Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

Summary

De werkwijze beschreven isolatie en karakterisering van menselijke pulpa stamcellen (hDPSCs) door ofwel Enzymatische dissociatie van pulp (DPSC-ED) Of Directe uitgroei van stamcellen uit pulp weefselexplantaten (DPSC-OG). Gevolgd door In vitro Vergelijkende differentiatie van beide soorten hDPSCs in odontoblasts.

Introduction

Stamcellen zijn cellen die klonogene twee opmerkelijke eigenschappen, bekend als multi-potentie en zelfvernieuwing ¹⁵ bezitten. Van alle stamcellen met verschillende replicatieve vermogens, hebben tandheelkundige stamcellen als postnatale stamcellen gewezen laatste jaren vanwege hun toegankelijkheid, plasticiteit en hoge proliferatieve vermogen in vergelijking met andere volwassen stamcellen ^16. Kenmerkend vergelijkbaar met de mesenchymale stamcellen, dentale pulp stamcellen zijn hechtende klonogene cellen die meerdere differentiatiecapaciteit in mesenchym en / of niet-mesenchym lineages, zowel in vitro als in vivo. ^1-8,17,18 DPSC's worden geïdentificeerd door hun negatieve uitdrukking van hematopoietische antigenen (bijv. CD45, CD34, CD14), en positieve uitdrukking van CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 en STRO-1. ^19,20

Gemakkelijk verkregen potentieel met een minimum aan pijn en ziekte te maken menselijke DPSC's als een waardevollekunnen bron van MSCs in vergelijking met de gewone bronnen, zoals beenmerg mesenchymale stamcellen ^21. In het algemeen zijn DPSC's zijn geïsoleerd door een uitwas werkwijze, dwz migratie van stamcellen uit pulp weefselexplantaten (DPSC-OG) ^22-24, en / of door enzymatische digestie (DPSC-ED) ^4,6,25. Eerdere studies hebben aangetoond dat de isolatiemethode en kweekomstandigheden kunnen verschillende populaties of geslachten er onvoldoende in vitro passages ^26,27. In geval van blijvende tanden (pDPSCs), Huang et al. toonde aan dat enzymatische digestie pDPSCs hogere proliferatie potentie vergeleken met de ontgroeid DPSC's. ²⁶ Bovendien, in het geval van melktanden (dDPSCs), werd aangetoond dat STRO-1 en CD34 markers, uitgedrukt in dDPSC-ED in vergelijking met dDPSC-OG. Bovendien dDPSC-ED weergegeven hogere mineralisatie in bepaalde osteo / odonto medium. ²⁷ Derhalve dankzij de uitstekende mogelijkheden van DPSC's in regenerative geneeskunde, meer studies nodig voor een beter begrip van mogelijke verschillende populaties die zijn afgeleid van verschillende isolatiemethoden.

Hier was poging makkelijke manier pulp extractie voeren, met eentraps tandheelkundige diamantschijf de pulp extractie te vergemakkelijken. Bovendien, na isolatie van humane pulp-stamcellen door toepassing of ED OG werkwijzen werden algemene eigenschappen en differentiatiecapaciteit tussen twee groepen onderzocht.

