Massa Cytometry: Protocol voor dagelijks Tuning en Running Cell Samples op een CyTOF Mass Cytometer

Samenvatting

De stappen die dagelijks tuning en optimalisatie van de prestaties van een CyTOF massa cytometer beschreven. Reacties op optimale monstervoorbereiding en debiet worden besproken

Samenvatting

De laatste jaren heeft een snelle analyse van afzonderlijke cellen die zijn uitgevoerd met behulp van flowcytometrie en fluorescent-gemerkte antilichamen. Echter, het probleem van de spectrale overlap van fluorofoor-uitstoot beperkt het aantal gelijktijdige sondes. In tegenstelling tot de nieuwe CyTOF massa cytometer door DVS Sciences paren een vloeistof eencellige invoersysteem een ICP-MS. ^Een plaats fluoroforen zijn chelaatvormende polymeren die hoogverrijkt metaalisotopen gekoppeld aan antilichamen of andere specifieke probes. ^2-5 Door de metalen zuiverheid en massa resolutie van de massa cytometer, er is geen "spectrale overlap" van naburige isotopen, en daarom geen noodzaak voor compensatie matrices. Bovendien, door het gebruik van lanthanide metalen er geen biologische achtergrond en dus geen equivalent van autofluorescentie. Met een massa venster verspreid over atoommassa 103 tot 203, in theorie tot 100 etiketten kunnen tegelijkertijd worden onderscheiden. Tegenwoordig, Meer dan 35 kanalen beschikbaar via de chelerende reagentia die beschikbaar zijn vanaf DVS Sciences, die een ongekend dissectie van de immunologische profiel van monsters. ^Zes-zeven

Nadelen massa cytometrie onder de strenge eis van een afzonderlijke metalen isotoop per probe (geen equivalent van voorwaartse of zijwaartse verstrooiing), en het feit dat het een destructieve techniek (geen mogelijkheid sorteren recovery). De huidige configuratie van de massa cytometer heeft ook een cel overdrachtssnelheid van slechts ~ 25%, waardoor het noodzakelijk wordt een hogere input aantal cellen.

Optimale dagelijkse prestaties van de massa cytometer vereist een aantal stappen. Het hoofddoel van de optimalisatie is aan de gemeten signaalsterkte van het gewenste metaal isotopen (M) te maximaliseren, terwijl het minimaliseren van de vorming van oxyden (M +16) die de M signaalintensiteit verlagen en interfereren met elke gewenste signaal M +16. De eerste stap is om op te warmen de machine, zodat een warme, stabiele ICP plasma is vastgesteld. Ten tweede moet de voor huidige en make-up gasstroom worden geoptimaliseerd op een dagelijkse basis. Tijdens het verzamelen, wordt het maximale cell incidentie beperkt door detector efficiency en verwerkingssnelheid tot 1000 cellen / seconde. Afhankelijk van het monster kwaliteit, een lagere cel incidentie (300-500 cellen / seconde) is gewoonlijk wenselijk om een ​​betere resolutie tussen cellen gebeurtenissen en dus intact singlets maximaliseren over wambuizen en vuil. Tenslotte adequate reiniging van de machine aan het eind van de dag minimaliseert achtergrondsignaal door vrij metaal.

Protocol

Alle celmonsters de CyTOF moet worden vastgesteld en gepermeabiliseerd. Dit maakt een grotere invoer van het iridium-bevattende DNA intercalator, en voorkomt ook cellyse tijdens de MilliQ water wassen en resuspensie stappen vlak voor het injecteren in de massa cytometer.

1. Start-up van de Mis Cytometer

1. Open het CyTOF softwareprogramma. Selecteer Instrument-setup. Op de kaart Cage tabblad, ga naar de rechter benedenhoek en klik Heater "ON" knop te drukken. Zet de verwarming minstens 15 min. voor gewenste tijd voldoende tijd voor de sproeikamer laat mantel 200 ° C. bereikt
2. Vervang de witte Norm-Ject 3 ml spuit in de spuit pomp met een frisse injectiespuit gevuld met MilliQ water.
3. Reinigen verstuiver. Backflush de vernevelaar met behulp van de spuit en slang aan 5% citranox 2-3 keer trekken door zowel de kleinere vloeibare introductie haven en de grotere inbrengen van gas-poort. Herhaal terugspoelen met MilliQ water to verwijderen resterende citranox.
4. Controleer bevestigen dat de lampjes op het voorpaneel van de CyTOF branden als in figuur 1.

