Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Virale nanopartikels voor

17K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/4352

⸱

16 november 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University , 2Department of Biomedical Engineering, Radiology, and Materials Science and Engineering, Case Western Reserve University

In dit artikel

Samenvatting

Plant virale nanodeeltjes (VNPs) zijn veelbelovend platform voor toepassingen in de medische biologie. Hier beschrijven we de procedures voor plantaardige VNP vermeerdering, zuivering, karakterisering, en bioconjugatie. Ten slotte tonen we de toepassing van VNPs voor tumor homing en beeldvorming met behulp van een muis xenograft model en fluorescentie beeldvorming.

Samenvatting

Het gebruik van nanomaterialen heeft de potentie om materialen wetenschap en geneeskunde een revolutie. Momenteel worden verschillende nanodeeltjes onderzocht voor toepassing in beeldvorming en therapie. Virale nanodeeltjes (VNPs) afgeleid van planten kan worden beschouwd als zelf-geassembleerde bionanomaterials met verschillende grootten en vormen. Plantenvirussen onderzochte in de Steinmetz lab zijn icosahedrale deeltjes gevormd door Cowpea mosaic virus (CPMV) en Brome mosaic virus (BMV), die beide 30 nm in diameter. We ontwikkelen ook staafvormig en filamenteuze structuren afgeleid van de volgende plantenvirussen: Tobacco mosaic virus (TMV), die stijve staven vormen met afmetingen van 300 nm met 18 nm en aardappelvirus X (PVX) die draadvormige deeltjes vormen 515 nm lang en 13 nm breed (wordt verwezen naar refs. 1 en 2 voor meer informatie over VNPs).

in planta, zijn uitzonderlijk stabiel en biocompatibel zijn. Ook VNPs zijn "geprogrammeerd" eenheden, die specifiek kunnen worden gemanipuleerd met behulp van genetische modificatie of chemische methoden bioconjugatie 3. De structuur van VNPs is bekend dat atomaire resolutie, en wijzigingen kunnen worden uitgevoerd met ruimtelijke precisie op het atomaire niveau 4, een niveau van controle die niet kan worden bereikt met behulp van synthetische nanomaterialen met de huidige state-of-the-art technologieën.

In dit artikel beschrijven we de verspreiding van CPMV, PVX, TMV, en BMV in Vigna ungiuculata en Nicotiana benthamiana planten. Extractie en zuivering protocollen voor elke VNP gegeven. Methoden voor het karakteriseren van gezuiverd en chemisch gelabelde VNPs beschreven. In dit onderzoek richten we ons op chemical etikettering van VNPs met fluoroforen (bijv. Alexa Fluor 647) en polyethyleenglycol (PEG). De kleurstoffen vergemakkelijken volg-en detectiesysteem van de VNPs 5-10, en PEG vermindert immunogeniciteit van het eiwitachtige nanodeeltjes terwijl het verbeteren van hun farmacokinetiek 8,11. We laten zien tumor homing van gePEGyleerde VNPs gebruik van een muis xenograft tumor model. Een combinatie van fluorescentie beeldvorming van weefsels ex vivo met Maestro Imaging System, fluorescentie kwantificering in gehomogeniseerde weefsels, en confocale microscopie wordt gebruikt om biodistributie te bestuderen. VNPs worden gewist via het reticulo-endotheliale systeem (RES); tumor homing wordt passief bereikt via de verbeterde doorlaatbaarheid en retentie (EPR) effect 12. De VNP nanotechnologie is een krachtige plug-and-play-technologie om beeld en te behandelen plaatsen van de ziekte in vivo. Wij blijven VNPs van drugs ladingen en klinisch relevante imaging eenheden, alsmede weefsel-specifieke liganden dragen naargericht moleculaire receptoren tot overexpressie gebracht in kanker en cardiovasculaire aandoeningen.