Protocol

1. Bereid de enzymoplossing en proliferatie Medium (PM)

1. Merk Collagenase Type I oplossing: Weeg collagenase type I (12 mg / ml) en los op in 1 ml PBS en filter met een 0,2 urn spuitfilter. Plaats dan het 15 ml tube en bewaar deze bij -20 ° C totdat het nodig is.
2. Maak dispase Oplossing: Weeg dispase (16 mg / ml) en los op in 1 ml PBS en filter met behulp van een 0,2 micrometer spuitfilter. Plaats dan het 15 ml buis en houd het bij 4 ° C totdat het nodig is.
3. Merk enzymoplossing: Voeg 1 ml collagenase type I oplossingen (12 mg / ml) en 1 ml dispase oplossingen (16 mg / ml) in de 2 ml steriel PBS bevattende 100 mg / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine. Totale concentratie dispase en Collagenase I eindvolume moeten 4 mg / ml en 3 mg / ml, receptief zijn. Vervolgens aliquot dit volume in vier 15 ml buis, die elk 1 ml enzymoplossing. Elke buis kan worden gebruikt voor een pulp digestie.
4. Merk wasoplossing: Voeg 100 mg / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine in PBS.
5. Standaardcorrecties media: Alpha wijziging van Eagle's medium (α-MEM) aangevuld met 10% FBS en 100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine.
6. Maken de verspreiding Media (PM): Alpha wijziging van medium Eagle's (α-MEM) aangevuld met 10% FBS, 100 uM L-ascorbinezuur 2-fosfaat, 2 mM L-glutamine, 100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine, 0,25 mg / ml amfotericine B.
7. Merk odontogene media: Alpha wijziging van medium Eagle's (α-MEM) aangevuld met 10% FBS, 100 mM L-ascorbinezuur 2-fosfaat, 2 mM L-glutamine, 100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine, 0,01 uM dexamethason, 5 mM β-glycerolfosfaat, 1,8 mM Monokaliumfosfaat.

2. Bereid Human Dental Pulp weefsel voor Dental Pulp Stem Cell Isolation

1. Normale menselijke derde molaren werden verzameld van volwassenen (21 tot 29 jaar) op de Dental Clinic van de Imam Ali onder goedgekeurde Institutional Review Board (IRB).
2. Tanden werden in het medium (α-MEM aangevuld met 10% FBS) en overgebracht naar het laboratorium bij 4 ° C.
3. Onder de steriele toestand, het werken binnen een biohazard laminaire stroming kap, set-up werd gedaan een 100 mm petrischaaltjes voor elke tand te verwerken. Tandoppervlakken werden gereinigd met 70% ethanol.
4. Tijdens het werken in een van de Petri-schalen, werd tand gehouden door tandheelkundige tang en een scalpel gebruikt om schoon te vuil en periodontale ligament op de wortels.
5. Cemento-emaille kruising werd langzaam gesneden met behulp van gesteriliseerde tandheelkundige disc naar de pulpakamer te onthullen. Bedacht moet worden dat snijproces moet langzaam worden uitgevoerd om verminderen oververhitting van het tandweefsel.
6. Pulp weefsel werd zachtjes gescheiden van de kroon en wortel.
7. Pulpa werd in kleine stukjes gesneden met behulp van een scalpel.

3. Human Dental Pulp Isolatie

1. Pulp weefsel ondergingen ofwel enzymatische dissociatie van pulpa of directe cel uitgroei van pulp weefselexplantaten voor isolatie van hDPSCs.
2. Enzymatische dissociatie van pulpa:
   1. Stukjes pulp weefsels werden overgebracht naar enzymoplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C. Vortex elke 30 minuten om te helpen breken weefsel.
   2. Daarna werden grote celaggregaten verwijderd en Single-cell suspensies werden verkregen door het passeren van cellen door middel van een 70-uM cel zeef.
   3. Eencellige suspensies werden gecentrifugeerd bij 1200 rpm gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
   4. Supernatanten werden voorzichtig afgepipetteerd en pellet werd geresuspendeerd in 1 ml proliferatie medium (PM). (Opmerking: FBS in proliferatie medium beëindigen enzymatische displayAssociation.)
   5. Eencellige suspensies van dentale pulp werd uitgezaaid in ²⁵ cm2 cultuur kolf met PM en vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C in _5% CO2.
   6. Het kweekmedium werd elke drie dagen totdat de cel confluentie werd bereikt.
3. Directe cel uitgroei van pulp weefselexplantaten:
   1. Pulpa werd gehakt in 1-2-fragmenten mm, en elk stuk werd in 25 ^cm2 cultuur flessen met PM en vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C in _5% CO2. Bedacht moet worden dat de totale volume van de PM voor uitgroei van cel moet de bevestiging van pulp stukken voor verdere uitgroei cellen (2-3 ml per kolf) te ondersteunen.
   2. Het medium werd gewijzigd nadat uitgroei werd waargenomen.
   3. De ontgroeid cellen bij confluentie werden sub-gecultiveerd in een verhouding van 1:4 (passage 1).