Figuur 1. CyTOF lampjes vóór de inbedrijfstelling.

5. Open argon gas tank klep. Dit moet ertoe leiden dat de "argon" lampje op de voorkant in te schakelen.
6. Bevestig de vernevelaar om make-up gasinlaat. Schroef de make-up gas slang connector en verwijder de zwarte rubberen o-ring en de witte conische plastic stuk. Let op het bredere "knokkel" op het gas inlaatpoort steel van de vernevelaar. Plaats de connector op het gas introductie poort. Plaats de zwarte o-ring over het uiteinde van de gaspoort en dwingen de o-ring langs het brede deel van de haven stam. Plaats de witte conische plastic stuk op de top met de smalle kant op gewezen, en schroef op de make-up gas buizen.
7. Bevestig de vernevelaar om de vloeistof introductie slang. Steek de kleine buis in de opening aan het einde van de vernevelaar. Er zullen twee haltes, gelijk in het gevoel van de stops op een micropipettor. Druk eerst op tot je aan lichte weerstand, het einde van de kleine buis moet aan het eind van het rechte gedeelte van glas. Ten tweede, druk harder aan het einde van het rechte gedeelte van het glas te dwingen verder in de fitting en draai de wartel te verzegelen. Steek het uiteinde van de vernevelaar in de witte opening in de verwarmingsmantel.
8. Op het RFG Controller tab van het Instrument-setup venster, drukt u op "Start Plasma". Omdat de vernevelaar al is geplaatst, drukt u op "OK". De software zal draaien op de koelmachine, start de gasstroom, en ontsteken een plasma. De detector spanning zal opvoeren. Er zal een pop-up venster te zeggen "Plasma opstartprocedure met succes is voltooid" als u klaar zijn, druk op "OK". Nieuwe lampen moeten op in het voorpaneel (figuur 2 >).

Figuur 2. CyTOF lampjes na plasma ontstoken en start-up met succes afgerond.

9. Het inschakelen van injectiepomp. In de rechter bovenhoek, druk op de groene "play"-knop om de spuit pomp te starten en stromende vloeistof door de slang en spuiten van de vernevelaar te beginnen. De standaard spuit instellingen zijn voor 3 ml water. Om monster dat stroomt door de sample loop, moet de injectiespuit pomp regelmatig worden vervangen wanneer het water opraakt. Bovenaan het scherm, er een teller aangeeft hoeveel vloeistof stroomde uit de spuitpomp. De spuitpomp stopt wanneer de teller "3,000" of de zuiger bereikt raakt het uiteinde van de spuit. Wanneer opnieuw vullen van de spuit, moet je raken "stop" in plaats van de blauwe "pauze" knop om de teller te resetten.

e "> 2. Dagelijkse kalibratie van de Mis Cytometer

1. De massa cytometer heeft ongeveer 20 minuten een warme, stabiele plasma bereiken voor kalibratie. Het doel van de tuning stappen is om het gewenste signaal van Tm169 of Tb159 maximaliseren terwijl "Gd155" (oxide; La139 + O16) signaal onder de 3% van de hogere waarde. Klik op de Overname knop Instellingen om de data-acquisitie venster Instellingen te openen. In de analyten tabblad, klik op de periodieke tabel van de isotoop jury te openen. Selecteer de isotopen in de DVS Sciences tuning oplossing vermeld in de handleiding en klik vervolgens op "opslaan".
2. Klik op de Isotopen Per Lezen toets om de Massa ('s) te openen Per Reading venster. Selecteer "Peulvruchten Count", en herschalen de y-as door het invoeren van een nieuw nummer en druk op "enter".
3. Vul een groen 1 ml Norm-Ject spuit met tuning oplossing. Draai het monster poort keuzeschakelaar op "LOAD", 450 ul van tuning oplossing te injecteren, zet de schakelaar op 'injecteren'. In de Mis Kalibratie tabblad van het Data Acquisit ion venster Instellingen, druk op "Run" om te controleren welke massa's stromen door. De linkerkant van het venster is lager massa, terwijl de rechterkant is een hogere massa. Opmerking: er al signalen in de TOF 9400-9800 regio door xenon isotopen in het argongas (figuur 3). Wacht tot tuning oplossing isotopen start verschijnen als strepen in deze display (Figuur 4).