Protocol

1. VNP (CPMV, BMV, PVX, en TMV) Propagatie

  1. Stel de kamerplant kamer controlemiddelen om de 15 uur van de dag (100% licht, 25 ° C, 65% luchtvochtigheid) en 9 uur van de nacht (0% licht, 22 ° C, 60% luchtvochtigheid).
  2. Inoculeer planten volgens de tijdlijn in tabel 1.
CPMV PVX, TMV en BMV
Dag 0: Plant 3 cowpea zaden / pot. Dag 0: Plant ~ 30 N. benthamiana zaden / pot. Bemesten een keer per week met 1 eetlepel meststof / 5 L water.
Dag 14: Re-pot N. benthamiana op 1 plant / pot.
Dag 10: Infect verlaat primaire bladeren met CPMV (5 μg/50 ul / blad) door mechanische inoculatie met behulp van een dun laagje van carborundum. Dag 28: Infect drie tot five bladeren met PVX, TMV, of BMV (5 μg/50 ul / blad) door mechanische inoculatie met behulp van een dun laagje van carborundum.
Dag 20: Harvest bladeren en op te slaan in -80 ° C. Dag 42: Harvest bladeren en op te slaan in -80 ° C.

Tabel 1. Tijdlijn voor de teelt, infecteren, en oogsten bladeren.

Opmerking: alleen CPMV voortplanting wordt aangetoond als een voorbeeld.

2. VNP (CPMV, BMV, PVX, en TMV) Zuivering

Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd op ijs of bij 4 ° C.

  1. Meng 100 g bevroren bladeren in een standaard mixer met 2 volumes koude buffer (zie tabel 2). Filtreer door 2-3 lagen kaasdoek.
  2. Voor PVX, breng de pH op 6,5 met behulp van 1 M HCl. Voeg 0,2% (w / v) ascorbinezuur en 0,2% (w / v) natrium sulfite.
  3. Centrifugeer ruwe fabriek homogenaat bij 5.500 xg gedurende 20 minuten. Verzamel supernatant.
  4. Voor BMV, laag 25 ml supernatant over 5 ml van 10% (w / v) sucroseoplossing. Centrifugeer bij 9000 xg gedurende 3 uur en resuspendeer in pellets 38,5% CsCl oplossing (w / v). Mix op door gedurende 5 uur, ga dan verder met stap 2.12.
  5. Extraheren plantaardig materiaal door het toevoegen van 0,7 volumes van 1:1 (v / v) chloroform :1-butanol. Roer het mengsel gedurende 30-60 minuten.
  6. Centrifugeer bij 5.500 xg oplossing gedurende 20 minuten. Verzamel de bovenste waterige fase.
  7. Voeg NaCl tot 0,2 M en 8% (w / v) PEG (MW 8.000). Voor TMV ook met 1% (v / v) Triton X-100. Roer gedurende ten minste 1 uur, laat zitten gedurende ten minste 1 uur.
  8. Centrifugeer bij 15.000 xg oplossing gedurende 15 minuten. Hersuspendeer pellet in 10 ml buffer. Voor PVX, voeg 0,1% β-mercaptoethanol en ureum tot 0,5 M.
  9. Centrifugeer bij 8.000 g gedurende 30 min en verzamel supernatant.
  10. Ultracentrifuge supernatant bij 160.000 xg gedurende 3 uur. Resuspendeer de pellet in 5 ml buffer overnight.
  11. Bereid een 10-40% sucrosegradiënt met gelijke volumes van 10%, 20%, 30% en 40% sucrose in buffer (zwaarste eerst). Laat de gradiënt om 's nachts evenwicht bij kamertemperatuur.
  12. Ultracentrifuge geresuspendeerde pellet dan sucrose gradiënt op 100.000 xg gedurende 2 uur (24 uur voor BMV).
  13. Verzamel lichtverstrooiing band en dialyseren tegen buffer.
  14. Karakteriseren VNPs (hieronder) en bewaar bij 4 ° C. Voor langdurige opslag, bewaren bij -80 ° C.
CPMV en TMV 0,1 M kaliumfosfaatbuffer (pH 7,0)
38,5 mM KH 2 PO 4
61,5 mM K 2 HPO 4
PVX 0,5 M boraatbuffer (pH 7,8)
0,5 M boorzuur
Breng de pH met NaOH
BMV SAMA buffer (pH 4,5)
250 mM natriumacetaat
10 mM MgCl2
2 mM β-mercaptoethanol (voeg vers)

Tabel 2. Buffers en hun recepten voor elke VNP.

