weefsel/cellen te meten in alle drie richtingen (xy en z) in een vast specimen waar geen cel- of eiwitbeweging wordt verwacht. Voor de in deze toepassing beschreven instellingen, kwam het ROI overeen met het fotogeconverteerde gebied met grote nauwkeurigheid, maar dit hangt af van het gebruikte objectief en de hoeveelheid laserlicht die voor fotoconversie wordt toegepast. De grootte van het ROI kan worden verkleind tot de grootte van een enkele cel, afhankelijk van de numerieke opening van het objectief, de zoomfactor en de hoeveelheid laserlicht die voor fotoconversie wordt gebruikt.

  1. Selecteer het Verbleken gereedschap en stel in om te beginnen met verbleken na scan 1 van 2. We gebruikten een 30 mW 405 nm diodelaser voor fotoconversie en optimaliseerden zorgvuldig voor de minimale hoeveelheid laserlicht die nodig is voor volledige fotoconversie, wat meestal wordt bereikt door de intensiteit van het laserlicht, de scaniteraties van de ROI en de pixeltijd (d.w.z. scannelsnelheid) te variëren.

Opmerking 1: Voor fotoconversie gebruikten we een Plan Apochromat 20x/NA 0.8 objectief.

Opmerking 2: De vermogens van de laser en het aantal iteraties moeten empirisch worden bepaald voor elke experimentele instelling en moeten zorgen voor de volledige fotoconversie van groen naar rood PCFP binnen het ROI met de minimaal noodzakelijke hoeveelheid laserlicht om fototoxiciteit te verminderen. We raden aan om tests te starten met een lage laservermogen (bijv. 3 %, overeenkomend met 0,03 mW in het objectiefplan) gecombineerd met een laag aantal iteraties (bijv. 20), en vervolgens het laservermogen te verhogen totdat volledige fotoconversie is bereikt, wat in onze handen op 10% laservermogen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren zijn transgene diermodellen voor de expressie van fotoomkeerbare eiwitten zoals Kaede of KikGR gegenereerd. Deze dieren ontwikkelen zich normaal, wat aangeeft dat deze eiwitten geen toxische effecten hebben op de embryonale ontwikkeling. Het eerste rapport over een fotoconversie-assay voor het volgen van cellen in dierlijke embryo's werd uitgevoerd door Hatta en medewerkers door het injecteren van mRNA of DNA dat codeert voor Kaede in eencellig zebravisembryo's voor ubiquiteit expressie, of door exp...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Dr. Ian C. Scott voor het vriendelijk ter beschikking stellen van de zebravis transgene Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 lijn in het Hospital for Sick Children, Toronto, Canada. We danken de Confocal en 2-Photon Microscopie Kernfaciliteit (Max-Delbrueck-Center voor Moleculaire Geneeskunde) en Dr. Zoltan Cseresnyes, voor uitstekende technische assistentie en algemene ondersteuning bij de beeldvorming. S.A.-S. wordt ondersteund door een Heisenberg fellowship van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Dit werk werd ondersteund door DFG-subsidie SE2016/7-1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materialen:
Benodigde apparatuur voor het kweken van vissen en het verzamelen van eieren (zie de Zebrafish Book22 voor details).
StereomicroscoopLeicaLecia MZ6 StereomicroscoopUitgerust met laser die werkt op 488 nm
Confocale laserscanningmicroscoopZeissZeiss LSM 710 NLOuitgerust met lasers die werken op 488 nm, 561 nm en 405 nm
Verwarmingsblok
Paar Dumont #5 pincet
Kweekschaal met glazen bodemMatTek CorpAshland MA USA
Microloader Pipette TipsEppendorf
Vortex
naalden
Reagentia:
Eiwater medium
60 μg/ml Instant Ocean Zeezout in ddH2O
E3 medium
5 mM NaCl
0,17 mM KCl
0,33 mM CaCl2
0,33 mM MgSO4
0,00001% (w/v) Methyleenblauw
4 mg/ml Tricaine voorraadoplossing
400 mg Tricaine (3-amino benzoëzuurethylester)Sigma-Aldrich
97,9 ml ddH2O
2,1 ml 1M Tris (pH9)
Aanpassen op pH 7, opdelen in aliquoten en bewaren op -20 °C
1% LMA (Laag smeltende temperatuur agarose, Lonza)
1g LMA/100 ml E3 medium 1X
Opdelen in aliquoten en bewaren op 4 °C

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).
  2. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 12651-12656 (2002).
  3. Tsutsui, H., Karasawa, S., Shimizu, H., Nukina, N., Miyawaki, A. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. EMBO Rep. 6, 233-238 (2005).
  4. Gurskaya, N. G., Verkhusha, V. V., Shcheglov, A. S., Staroverov, D. B., Chepurnykh, T. V., Fradkov, A. F., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
  5. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Rocker, C., Salih, A., Spindler, K. D., Nienhaus, G. U. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15905-15910 (2004).
  6. Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat. Protoc. 1, 960-967 (2006).
  7. Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev. Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
  8. Kulesa, P. M., Teddy, J. M., Stark, D. A., Smith, S. E., McLennan, R. Neural crest invasion is a spatially-ordered progression into the head with higher cell proliferation at the migratory front as revealed by the photoactivatable protein, KikGR. Dev. Biol. 316, 275-287 (2008).
  9. Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Dev. Biol. 9, 49(2009).
  10. Griswold, S. L., Sajja, K. C., Jang, C. W., Behringer, R. R. Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time-lapse imaging during development. Genesis. 49, 591-598 (2011).
  11. Baker, S. M., Buckheit, R. W. 3rd, Falk, M. M. Green-to-red photoconvertible fluorescent proteins: tracking cell and protein dynamics on standard wide-field mercury arc-based microscopes. BMC Cell Biol. 11, 15(2010).
  12. Watanabe, S., Punge, A., Hollopeter, G., Willig, K. I., Hobson, R. J., Davis, M. W., Hell, S. W., Jorgensen, E. M. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).
  13. Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944(2008).
  14. Fang, Z., Takizawa, N., Wilson, K. A., Smith, T. C., Delprato, A., Davidson, M. W., Lambright, D. G., Luna, E. J. The membrane-associated protein, supervillin, accelerates F-actin-dependent rapid integrin recycling and cell motility. Traffic. 11, 782-799 (2010).
  15. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  16. Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Dev. Biol. 230, 278-301 (2001).
  17. Lazic, S., Scott, I. C. Mef2cb regulates late myocardial cell addition from a second heart field-like population of progenitors in zebrafish. Dev. Biol. 354, 123-133 (2011).
  18. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
  19. Godinho, L. Live imaging of zebrafish development. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 770-777 (2011).
  20. Curran, K., Lister, J. A., Kunkel, G. R., Prendergast, A., Parichy, D. M., Raible, D. W. Interplay between Foxd3 and Mitf regulates cell fate plasticity in the zebrafish neural crest. Dev. Biol. 344, 107-118 (2010).
  21. Nienhaus, G. U., Nienhaus, K., Holzle, A., Ivanchenko, S., Renzi, F., Oswald, F., Wolff, M., Schmitt, F., Rocker, C., Vallone, B., Weidemann, W., Heilker, R., Nar, H., Wiedenmann, J. Photoconvertible fluorescent protein EosFP: biophysical properties and cell biology applications. Photochem. Photobiol. 82, 351-358 (2006).
  22. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Confocal MicroscopyPhoto ConversionFluorescent ProteinsTissue Specific ExpressionLow Melting Temperature AgaroseEgg Water MaintenanceEndothelial Cell Tracking

Gerelateerde artikelen