We zien dat een ontwikkelde biomedische inrichting met continue of gepulseerde zichtbare laser gebaseerde behandeling die wordt gecombineerd met antibiotica (gentamycine), resulteert in een statistisch significant synergistisch effect leidt tot een vermindering van de levensvatbaarheid van P. aeruginosa PAO1, met 8 log is in vergelijking met een behandeling met antibiotica alleen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het synergetische effect van zichtbaar licht en gentamycine op
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Onlangs waren er verschillende publicaties over het bacteriedodende effect van zichtbaar licht, de meeste van hen beweren dat blauwe deel van het spectrum (400 nm-500 nm) is verantwoordelijk voor het doden van verschillende ziekteverwekkers 1-5. De fototoxische effect van blauw licht werd voorgesteld om een resultaat van licht-geïnduceerde reactive oxygen species (ROS) vorming door endogene bacteriële fotosensitizers die meestal licht absorberen in het blauwe gebied 4,6,7 zijn. Er zijn ook meldingen van biociden effect van rode en nabij-infrarood 8 evenals groen licht 9.
In de huidige studie hebben we een methode die liet ons toe om het effect van een hoog vermogen groene (golflengte van 532 nm) continue (CW) en gepulste Q-switched (QS) licht op Pseudomonas aeruginosa karakteriseren ontwikkeld. Met deze werkwijze bestudeerden we ook het effect van groen licht gecombineerd met antibiotica (gentamycine) de bacterie levensvatbaarheid. P. aeruginosa is acEMEENSCHAPPELIJKE noscomial opportunistisch pathogeen, kan verschillende ziekten. De stam is vrij resistent tegen verschillende antibiotica en bevat vele voorspelde AcrB / Mex-achtige RND multidrug efflux systemen 10.
De gebruikte methode vrijlevende stationaire fase Gram-negatieve bacteriën (P. aeruginosa stam PAO1), gekweekt in Luria Broth (LB) medium blootgesteld aan Q-switched en / of CW lasers met en zonder de toevoeging van het antibioticum gentamycine. Cellevensvatbaarheid werd vastgesteld op verschillende tijdstippen. De verkregen resultaten toonden aan dat laserbehandeling alleen celleefbaarheid verminderen niet vergeleken met onbehandelde controle en gentamycine behandeling alleen resulteerde slechts in een 0,5 log reductie van de levensvatbare telling van P. aeruginosa. De gecombineerde laser en gentamycine behandeling resulteerde echter in een synergistisch effect en de levensvatbaarheid van P. aeruginosa werd verminderd met 8 log's.
De voorgestelde werkwijze kan verder worden uitgevoerd via de ontwikkeling van de katheter achtig apparaat in staat is het injecteren van een antibioticum oplossing in de geïnfecteerde orgaan, terwijl tegelijkertijd het verlichten van de ruimte met licht.
Protocol
1. Bacteriële Culture
- Gram-negatieve P. aeruginosa stam PAO1 werden gekweekt in Luria Broth (LB) bij 37 ° C gedurende 18 uur.
- De celkweek werd gecentrifugeerd bij 7.500 rpm (omwentelingen per minuut) gedurende 5 min en de supernatant werd verwijderd.
- De bacteriën werden geresuspendeerd in 10% LB en opnieuw gekweekt gedurende 2 uur om de cultuur stationaire fase opnieuw in te voeren.
- De bacteriesuspensie werd vervolgens verdeeld in twee groepen: de eerste groep (2 buizen) geen antibiotica werden toegevoegd, in de tweede groep we het antibioticum gentamycine (50 ug / ml) toegevoegd.
2. Bepaling van de kolonievormende eenheden (CFU)
- Levensvatbaarheid van de cellen te bepalen 20 gl monsters werden genomen uit het experiment ongeveer elke 2 uur binnen het tijdsbestek van 24 uur. Seriële verdunning van de monsters gemaakt en uitgeplaat op LB agar platen en overnacht geïncubeerd bij 37 ° C.
- Voor elke behandeling, de CFU's per platforme werd bepaald en een vergelijking werd gemaakt tussen de perioden en diverse behandelingen. De log reductie van CFU werd berekend zoals beschreven in Eq. (1):
Log reductie = Logu-LogC [CFU / ml]
Waarin U de kolonievormende eenheden waarde op elk tijdstip, CFU de kolonievormende eenheid terwijl de eenheden van CFU / ml gelijk aan:
CFU / ml = (aantal kolonies x verdunningsfactor) / (volume geënt)
En C is de CFU in het controlemonster op begintijd. Merk op dat U duidt de kolonie vormende factor bij directe meting. - De verdunningsfactor is het aantal verdunningen terwijl elk van hen de concentratie van de bacteriën werd verminderd met een factor 10. Het geënte volume was altijd 200 microliter en het is gerelateerd aan de grootte van onze reageerbuis.