Opmerking: alleen CPMV voortplanting wordt aangetoond als een voorbeeld.

3. VNP (CPMV, BMV, PVX, en TMV) Karakterisering

  1. Voer UV / zichtbaar spectroscopie om de concentratie van VNPs bepalen.
    1. Meet de absorptie van 2 pl monster met een NanoDrop spectrofotometer.
    2. De concentratie van deeltjes en kleurstoffen met de Beer-Lambert law (A = εcl, waarbij A de absorptie, ε de extinctiecoëfficiënt, c de concentratie is en L de weglengte). De weglengte 0,1 cm voor de NanoDrop.
      De VNP-specifieke extinctie coëfficiënten zijn:
      CPMV: 8,1 cm -1 -1 mg ml (bij 260 nm)
      PVX: 2,97 cm -1 -1 mg ml (bij 260 nm)
      TMV: 3,0 cm -1 -1 mg ml (bij 260 nm)
      BMV: 5,15 cm -1 -1 mg ml (bij 260 nm)
  2. Analyseer deeltjes per grootte-uitsluiting snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC).
    1. Met een Superose 6 grootte-exclusiekolom en de ÄKTA Explorer, belasting 50-100 ug VNPs in 200 pl 0,1 M kaliumfosfaatbuffer (pH 7,0).
    2. Stel detectors tot 260 nm (nucleïnezuur), 280 nm (proteïne), en de golflengte van de bijgevoegde kleurstoffen.
    3. Gelopen bij een stroomsnelheid van 0,5 ml / min gedurende 72 min.
    4. De elutieprofiel en A260: A280 nm geeft aan of de VNP voorbereiding zuiver is en of deeltjes zijn intact en gemonteerd.
      De volgende A260: 280 verhoudingen dan een zuiver preparaat VNP:
      CPMV: 1,8 ± 0,1
      PVX: 1,2 ± 0,1
      TMV:1,1 ± 0,1
      BMV: 1,7 ± ​​0,1
  3. Voer denaturerende (prefab NuPAGE) Bis-Tris 4-12% polyacrylamide gradiënt gel elektroforese om de zuiverheid van de bereiding en conjugatie analyseren individuele manteleiwitten.
    1. 3 ml 4x LDS-monsterbuffer van 10 ug van de deeltjes in 9 pl kaliumfosfaatbuffer. Een extra 1 ul van 4x LDS-monsterbuffer en 3 pl β-mercaptoethanol aan BMV het grote aantal disulfidebindingen verminderen.
    2. Incubeer in warmteblok gedurende 5 minuten bij 100 ° C.
    3. Laad monsters op een SDS-gel.
    4. Draaien monsters bij 200 V gedurende 1 uur in 1 x MOPS loopbuffer.
    5. Documenteer de gel onder UV-licht om fluorescerende manteleiwitten visualiseren.
    6. Voor niet-fluorescerend eiwit vlek met Coomassie blauw (0,25% (w / v) Coomassie Brilliant Blue R-250, 30% (v / v) methanol, 10% (v / v) azijnzuur) gedurende 1 uur.
    7. Destain met 30% methanol, 10% azijnzuur gedurende de nacht. Change oplossing indien nodig.
    8. Documenteer de gel onder wit licht.
  4. Analyseren integriteit van deeltjes door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM).
    1. Verdun monsters 0,1-1 mg / ml in 20 ui DI water.
    2. Breng 20 pl druppels van de monsters op Parafilm.
    3. Bedek druppels met een TEM rooster en laat zitten voor 2 minuten. Wick de overtollige oplossing op de grid met filtreerpapier.
    4. Was net door het toestel op een daling van DI-water dan wicking droog.
    5. Vlek net door het op een 20 ul druppel 2% (w / v) uranylacetaat gedurende 2 minuten. Wick het overtollige vlek met filtreerpapier.
    6. Was net nog eens in het water.
    7. Let op raster onder een transmissie-elektronenmicroscoop.