Figuur 3. Mass kalibratie tabblad venster, met achtergrondniveaus voor verschillende isotopen na het wassen oplossing en water afspoelen. De regio rond TOF 9400-9800 komt overeen met xenon isotopen in de argon gas, en moet altijd aanwezig zijn. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

4 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg "/>
Figuur 4. Mass kalibratie tab-venster, met verticale strepen van verschillende isotopen in DVS tuning oplossing. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

4. Ga terug naar de Massa ('s) per Lezen venster en druk op de groene "Play" knop in de linker bovenhoek. Elke isotoop geselecteerd in stap 2.1 wordt vertegenwoordigd door een verschillend gekleurde lijn. De standaard x-as is "Time" in sec. Bewaken van de niveaus van de verschillende isotopen tot ze stabiel.
5. Afstemmen van de stroom. Op het tabblad Parameter van de Data Acquisition venster Instellingen, selecteer "Current" in het drop-down menu. Laten start = 0, afwerking = 10, stap value = 0,5, de afwikkeling van de tijd = 200, en druk op "opslaan". Klik weer op de Massa ('s) per Reading venster en druk op spelen. De x-as is nu "Current". Opmerking waar de signalen van de isotopen piek (figuur 5), en r ECORD. Onder de DAC-kanalen tab Setup van het Instrument-setup venster, scroll naar beneden naar "Huidige" en voer deze nieuwe waarde. Druk op de "werkelijke huidige waarde Set" en vervolgens op "opslaan".

Figuur 5. Huidige tuning profiel.

6. Afstemmen van de make-up gas. Wijzig drop-down menu op "Make-up gas." Laten start = 0,55, einde = 0,95, stap value = 0,05, de afwikkeling van tijd = 200. Druk op op te slaan. Terug naar de Massa ('s) per Reading venster en druk op spelen. De x-as is nu "Make-up gas" debiet. Noteer waar de signalen van de isotopen piek. Let op de snelle toename van de "Gd155" signaal aan het einde (figuur 6). Keer terug naar de DAC-kanalen tabblad, scroll naar beneden naar "Make-up gas", en voer deze nieuwe waarde. Druk op de "werkelijke huidige waarde Set" en vervolgens op "opslaan".

igure 6 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg "/>
Figuur 6. Make-up gas tuning profiel.

7. Opnemen verhouding gewenste isotoop vs oxide. Maak een tweede 450 ul injectie van tuning oplossing. Op het tabblad Parameter, "tijd" te selecteren uit het drop-down menu, laat start = 0, einde = 10, stap value = 1, de afwikkeling van tijd = 200. Druk op "redden." Hit "play" in Massa ('s) per Lezen venster. Nadat de lijnen zijn gestabiliseerd (Figuur 7), gebruikt u de cursor naar de waarde te lezen in de linkerbovenhoek dozen voor Tm169 of Tb159 (hogere waarde) en ook de "Gd155" waarde (<3% van de hoogste waarde). Deze waarden kunnen ook worden opgeslagen in een tuning-bestand voor toekomstige referentie.

Figuur 7. Meting van tuning oplossing signaalintensiteiten na het optimaliseren van huidige en Make-up gas.

8. Reiniging van samPLE lus. Injecteer 3 ml MilliQ water door de sample loop, gevolgd door 500 pi wasoplossing DVS. Bewaken van de voortgang van de reiniging door het indrukken van "run" in de Mis Calibration tabblad. Wassen tot de intensiteit van de strepen (Afbeelding 4) begint dan af door 3 ml MilliQ water en monitor volgt tot tot achtergrondniveaus (figuur 3).

