De werkwijze beschreven isolatie en karakterisering van menselijke pulpa stamcellen (hDPSCs) door ofwel Enzymatische dissociatie van pulp (DPSC-ED) Of Directe uitgroei van stamcellen uit pulp weefselexplantaten (DPSC-OG). Gevolgd door In vitro Vergelijkende differentiatie van beide soorten hDPSCs in odontoblasts.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden
In dit artikel
Samenvatting
Inleiding
Stamcellen zijn cellen die klonogene twee opmerkelijke eigenschappen, bekend als multi-potentie en zelfvernieuwing 15 bezitten. Van alle stamcellen met verschillende replicatieve vermogens, hebben tandheelkundige stamcellen als postnatale stamcellen gewezen laatste jaren vanwege hun toegankelijkheid, plasticiteit en hoge proliferatieve vermogen in vergelijking met andere volwassen stamcellen 16. Kenmerkend vergelijkbaar met de mesenchymale stamcellen, dentale pulp stamcellen zijn hechtende klonogene cellen die meerdere differentiatiecapaciteit in mesenchym en / of niet-mesenchym lineages, zowel in vitro als in vivo. 1-8,17,18....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereid de enzymoplossing en proliferatie Medium (PM)
- Merk Collagenase Type I oplossing: Weeg collagenase type I (12 mg / ml) en los op in 1 ml PBS en filter met een 0,2 urn spuitfilter. Plaats dan het 15 ml tube en bewaar deze bij -20 ° C totdat het nodig is.
- Maak dispase Oplossing: Weeg dispase (16 mg / ml) en los op in 1 ml PBS en filter met behulp van een 0,2 micrometer spuitfilter. Plaats dan het 15 ml buis en houd het bij 4 ° C totdat het nodig is.
- Merk enzymoplossing: Voeg 1 ml collagenase type I oplossingen (12 mg / ml) en 1 ml dispase oplossingen (16 mg / ml) in de 2 ml steri....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
- DPSC's die zijn verkregen door enzymatische dissociatie (DPSC-ED) hier op dag 10, 15,18 (Figuur 1). Kolonies opgestart om op bijna 3 tot 5 dagen na de isolatie vormen.
- Ontgroeid DPSC's (DPSC-OG) zijn weergegeven in Figuur 2 op dag 5, 10, 13 en 18. Fibroblastachtige cellen begon te migreren van pulp weefsel in de kolf parallel bestellen met bijna 5 dagen na uitzaaien.
- DPSC's bij passage 3 met beide methoden zijn weergegeven in figuur 3. Beide DPSC's b.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft het proces van isolatie en karakterisering van hDPSCs van tandheelkundige pulp met behulp van twee methoden, enzymatische dissociatie en directe uitgroei van stamcellen uit pulp weefselexplantaten. Bovendien in vitro differentiatie van deze cellen naar odontoblasts, werd bepaald door kwantitatieve assay Alizarinerood S & QPCR.
Bestaande protocollen voor het isoleren van pulp weefsel van menselijke tand werd gebruik gemaakt van verschillende instrumenten z.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij dankbaar erkennen Dr Leila Shakeri & Dr Aref Dournaei voor hun kritische discus en de heer Mohammad Reza Khadem Sharif voor zijn technische ondersteuning.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogus of Lot. aantal | Opmerkingen (optioneel) |
| α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
| Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
| Penicilline / streptomycine | GIBCO | 15140-122 | |
| Amfotericine B | GIBCO | 15290-018 | |
| Foetaal runderserum gedefinieerde (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
| L-ascorbinezuur 2-fosfaat | Sigma | A8960-5G | |
| L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
| Dexamethason | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol fosfaat dinatriumzout hydrateren, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
| Kaliumfosfaat monobasisch | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
| Muis IgG2b-PE isotype control | BD Pharmingen | 50808088029 | |
| FITC muis IgG2b isotype control | BD Pharmingen | 559532 | |
| FITC muis IgG1 κ isotype | BD Pharmingen | 11471471 | |
| FITC / PE muis anti-humaan CD34/CD45 | BD Pharmingen | 341071 | |
| PE anti-humaan CD146 | BD Pharmingen | 550315 | |
| Monoklonale muis anti-humaan CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
| PE muis anti-humaan CD73 | BD Pharmingen | 550257 | |
| Anti-h CD105/Endoglin PE | BD Pharmingen | FAB10971P | |
| PE muis anti-humaan CD11b/Mac1 | BD Pharmingen | 5553888 | |
| CD44 PE muis anti menselijke | BD Pharmingen | 555479 | |
| Fosfaatbufferoplossing (PBS) | GIBCO | 003000 | |
| 70-um celzeef | Valk | 352360 | |
| 0,2 urn spuitfilter | Millex-GV | SLGV033RB | |
| 25 cm 2 cultuur fles | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| APPARATUUR | |||
| BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
| Multiskan microplaat spectrofotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Fleurcense Microscoop | Olympus | ||
| Vloeiende Software versie 2.3.1 |
Referenties
- Volponi, A. A., Pang, Y., Sharpe, P. T. Stem cell-based biological tooth repair and regeneration. Trends Cell Biol. 20, 715-722 (2010).
- Nosrat, I. V., Widenfalk, J., Olson, L., Nosrat, C. A. Dental pulp cells produce n....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