4. Chemische conjugatie van PEG en VNPs met fluoroforen, zuivering en karakterisering

  1. Voor berekeningen voor de reacties onder de molaire massa van het VNPs zijn:
    CPMV: 5,6x 10 6 g / mol
    PVX: 35 x 10 6 g / mol
    TMV: 41 x 10 6 g / mol
    BMV: 4,6 x 10 6 g / mol
  2. Conjugaat kleurstoffen en PEG het oppervlak van lysines en CPMV PVX middels een stap N-hydroxysuccinimide koppelingsreactie: Voeg 2,500 molaire equivalenten (alle molaire overmaat zie molaire overmaat per VNP) van Alexa Fluor 647 succinimidyl ester en 4.500 equivalenten NHS- PEG (MW 5.000) opgelost in DMSO om CPMV in 0,1 M kaliumfosfaatbuffer. Bij het werken met PVX, voeg een 10.000 molaire overmaat van NHS-kleurstof en NHS-PEG. Stel de buffer en DMSO volumes zodanig dat de eindconcentratie van CPMV en PVX is 2 mg / ml DMSO en gehalte 10% van het totale reactievolume. Incubeer het reactiemengsel overnacht bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. CPMV en PVX hebben 300 en 1270 adresseerbare lysines, respectievelijk. (Verwezen wordt naar de volgende verwijzingen voor verdere lezingchemische modificatie van CPMV en PVX: 13-15).
  3. Conjugaat kleurstoffen en PEG tyrosines van TMV door diazonium koppeling gevolgd door koper (I)-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie.
    1. Bereid diazoniumzout (alkyn) door 400 ul 0,3 M p-tolueensulfonzuurmonohydraat, 25 ul van 3,0 M natriumnitriet en 75 pl van 0,68 M gedestilleerd 3-ethynylaniline opgelost in acetonitril bij 4 ° C gedurende 1 uur.
    2. Voeg 3,3 ml boraatbuffer, pH 8,8, die 100 mM NaCl tot 1,25 ml van TMV (20 mg / ml voorraadoplossing).
    3. Reageren de TMV met 450 ul van het diazoniumzout (alkyn) oplossing in een ijsbad gedurende 3 uur toevoegen een alkyn ligatie te hanteren door TMV diazonium koppeling. De oplossing zal veranderen in een licht bruine kleur. TMV heeft 2140 beschikbaar tyrosines voor conjugatie.
    4. Zuiver het eindproduct met een sucrosekussen zoals beschreven in stap 4.4.
    5. Bevestig azide-functionele Alexa Fluor 647 en PEG-azide (MW 5.000) using koper (I)-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC). Voeg 2 equivalenten kleurstof en PEG-azide per manteleiwit en incubeer met 1 mM CuSO 4, 2 mM AMG en 2 mM natrium ascorbaat bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Stel het volume buffer zodanig dat de uiteindelijke concentratie van TMV reactie is 2 mg / ml. (Verwezen wordt naar de volgende verwijzingen voor verdere lezing chemische modificatie van TMV: 16,17).
  4. Conjugaat kleurstoffen lysines en PEG cysteïnen van BMV cysteine ​​mutant (cBMV):
    1. Voeg 2000 molequivalenten Oregon Green 488 succinimidylester opgelost in DMSO om cBMV in 0,1 M TNKM buffer (50 mM Tris base, 50 mM NaCl, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, pH 7,4). Stel de buffer en DMSO volumes zodanig dat de eindconcentratie van BMV is 1 mg / ml DMSO en gehalte 10% van het totale reactievolume. 'S nachts Incubeer het reactiemengsel bij 4 ° C beschermd tegen licht.
    2. Purify deeltjes met behulp van Centrifugal filters zoals beschreven in stap 4.4.
    3. Voeg 2,000 molaire overmaat van PEG-maleïmide (MW 2.000) met dezelfde reactieomstandigheden als voorheen en incubeer het reactiemengsel gedurende 2 uur bij 4 ° C. cBMV heeft 180 reactief lysines en cysteïnes. (Verwezen wordt naar de volgende verwijzingen voor verdere lezing chemische modificatie van BMV: 18).
  5. Zuivering: laat de oplossing door een 40% (w / v) sucrose kussen 160.000 xg gedurende 2,5 uur. Re-los de pellet op in buffer. Als alternatief dialyseren tegen een passende buffer met behulp van 10 kDa cut-off spin-filters.
  6. Karakterisering: gePEGyleerde en fluorescent-gelabelde VNPs worden geanalyseerd met de hierboven beschreven werkwijzen: UV / zichtbare spectroscopie, SDS gel elektroforese, FPLC en TEM (niet getoond, maar zie figuren 6 en 7).