3. Running Monsters

1. Open het Acquisitie venster. Standaardinstellingen: Doe Analyse = On-The-Fly, Signaal = Dual, Dual Count Calibration = gegevens te analyseren. Ruisonderdrukking is geselecteerd. Elk van deze kan indien gewenst gewijzigd worden. Voer de bestandsnaam in. Alle bestanden moeten worden opgeslagen op de E :/ / drive.
2. Instellen van overname vertragingen. Er zal een kleine vertraging in registratie cel gebeurtenissen van ongeveer 30 sec door de lengte van de buis tussen de sample loop en de vernevelaar zijn. Daarom is de som van "Verwerving vertraging" en "Detector stvermogen vertraging "moet ten minste 30 sec. Detector stabiliteit vertraging moet ten minste 20 sec.
3. Het instellen van het verzamelen van gegevens tijd. "Acquisitie tijd" is het aantal seconden dat u wilt uw monster uit te voeren. Het vullen van de hele 450 ul sample loop zou 600 sec in beslag. Voorgesteld wordt 50-100 sec worden toegevoegd aan het einde van de run tijd sample minimaliseren overdracht.
4. Resuspensie van het monster. Om opbouw minimaliseren van zouten in de machine wordt gesuggereerd dat minstens twee wasbeurten in MilliQ water worden gedaan bij het einde van de cel kleuring, gevolgd door een laatste resuspensie in MilliQ water. De hoeveelheid MilliQ water gebruikt om het cel pellet is afhankelijk van het aantal cellen te beginnen met de celopbrengst na de gehele kleuringsprocedure mengen. Een goed startpunt is 10 ⁶ (startende) cellen / ml. Na resuspensie, filtreer door een cel zeef om aggregaten te verwijderen.
5. Vanaf steekproef uit te voeren. Geef een nieuwe bestandsnaam voor de huidige steekproef. Zet de sample loop ventiel op "LOAD", het monster te injecteren, terug te schakelen naar 'injecteren', druk dan op "Openen" in het Acquisition venster.
6. Het registreren van cel evenementen. Cellen zullen worden vertegenwoordigd in de snapshot-venster als horizontale collecties van merken in elke verticale isotoop / marker kanaal (figuur 8). Terwijl de massa cytometer kunnen zich aanmelden 1.000 cellen / sec, wordt een betere resolutie tussen cel gebeurtenissen gewoonlijk verkregen bij 300-500 cellen / sec. Dit komt overeen met een gemiddelde van ~ 1 cel / scherm refresh. Het kan tot 30 seconden voordat de cel event-teller begint te klimmen. Dit komt door "On-the-fly" gegevensverwerking; geen cel event informatie verloren.

Figuur 8. Acquisition venster monsters tijdens lopen, met horizontale rijen punten overeenkomen met de elementen gekoppeld aan drie afzonderlijke cel events.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

7. Kwaliteit van cel gebeurtenissen. Constateert achtergrond strepen in elk isotoop kanaal en de cel incidentie. De massa cytometer herkent een "cel event" als een zekere verhoging van signaal boven de achtergrond, dus achtergrondsignaal van gratis metaal of ongebonden antilichaam kan de "cel gebeurtenis" telling veranderen. Bovendien kan draaien cellen te hoge concentratie tot een verhoogd aantal events doublet. Achtergrond kan worden verminderd door extra spoelingen of meer celverdunning. Doubletten kan worden geminimaliseerd door grotere cel verdunning, ten koste van een verhoogde uitvoering.
8. Afwerking sample data-acquisitie. Wanneer de Verwerving is bereikt, wordt de gegevensverzameling voltooien. Er zal een beetje vertraging voordat een pop-up venster met zijn een "OK" knop verschijnt, nogmaals, dit is te wijten aan 'On-the-Fly "verwerking van gegevens. Afnemen van het monster kan ook worden gestopt Prematurely door op de "Stop" knop. In dit geval zal de cel reeds geregistreerde gebeurtenissen worden geteld en verwerkt tot uitvoerbestanden.
9. Injectie van ten minste 500 pi MilliQ water elk monster helpt minimaliseren monster overdracht.

4. Het apparaat reinigen na gebruik

1. Wasoplossing. Na de laatste steekproef wordt uitgevoerd en de sample loop gespoeld met water, 450 ul van wasoplossing te injecteren in de sample loop. Toezicht houden op de afgifte van vrije metaal in de Mis Kalibratie tab van het data-acquisitie venster Instellingen als in stap 2.8 (Figuur 9). Wanneer het vrije metaal signaal begint af te spoelen met 3 ml MilliQ water en controleren totdat achtergrondniveaus worden bereikt.

