Kwantitatieve Locomotion Studie van Vrij Zwemmen micro-organismen met behulp van laser diffractie

Samenvatting

Microscopische organismen zoals de vrij-zwemmen nematode C. elegans, Leven en zich gedragen in een complexe drie-dimensionale omgeving. We brengen verslag uit op een nieuwe benadering die analyse biedt van C. elegans Met behulp van diffractie patronen. Deze aanpak bestaat uit het bijhouden van de tijd periodiciteit van de diffractie patronen gegenereerd door het richten van laserlicht door een cuvet.

Samenvatting

Bodem en het aquatische microscopische organismen leven en zich gedragen in een complexe drie-dimensionale omgeving. De meeste studies van microscopisch organisme gedrag, daarentegen, zijn verricht met behulp van microscoop-gebaseerde benaderingen, die de beweging en gedrag tot een smalle, bijna twee-dimensionale focale gebied te beperken. ¹ Wij presenteren een nieuwe analytische benadering die real-time analyse van geeft vrij zwemmen C. elegans in een cuvette zonder afhankelijkheid microscoop gebaseerde apparatuur. Deze aanpak bestaat uit het bijhouden van de tijd periodiciteit van de diffractie patronen gegenereerd door het richten van laserlicht door het kuvet. We meten oscillatiefrequenties voor vrij zwemmen nematoden.

Analyse van het verre-veld diffractie patronen onthult aanwijzingen over de golfvormen van de aaltjes. Diffractie is het proces van licht buigen rond een object. In dit geval licht wordt afgebogen door de organismen. Het licht golven interfereren en kunnen vormen adiffraction patroon. A far-field of Fraunhofer, diffractiepatroon wordt gevormd als het scherm naar object afstand veel groter dan de buigingsinrichtingen object. In dit geval kan het diffractiepatroon berekend (gemodelleerd) met een Fourier transformatie. ^Twee

C. elegans zijn vrij levende bodem levende aaltjes die navigeren in drie dimensies. Ze bewegen zich zowel op een vaste matrix, zoals grond of agar-agar in een sinusvormige motorische patroon genaamd kruipen en in vloeistof in een ander patroon genaamd zwemmen. ³ De rollen van zintuiglijke informatie die door mechanosensorische, chemosensoring en thermosensory cellen die plastische veranderingen regeren in motorische patronen en schakelaars in patronen nu pas beginnen te worden opgehelderd. ⁴ Wij een optische aanpak te beschrijven voor het meten van nematode voortbeweging in drie dimensies die niet vereist dat een microscoop en zal ons in staat stellen om te beginnen met de complexiteit van nematode motoriek verkennen onder verschillende conditions.

Protocol

1. C. elegans Voorbereiding voor Video Analysis

1. Beweeg 10 tot 20 zwangere volwassen nematoden in de frisse NGM agar gevulde Petri platen met behulp van een dunne, platte platina draad pick. De petrischalen gevuld met de NGM agar bevatten een kleine ronde plek van E. coli (stam beperkte groei, OP50, geeft de beste resultaten) voor de nematoden te eten. Laat de nematoden om eieren te leggen voor 3-5 uur en verwijder vervolgens de volwassenen, waardoor de oprichting van een kleine, ontwikkelingsgebied-gesynchroniseerde cultuur van 50-150 nematoden. Laat de nematoden die vroege volwassenheid groeien door incuberen van de petrischalen bij 20 ° C gedurende 4-5 dagen. Deze cultuur methoden zijn gebaseerd op vastgestelde procedures (Stiernagle 2006). ⁵
2. Op de dag van de video-analyse, spoelt een bord van de jonge volwassen nematoden met 1 ml gedeïoniseerd, gedestilleerd water, waardoor het verzamelen van 50 tot 150 wormen uit de gesynchroniseerde cultuur. Een bufferoplossing zoals M9 of PBS kunnen ook worden gebruikt. Gebruik een microcentrifuge aan de w draaienORMS de bodem van de buis, of laten regelen door de zwaartekracht gedurende 15 minuten. Verwijder het meeste water uit de buis en vervangen door 1 ml gedeïoniseerd, gedestilleerd water om alle aanhangend bacteriën wassen van de nematoden.
3. Overdracht nematoden in water of buffer een kwarts cuvet met een micropipet. Het is belangrijk om te werken met een klein aantal, ongeveer 5-10 nematoden in totaal in een keer of nog minder, zodat een nematode per keer kunnen worden verlicht door de laser. Als het aantal nematoden op kweekplaten te groot verdunnen wormen in water of buffer tot een gewenste dichtheid wordt bereikt. Het is ook mogelijk om individuele nematoden kiezen om een ​​druppel water of buffer op een verse agar plaat te wassen en individuele wormen overbrengen naar de cuvette. In ons onderzoek hebben we gebruik gemaakt van 1 mm, 2 mm en 5 mm cuvette maten om de effecten van fysieke beperkingen te onderzoeken op zwemgedrag.