5. Tumor targeting en imaging met behulp van een muis xenograft model

  1. Cultuur HT-29 menselijke colonkankercellen in RPMI medium aangevuld met 5% FBS, 1% penicilline-streptomycine en 1% L-glutamine bij 37 ° C in 5% CO2 met 175 cm 2 celkweek kolven.
  2. Was tweemaal cellen met steriel PBS en geoogst door incubatie met 5 ml trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Inactiveren de trypsine met 5 ml RPMI medium. Verzamel cellen door centrifugeren bij 500 xg gedurende 5 minuten. bij 4 ° C en resuspendeer in vers RPMI op 5x10 6 cells/50 ul medium (het totaal aan cellen met trypan blauw en een hemocytometer). Te mengen met een gelijk volume Matrigel de injectie (om al oplossingen en steriele reagentia).
  3. Procure zes weken oude NCR nu / nu muizen en hen op een luzerne vrij dieet voor 2 weken. [Opmerking:. Procedures waarbij dieren worden moet IACUC goedgekeurd] Laten tumorxenotransplantaten door subcutane injectie van 5x10 6 cellen/100 pl / tumor in de flanken (2 tumoren / muis) met behulp van een 18 1/2 meter sterielenaald. Regelmatig toezicht op de dieren. Meet de tumorgrootte met calipers en laat de tumoren groeien tot een gemiddelde volume van 20 mm3 (binnen 12 dagen). Wijs muizen op twee verschillende groepen willekeurig: PBS en VNP (n = 3 dieren / groep / tijdstip). Met een 1 ml insulinespuit 28 gauge, toedienen door intraveneuze injectie staartader 100 pi steriel PBS of 10 mg / kg VNP formulering.

Opmerking: Weefselkweek experimenten en studies met levende dieren zullen niet worden aangetoond. Hands-on demonstratie zal worden beperkt tot weefsel verwerking en data-acquisitie. Voor een verwijzing op de HT-29 tumor xenograft model, wordt verwezen naar ref. 19

Drie technieken worden gebruikt om tumor homing van VNPs evalueren:

  1. Fluorescentie beeldvorming met Maestro Imaging System: Sacrifice muizen op verschillende tijdstippen (2, 24 en 72 uur) met behulp van CO2gas. Prepareer de dieren en accijnzen alle belangrijke organen (hersenen, hart, longen, milt, nieren en lever), samen met de tumoren op de flanken, plaatst u de weefsels op parafilm en analyseren met fluorescentie beeldvorming instrument met behulp van gele excitatie-en emissie filters (800 ms blootstelling) de aanwezigheid van fluorescentiesignalen in de weefsels (afgeleid van A647 label geconjugeerd met het VNPs) detecteren. Sla de afbeeldingen en analyseren fluorescerende intensiteit met behulp van ImageJ 1.44o software ( http://imagej.nih.gov/ij ). Vergelijk de patroon van opname van de VNPs in tumoren met andere belangrijke weefsels met de tijd.
  2. Na beeldvorming, snijd elk weefsel in de helft en insluiten ene helft in OCT compound voor cryo-snijden en confocale analyse. Verzamel de andere helft in vooraf gewogen cryobuisjes en onmiddellijk te bevriezen ze met behulp van vloeibare N 2. Bij -80 ° C tot gereed voor verdere verwerking.
  3. Fluorescentie kwantificering: Resnoer weefsels gewichten. Ontdooi bevroren weefsels bij kamertemperatuur en plaats ze in afzonderlijke 50 ml Falcon buizen met 1 ml PBS. Als u een draagbare weefsel homogenisator, Homogeniseer de weefsels gedurende 2-3 minuten in PBS en transporteert dan het homogenaat om microfugebuizen. Centrifugeer de homogenaten gedurende 10 min bij 13.000 xg niet-gehomogeniseerde weefsel.
  4. Pipetteer 100 ul van de supernatant uit de weefsels van elke groep (PBS formuleringen en VNP / tijdstippen) in een 384 putjes zwarte UV plaat. Evalueer fluorescentie-intensiteit (Ex / Em golflengten 600/665) met behulp van een bord lezer. Normaliseren van de verkregen fluorescentie waarden door het weefsel gewichten.
  5. Immunohistochemie: Bereid cryo-microtoom secties (10 micrometer) en bewaar bij -20 ° C. Vlek weefselsecties voor celkernen (DAPI) en endotheliale celmarker (FITC-gelabeld anti-muis CD31 antilichaam). Voer confocale microscopie analyse aan de vasculaire en intra-tumorale lokalisatie van fluorescentie-gemerkt VNP kaarts.