4. Immunofenotypering

1. 250.000 cellen /tube van beide typen cellen in passage 3 werden geïncubeerd met PE of FITC-geconjugeerd anti-humane antilichamen met isotypen gedurende 30 min bij 4 ° C in een donkere plaats. (Opmerking:. De concentratie van antilichamen werd toegepast volgens de vervaardiging protocol)
2. Na de incubatie periode werd 100 pi PBS of FACS verdunningsoplossing toegevoegd aan elke buis en gecentrifugeerd bij 1200 rpm gedurende 5 min in een donkere plaats.
3. Supernatanten werden verwijderd en pellets werden geresuspendeerd in 100 ul PBS of FACS verdunning in donkere plaats.
4. Gerichte oppervlakte markers (CD markers) werden geëvalueerd door BD FACSCalibur.

5. Inductie van differentiatie van DPSC's in Gemineraliseerde Cells & Gekwantificeerde Alizarinerood S Assay

1. DPSC's die werden verkregen door enzymatische dissociatie van pulpa (bekend als DPSC-ED) of directe cel uitgroei van pulp weefselexplantaten (DPSC-OG) waren sub-gekweekte voor 3 gangen.
2. Eent Passage 3, werden de cellen zaad in een plaat met 6 putjes bij 5.000 cellen / putje.
3. Bij confluentie van 60% werden odontogene medium vervangen door conventionele PM. Drie putjes werden bleef als een negatieve controle door toevoeging van groeimedium.
4. Medium wissel alle 3 dagen tot dag 21.
5. Op dag 21 werden de cellen gewassen met PBS en werden vastgesteld bij 1 ml / putje 10% paraformaldehyde gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
6. Daarna werd paraformaldehyde afgepipetteerd zorgvuldig en cellen werden 3 keer gewassen (5-10 min per keer) met gedestilleerd H ₂ O. (Opmerking: Vermijd het verstoren van de monolaag.)
7. Na wassen werden 1 ml / putje Alizarinerood S toegevoegd gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
8. Cellen werden gewassen met gedeïoniseerd H ₂ O viermaal (5 min per keer met zacht schudden) om extra Alizarinerood verwijderen.
9. 1 ml / putje H ₂ O werden toegevoegd aan de cellen niet uitdroogt.
10. De platen werden verondersteld visuele inspection en / of beeldopname.
11. Voor de kwantificering Alizarinerood S assay werden H ₂ O vervangen door 1 ml 10% azijnzuur aan elk putje van 6-well plaat en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder schudden.
12. Vervolgens celmonolaag / putje waren schraap & zowel azijnzuur en cellen overgebracht naar de afzonderlijke 1,5 ml micro-centrifugebuisjes. (Let op:. Elk putje moet de overdracht worden in een afzonderlijke buis dwz drie test putten en drie controleputjes voor elk ED & OG groepen)
13. Buizen werden krachtig gevortext gedurende 30 sec.
14. Verwarm tot 85 ° C gedurende 10 minuten. (Opmerking: om verdamping te voorkomen, werden buizen afgesloten met parafilm.)
15. Na verwarmen, werden buizen overgebracht naar ijs gedurende 5 minuten. (Opmerking: Tubes mag pas worden geopend geworden afgekoeld.)
16. De suspensies werden gecentrifugeerd bij 20.000 x g gedurende 15 minuten. Tijdens centrifugeren werden Alizarinerood normen genomenup.

Alizarinerood S standaard werden bereid door eerst verdunnen van de verdunningsbuffer en gebruikt om 2-voudige seriële verdunningen gebaseerd op de tabel.