2. Optische Setup voor de Video analysis

1. Voer setup zoals weergegeven in figuur 1 met behulp van een 543 nm (groen) Helium-Neon (HeNe) laser, twee front-oppervlak aluminium spiegels, een cuvettehouder, een projectiescherm en een high-speed camera (Casio High Speed ​​Exilim) in staat van het filmen op ~ 240 fps. De twee spiegels worden gebruikt om de laserstraal doorheen het cuvette. Verschillende maten van cuvettes kan worden gebruikt afhankelijk van de aard van de studie. Als voorbeeld hebben we cuvettes die 5 mm dik om de effecten van ruimtelijke beperkingen laten zwemmen op frequenties. De laserstraal moet voldoen voor oversampling,. Dwz het organisme niet meer dan een derde van de laserstraal belemmeren. Voor C. elegans dient ongeveer 2 mm de laserstraal in diameter wanneer het interageert met een nematode. De laserstraal niet groter dan 5 mm in diameter vanaf het diffractie patroon moeilijk te vinden. De afstand van het buigen organisme het scherm moet veel groter danhet organisme zelf.
2. Parafilm plaats over de bovenkant van de cuvette en omkeren van de nematoden mengen in de waterkolom. Plaats de cuvette in een cuvettehouder zodat wormen in eerste instantie in de buurt van de top van de cuvet. Met de spiegels, sturen de laserbundel door het midden van de cuvet. Omdat de nematoden zijn zwaarder dan water, zullen ze langzaam naar de bodem van de cuvet, terwijl tegelijkertijd zwemmen in de waterkolom.
3. Op het projectiescherm, kleur de spot die overeenkomt met de uitgezonden laserstraal zwart verstrooiing verminderen de doorgaande bundel aan de projectiescherm (Figuur 2). Alternatief maakt een opening in het projectiescherm om de doorgaande bundel om door het scherm. Elimineren of verminderen verstrooiing van de doorgaande bundel zal de CCD array van de camera verzadigen door de doorgaande bundel.
4. Een maat voor de grootte van het diffractiepatroon te vangen, een lijn vanongeveer 5 cm op het projectiescherm naast de uitgezonden laserstraal plek zonder zich te bemoeien met het gebogen licht beeld.
5. Start de opname met de camera, terwijl de kamer brandt, zodat de 5 cm lijn op hetzelfde beeldmateriaal als de diffractie beelden. Draai de kamer licht uit. Record diffractie beelden op het scherm met de camera als wormen passeren de laserstraal.

3. Video Data Preparation

1. Installeer video-analyse-programma (Logger Pro: http://www.vernier.com/products/software/lp/ ) op de computer. Importeer de video in video-analyse-programma
2. Stel de oorsprong samenvalt met de verzonden laserspot. Stel de schaal met behulp van de 5 cm lijn op het projectiescherm.
3. Volg de hoekverdraaiing van de diffractiebeeld gevormd door elke nematode met de beeldanalyse software (figuur 3)
4. Om de angula vindenr verplaatsing door het nemen van de arctan (y / x), kopiëren en plakken van gegevens in een spreadsheet (Excel) en voeg 180 deg of π voor alle negatieve hoeken om een continue grafiek (Figuur 4) te produceren.