Opmerking: Deze procedure wordt niet aangetoond representatieve gegevens worden weergegeven in figuur 8. Voor een overzicht van immunohistochemie en kleuring beschreven werkwijzen wordt verwezen naar ref 19.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Vergelijkende analyse van plantengroei; experimentele opzet, studie van bladkleurvariatie, chlorosemethode.
Figuur 1. Planten geïnfecteerd met plantenvirussen. Vigna unguiculata-planten geïnfecteerd met CPMV (A). Nicotiana benthamiana-planten geïnfecteerd met PVX (B), TMV (C) en BMV (D). De foto's zijn genomen ongeveer 10 dagen na infecti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol verschaft een benadering voor de chemische modificatie van VNPs en hun toepassingen in vivo tumor imaging. Het dier fluorescentie beeldvorming, fluorescentie kwantificering en immunohistochemie technieken hier gepresenteerd zijn nuttig voor het bestuderen van biologische verdeling en evalueren van tumor homing. Deze technieken leveren waardevolle informatie over de toegang van de nanodeeltjes aan de tumor via de EPR effect. Door de resultaten van de verschillende analysemethoden, krijgen we een kra...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NIH / NIBIB subsidies R00 EB009105 (tot NFS) en P30 EB011317 (tot NFS), een NIH / NIBIB opleiding subsidie ​​T32 EB007509 (tot AMW), een Case Western Reserve University Interdisciplinair Alliance Investment Grant (tot NFS), en een zaak Comprehensive Cancer Center subsidie ​​P30 CA043703 (tot NFS). Wij danken het Steinmetz-Lab undergraduate student onderzoekers voor hun hands-on ondersteuning: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Dus, en Paul Chariou .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Productie van VNP's
BinnenplantenkamerPercival ScientificE-41L2
V. unguiculata zaden (California black-eye no. 5)Burpee51771A
N. benthamiana zadenN. benthamiana-zaden waren een geschenk van het Salk Institute. Zaden worden geproduceerd via plantpropagatie.
CarborundumFisherC192-500
Pro-mix BX potgrondPremier Horticulture713400
Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite meststofJR Peters77860
Apparatuur
50,2 Ti-rotorBeckman337901
SW 32 Ti-rotorBeckman369694
Optima L-90K ultracentrifugeBeckman365672
SLA-3000 rotorThermo Scientific07149
SS-34 rotorThermo Scientific28020
Sorvall RC-6 Plus centrifugeThermo Scientific46910
PolypropyleenflesBeckman355607Voor rotor SLA-3000
PolycarbonaatflesBeckman357002Voor SS-34 rotor
Ultra-Clear buisBeckman344058Voor sucrosegradiënt en SW 32 Ti-rotor
PolycarbonaatflesBeckman355618Voor pelletering en 50.2 Ti-rotor
NanoDrop-spectrofotometerThermo ScientificNanoDrop2000c
PowerEase 500 pre-cast gelsysteemInvitrogenEI8675EU
Superose 6 10/300 GL (24 ml) grootte-uitsluitingskolomGE Healthcare17-5172-01
ÄKTA Explorer 100 chromatograafGE Healthcare28-4062-66
Allegra X-12RBeckman392302Tafelcentrifuge
CryostaatLeicaCM1850
Maestro 2Caliper Life SciencesIn vivo beeldvormingssysteem
WeefselscheurderBiospec Products985370-395
MicroplaatlezerTecanInfinite-200
Transmissie-elektronenmicroscoopZEISSLibra 200FE
FluoView laser-scanning confocale microscoopOlympusFV1000
Chemicaliën en reagentia
3-ethynylanilineSigma Aldrich498289-5G
zwarte 384-wells plaatBD Biosciences353285
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS-gelInvitrogenNP0321BOX
4X LDS-monsterbufferInvitrogenNP0008
AzijnzuurFisherA385-500
AcetonitrilSigma Aldrich271004-1L
Alexa Fluor 647-azideInvitrogenA10277
Alexa Fluor 647 carbonzuur, succinimidylesterInvitrogenA20006