Figuur 9. Mass kalibratie tabblad venster, tijdens de post-run reinigen met DVS Wash-oplossing. De verticale strepen in TOF regio 9800 tot 11.000 zijn antilichaam-label isotopen worden gereinigd uit de machine. De verticale strepen rond TOF 11500 overeen met de twee Ir intercalator isotopen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

5. Uitschakelen van de machine

1. In de RFG Controller tab van het Instrument-setup-venster, selecteer "Stop Plasma". Wanneer de procedure is voltooid, zal er een pop-up venster waarin u wordt gevraagd om de vernevelaar te verwijderen. Druk op "OK". In de Card Cage tabblad, zet de verwarming. Sluit de klep op de argon aanbod.
2. Verwijdering van vernevelaar. Verwijder de verstuiver uit de sproeikamer door voorzichtig naar achteren te trekken. Schroef het monster introductie slang van stap 1,6 en leg opzij. Schroef de make-up het inbrengen van gas aansluiting op iets los en trek de vernevelaar uit. Het verlaten van de fitting in elkaar geschroefd zal verminderen de kans op lOsing de zwarte rubberen o-ring en witte conische plastic stuk.
3. Reinigen verstuiver. Backflush beide poorten van de vernevelaar met 5% citranox met behulp van de spuit en de slang als in stap 1.3. Store, bedekt, in 5% citranox tot het volgende gebruik.

Resultaten

Naar aanleiding van het bovenstaande protocol moet volbrengen vier dingen. Ten eerste zal dat op adequate wijze opwarmtijd voor de massa cytometer produceren een warme, stabiele plasma noodzakelijk voor een optimale signaal-en minimale oxidevorming. Anderzijds voldoende was de massa cytometer met MilliQ water en DVS wasoplossing (figuur 9) zal helpen de niveaus van metaal adsorptie aan de buis en andere delen van de machine, waardoor achtergrond te verlagen monsters tijdens acquisitie (figuur 8)...

Discussie

De laatste decennia is fluorescentie flow cytometrie is een werkpaard methode voor het analyseren enkelvoudige cellen, zowel oppervlakte-expressie en functionele bepalingen. Echter de problemen van spectrale overlap van de fluorescente kleurstoffen beperkt het aantal gelijktijdige markers. Terwijl experimenten met meer dan 12 gelijktijdige markers zijn gemeld, het bedrag van de schadevergoeding die nodig maakt dit technisch moeilijk.

In plaats van fluoroforen, massa cytometrie ontwikkeld doo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
CyTOF TM massa cytometer	DVS Sciences
Wasoplossing	DVS Sciences	201071	0,05% fluorwaterstofzuur in water
Afstemmen oplossing	DVS Sciences	201072	0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, spoor salpeterzuur
Eu bevattende polystyreenparels	DVS Sciences	201073	Bevat natuurlijke overvloed Eu isotopen; kralen geleverd op circa 1 miljoen / ml
Multi-lanthanide-bevattende (La / Pr / Tb / TM / Lu) - polystyreen kralen	DVS Sciences	Nog niet in de handel verkrijgbare	Bevat natuurlijke overvloed isotopen van beursgenoteerde lanthaniden
Salpeterzuur (geconcentreerd)	Fisher Scientific	A467-500	Optima spoor-metaal pure ICP-MS graad
Polystyreen ronde bodem buis met cel-zeef cap-5mL	BD	352235	gebruikt celmonsters filter voor injectie
Norm-Ject tuberkulin spuit-1mL	Henke Sass Wolf	4010-200V0	siliconen-vrij, latexvrij
Norm-Ject spuit-3 mL	Henke Sass Wolf	4010.000V0	siliconen-vrij, latexvrij
MilliQ water			18 MQ zuiver water, mogen niet worden opgeslagen in glazen of plastic flessen die zijn gewassen met commercieel detergens (vanwege hun hoge barium aanwezig).
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	zuur reinigingsmiddel
Argon gas	Praxair	AR 5.0UH-T	99,999% Ultra-hoge zuiverheid