Daarom de concentratie oogpunt vatten, het antibioticum gentamycine was in een concentratie van 50 ug / ml. Wat de bacteriën tot eindhet proces dat we hadden algehele 8 verdunningen. Elke verdunning werd door een factor van 10 en werd gedaan in buisjes van 200 ul. Uitgangspunt was 20 ui monsters toegevoegd aan de 200 ul buis (en dus de initiële concentratie 20/200C 0 = 0.1C0 met C 0 de initiële concentratie in het 20 ui monsters) en de eindconcentratie werd verminderd met 8 ordes van grootte als gevolg van de 8 verdunningen.
3. Verlichting
- CW Nd: YAG laser (golflengte van 532 nm en de gemiddelde optische vermogen van 200 mW) werd gesplitst in twee optische wegen met optische 50% / 50% bundelsplitser. De bundeldiameter ongeveer 10 mm. De blootstellingsduur was 24 uur.
- Q-switched gepulste Nd: YAG laser (golflengte van 532 nm, gemiddeld vermogen van 300 mW en optische piekvermogen van 2,5 MW) werd gesplitst in twee wegen met optische 50% / 50% bundelsplitser. De diameter plek was 6 mm. De pulsbreedte van de Q-switched laser was 6 nsec en de herhalingsfrequentie 15Hz was. Degemiddelde vermogensdichtheid was 106 mW / cm 2 en de piek vermogensdichtheid was 8,83 kW / mm 2. De blootstellingsduur was 24 uur.
Merk op dat de bacteriële suspensie geroerd gedurende de bestraling en werd onder geschikte kweekomstandigheden voor bacteriële groei (in alle buizen was Luria Broth medium om de bacteriën te groeien) gehouden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De laser gebaseerde opstelling is schematisch weergegeven in figuur 1. De eerste experimentele conditie gebruikt een CW Nd: YAG laser met golflengte van 532 nm (de tweede harmonische van de Nd: YAG) en de gemiddelde optische vermogen van 200 mW. Deze bundel werd opgesplitst in twee optische paden met behulp van optische 50% / 50% straaldeler zodanig dat elke split beam had vermogen van 100 mW. De bundeldiameter ongeveer 10 mm en daarmee de vermogensdichtheid ongeveer 100 mW / cm 2. De blootst...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Fototherapie is een gebied van geavanceerde multidisciplinair onderzoek in de afgelopen jaren in opkomst als een veelbelovende benadering voor de behandeling tal van ziekten. In dit verband is het gebruik van licht in het zichtbare gebied is uitgebreid bestudeerd. Zo is gebleken dat geïnfecteerde wonden beter kan worden genezen door bloot te stellen aan sterk licht voor sterilisatiedoeleinden. Het werkingsmechanisme van deze benadering werd bewezen door inductie van licht-geïnduceerde zuurstofradicalen (ROS) die de bact...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Lauria-bouillon | Difco | 241420 | |
| Gentamicine | Sigma | G1914 | |
| Bacto Agar | Difco | 231710 |
Referenties
- Feuerstein, O., Persman, N., Weiss, E. I. Phototoxic Effect of Visible Light on Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum: An In Vitro Study. Photochemistry and Photobiology. 80, 412-415 (2004).
- Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed. Laser Surg. 27, 221-226 (2009).
- Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm. Photomed. Laser Surg. 24, 684-688 (2006).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Friedman, H., Lubart, R. Sensitivity of Staphylococcus aureus strains to broadband visible light. Photochem. Photobiol. 85, 255-260 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Lubart, R. A possible Mechanism for visible light induced wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 40, 509-514 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Gedanken, A., Lubart, R. Visible light-induced killing of bacteria as a function of wavelength: Implication for wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 42, 467-472 (2010).
- Feuerstein, O., Ginsburg, I., Dayan, E., Veler, D., Weiss, E. Mechanism of Visible Light Phototoxicity on Porphyromonas gingiwalis and Fusobacferium nucleaturn. Photochemistry and Photobiology. 81, 1186-1189 (2005).
- Nussbaum, E. L., Lilge, L., Mazzulli, T. Effects of 630-, 660-, 810-, and 905-nm laser irradiation delivering radiant exposure of 1-50 J/cm2 on three species of bacteria in vitro. J. Clin. Laser Med. Surg. 20, 325-333 (2002).
- Dadras, S., Mohajerani, E., Eftekhar, F., Hosseini, M. Different Photoresponses of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa to 514, 532, and 633 nm Low Level Lasers In Vitro. Current Microbiology. 53, 282-286 (2006).
- Stover, C. K., Pham, X. Q., Erwin, A. L. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406, 952-964 (2000).
- Hamblin, M. R., Demidova, T. N. Mechanisms of low level light therapy. Proc. SPIE. 6140, 1-12 (2006).
- Krespi, Y. P., Stoodley, P., Hall-Stoodley, L. Laser disruption of biofilm. Laryngoscope. 118, 1168-1173 (2008).
- Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Zalevsky, Z. Direct laser light enhancement of susceptibility of bacteria to gentamycin antibiotic. Opt. Commun. 284, 5501-5507 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