Amicon Ultra-0,5 ml centrifugale filtersMilliporeUFC50109610 kDa cut-off
AminoguanidinehydrochlorideAcros Organics36891-0250
BoorzuurFisherA74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250FisherBP101-25
CsClAcros Organics42285-1000
DAPIMP Biomedicals157574
DimethylsulfoxideFisherBP231-100
FilterpapierFisher09-801KP5-kwaliteit
FITC anti-muis CD31BioLegend102406
GeitenserumInvitrogen16210-064
KClFisherBP366-500
natriumzout van L-ascorbinezuurAcros Organics35268-0050
MethanolFisherA412P-4
MgCl₂2FisherBP214-500
ObjectglazenFisher12-544-3
MicroscoopdekglaasjeVWR48366-277
MOPS-bufferInvitrogenNP0001
mPEG-malNanocapsulesPG1-ML-2kMW 2000
mPEG-N3NanocrystalsPG1-AZ-5kMW 5000
mPEG-NHSNanocristallenPG1-SC-5kMw 5000
NaClFisherBP358-212
Oregon Green 488 succinimidylester *6-isomeer*InvitrogenO-6149
p-tolueensulfonzuurmonohydraatAcros Organics13902-0050
PermountFisherSP15-100
Kaliumfosfaat dibasischFisherBP363-1
Kaliumfosfaat monobasischFisherBP362-1
NatriumacetaatFisherBP333-500
NatriumnitrietAcros Organics42435-0050
NatriumsulfietAmresco0628-500G
SucroseFisherS6-500
TEM-gridTed PellaFCF-400Cu
Tris-baseFisherBP152-500
Triton X-100EMD ChemicalsTX1568-1
β-mercapto–ethanolFisherO3446I-100
Weefselkweek
Foetaal runderserumInvitrogen12483-020
HemocytometerFisher0267110
HT-29-cellenATCCHTB-38
L-glutamineInvitrogen25030-080
PBSCellgro21-040-CV
Penicilline-streptomycineInvitrogen10378-016
RPMI-1640Invitrogen31800-089
WeefselkweekflessenCorning431080175 cm2
TrypanblauwThermo ScientificSV30084.01
Trypsine, 0,05% (1X) met EDTA 4Na, vloeibaarInvitrogen25300-054
Dierstudies
18% proteïnedieet voor knaagdierenHarlan TekladTeklad Global 2018SAlfalfevrij dieet
InsulinespuitBD Biosciences32941028 gauge
IsofluraanBaxterAHN3637
Matrigel Matrix basaalmembraanBD Biosciences356234
NCR nu/nu-muizenCWRU School
faciliteit voor athymische dieren en xenografts van de faculteit Geneeskunde
Steriele spuitBD Biosciences30519618 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT CompoundAndwin Scientific4583

Referenties

  1. Description of Plant Viruses [Internet]. , Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: http://dpvweb.net/ (2012).
  2. Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
  3. Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
  4. Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
  5. Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. , (2011).
  6. Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
  7. Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
  8. Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
  9. Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
  10. Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
  11. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
  12. Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
  13. Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
  14. Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
  15. Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
  16. Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. , (2012).
  19. Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
  20. Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. , (2012).
  21. Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

PlantenvirussenCPMV-zuiveringfluorescentielabelingPEGyleringtumorhomingmuizenxenograftmodelfluorescentie-imagingconfocale microscopie大きte-uitsluitingschromatografie
Virale nanopartikels voor
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.