High Range concentratie van de kleurstof

Laag bereik concentratie van de kleurstof

2 mM

1 mM

500 uM

250 uM

125 uM

62,5 uM

31,3 uM

15,6 uM

7,8 uM

3,9 uM

1,9 uM

0,9 uM

0,4 uM

Blanco

16. Na het centrifugeren werden 1 ml supernatant / buis overgebracht naar nieuwe afzonderlijke 1,5 ml micro-centrifugebuisjes.
17. De pH werd geneutraliseerd met 375 pi 10 ~% Ammoniumhydroxide per buis. (Opmerking: pH woede moet 4,1-4.5.)
18. 150 ul standaard en monsters (inclusief afzonderlijke tests en controles) werden toegevoegd aan een ondoorzichtige wanden, transparante bodem 96-well plaat.
19. De absorptie werd afgelezen bij 405 nm en OD waarden werden vergeleken met standaard plot voor verdere analyse.

Results

1. DPSC's die zijn verkregen door enzymatische dissociatie (DPSC-ED) hier op dag 10, 15,18 (Figuur 1). Kolonies opgestart om op bijna 3 tot 5 dagen na de isolatie vormen.
2. Ontgroeid DPSC's (DPSC-OG) zijn weergegeven in Figuur 2 op dag 5, 10, 13 en 18. Fibroblastachtige cellen begon te migreren van pulp weefsel in de kolf parallel bestellen met bijna 5 dagen na uitzaaien.
3. DPSC's bij passage 3 met beide methoden zijn weergegeven in figuur 3. Beide DPSC's b...

Discussion

Dit protocol beschrijft het proces van isolatie en karakterisering van hDPSCs van tandheelkundige pulp met behulp van twee methoden, enzymatische dissociatie en directe uitgroei van stamcellen uit pulp weefselexplantaten. Bovendien in vitro differentiatie van deze cellen naar odontoblasts, werd bepaald door kwantitatieve assay Alizarinerood S & QPCR.

Bestaande protocollen voor het isoleren van pulp weefsel van menselijke tand werd gebruik gemaakt van verschillende instrumenten z...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus of Lot. aantal	Opmerkingen (optioneel)
α-MEM	GIBCO	11900-073
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C0130-100MG
Dispase	GIBCO	17105-041
Penicilline / streptomycine	GIBCO	15140-122
Amfotericine B	GIBCO	15290-018
Foetaal runderserum gedefinieerde (FBS)	HyClone	SH30070.03
L-ascorbinezuur 2-fosfaat	Sigma	A8960-5G
L-glutamine	GIBCO	25030-024
Dexamethason	Sigma	D4902
β-Glycerol fosfaat dinatriumzout hydrateren, BioUltra	Sigma	G9422-100G
Kaliumfosfaat monobasisch	Sigma-Aldrich	P5655
Osteogenesis Assay Kit	Millipore	PS01802031
Muis IgG2b-PE isotype control	BD Pharmingen	50808088029
FITC muis IgG2b isotype control	BD Pharmingen	559532
FITC muis IgG1 κ isotype	BD Pharmingen	11471471
FITC / PE muis anti-humaan CD34/CD45	BD Pharmingen	341071
PE anti-humaan CD146	BD Pharmingen	550315
Monoklonale muis anti-humaan CD90/FITC	Daka	00034418
PE muis anti-humaan CD73	BD Pharmingen	550257
Anti-h CD105/Endoglin PE	BD Pharmingen	FAB10971P
PE muis anti-humaan CD11b/Mac1	BD Pharmingen	5553888
CD44 PE muis anti menselijke	BD Pharmingen	555479
Fosfaatbufferoplossing (PBS)	GIBCO	003000
70-um celzeef	Valk	352360
0,2 urn spuitfilter	Millex-GV	SLGV033RB
25 cm 2 cultuur fles	Sigma-Aldrich	Z707481
			APPARATUUR
BD FACSCalibur	BD	342975
Multiskan microplaat spectrofotometer	Thermo Scientific	51119200
Fleurcense Microscoop	Olympus
Vloeiende Software versie 2.3.1