4. Real Time Data Acquisition voor Instant Observatie van Zwemmen Frequenties

1. Met dezelfde configuratie als de video analyse plaats een fotodiode (DET10A van Thorlabs) met een klein gebied (~ 1 mm ²⁾ uit het midden in het diffractiepatroon recht voor het projectiescherm.
2. Sluit de fotodiode op de digitale oscilloscoop (PicoScope gemaakt door Pico Technology) die wordt aangesloten op de computer via USB-poort. Let op de pak slaag patronen op het computerscherm.
3. Sla verkregen datasets in ASCII-of tekstformaat.

5. Data-analyse

1. Importeer de gegevens verkregen met behulp van video of de fotodiode in een data-analyse programma staat montage golfvormen met behulp van chi-kwadraat minimalisatie. Het programma hier gebruikt is Origin ( http://www.originlab.com/ ). Breng een sinusvormige curve thrashing frequentie (figuren 4 en 5) te bepalen.
2. Gemiddelde zwemmen frequenties van verschillende monsters en bepalen variantie. Voor dit onderzoek werden gegevens geanalyseerd statistisch met een enkele factor ANOVA gevolgd door de Bonferroni meervoudige vergelijkingen test. Een p-waarde <0,05 werd als statistisch significant.

6. Model Diffractie Patronen gemaakt van Mathematica als voorbeeld

Opmerking: Diffractie patronen kunnen worden gemodelleerd met behulp van veel verschillende computationele gereedschappen. Deze procedure verschilt voor verschillende computationele gereedschappen zoals Matlab, Excel, Oorsprong etc.

1. Maken Image: Neem beelden van nematoden op een microscoopglaasje met een traditionele microscoop.
2. Binarize beeld: Importeer de worm beeld 'Worm' into Mathematica door de afbeelding te verslepen in Mathematica. Converteer de afbeelding in een zwart-wit beeld (binarize). Dit kan worden bereikt met het Binarize 'commando in Mathematica: BlackandWhiteImage = Binarize [Worm]. Het beeld kan dan worden gezien als een zwart-wit beeld.
   U kunt ook de 'EdgeDetect' commando om een ​​BlackandWhiteImage maken: EdgeDetect [Worm, 6.0,0.035], waar de twee afsluitende nummers controle van de grofheid van de resulterende randen.
3. Converteert een opname in een matrix van nullen en enen: Dit kan worden bereikt met de 'ImageData' commando in Mathematica: Matrix = ImageData [BlackandWhiteImage].
4. Fourier transformatie matrix: Gebruik de 'Fourier' commando in Mathematica aan Fourier-transformatie van de matrix met behulp van de aangegeven FourierParameters: FTransform = Fourier [Matrix, FourierParameters -> {0, -2}].
5. Vierkante modulus van matrix om de diffractie matrix te verkrijgen en te verbeteren beeldcontrast: Square de absolutewaarde van de matrix en het resulterende beeld te bekijken, het diffractiepatroon correspondeert met de originele afbeelding. Gebruik ook de 'Log' functie om het contrast van de afbeelding te schalen: ImageContrast = Image [Log [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5].
6. Resize voor het eenvoudig bekijken: Snijd de centrale diffractiepatroon en vergroten of verkleinen naar wens: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500].
7. Vergelijk de gemodelleerde diffractie patronen met diffractie patronen verkregen uit vrij zwemmen wormen. (Figuur 6)

Resultaten

Als voorbeeld hebben we bestudeerd C. elegans in een kwarts cuvet 1 cm breed, 5 mm dik en 4 cm hoog doseren. Bemonstering een worm met videoanalyse de gemiddelde frequentie verkregen zwemmen video analyse in een 5 mm dikke cuvette ongeveer 2,5 Hz (figuur 4). Ook bemonstering een worm met de real time data acquisitie methode we een zwembad frequentie van ongeveer 2,7 Hz (figuur 5) met de digitale oscilloscoop (PicoScope). Deze procedure kan worden herhaald voor veel wormen. Een gedetailleerde studie van vrij zwemmen wormen onthulde een gemiddelde swimming frequentie van 2,37 Hz in een 5 mm cuvette. ⁶ Zoals verwacht, het zwembad hoger is dan die van een kruipende worm (~ 0,8 Hz). ³ Met deze diffractiemethode, de gemiddelde zwemmen frequenties van een C. elegans, die beperkt is tot een objectglaasje, is gevonden dat de eerder gepubliceerde waarde van 2 Hz passen. ^1,7

ve_content "> volgende procedures 3.) en 6.) maakt het modelleren van zwemmen diffractiepatronen met behulp van worm beelden verkregen met een conventionele microscoop. De gemodelleerde diffractiepatronen worden gebruikt om een duik cyclus van de C. elegans simuleren ( figuur 6). Een succesvolle model bestaat uit fysiek mogelijk opeenvolgende patronen passen swim het zwembad frequenties. worm moet in dezelfde vorm aan het einde van een duik cyclus als in het begin van een cyclus zwemmen.

Figuur 1. Een groene HeNe laser werd gebruikt om een dynamische diffractiepatroon met levende C. creëren elegans. Dit diffractiepatroon werd gefilmd op 240 fps.

Figuur 2. Dra wing een zwarte stip verhoogt de opname van de doorgaande bundel. Verzadiging van de camera door verstrooid licht wordt verminderd en het diffractiepatroon zichtbaar.

Figuur 3. Schermopname van de video analyse software (Logger Pro) met een worm diffractie patroon dat gevolgd wordt. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 4. Video die overeenkomen met de cyclus van zwemmen een nematode in een 5 mm cuvette. De curve fit blijkt dat er een zwembad frequentie van ~ 2,5 Hz.

"/>
Figuur 5. Real-time gegevens corresponderend met het zwemmen cyclus van een nematode in een 5 mm cuvette. De curve fit blijkt dat er een zwembad frequentie van ~ 2,7 Hz.

Figuur 6. Bovenste rij geeft de feitelijke patronen en wordt afgestemd op de gemodelleerde diffractiepatronen in de onderste rij. De gemodelleerde diffractiepatronen werden geproduceerd met wormen op een microscoopglaasje (middelste rij).

Discussie

We hebben een nieuwe benadering voor de real-time meting van beweging en eenvoudige motorische gedrag in microscopische organismen zoals nematoden die niet vereist dat het gebruik van microscopen. ⁸ Dit methodologische benadering kan ook worden gebruikt voor het bestuderen van talrijke microscopische organismen zoals protisten. Deze methode is alleen beperkt door de golflengte van het gebruikte licht. Het organisme niet kleiner zijn dan de golflengte van het licht. Naast de kostenbesparingen en draagbaarheid van de benodigde apparatuur een belangrijk voordeel van deze aanpak is de mogelijkheid om het gedrag in real-time en in drie dimensies te meten, zonder de beperkingen van smalle beeldvlakken onder een microscoop. Het is ook mogelijk met deze techniek te onderzoeken invloeden van de zwaartekracht of tal van andere voorwaarden op gedrag dat niet kan worden bestudeerd met behulp van microscoop-gebaseerde benaderingen. ⁹ Zo kunnen we komen tot een beter begrip van micro-organismen natuurlijke motorische behaviors bevrijd van de beperkingen van microscoopglaasje druppels of gespecialiseerde microfluïdische kamers (Park et al., 2008) ^10.

Het gebrek aan-informatie in een diffractiepatroon niet mogelijk maakt het terughalen van het beeld overeenkomt met het object buigen aangezien de far-field diffractiepatroon evenredig is met het kwadraat van de absolute waarde van de Fourier transformatie. We Daarom berekening van diffractiepatronen worm beelden zodat ze worden gekoppeld aan de diffractiepatronen van vrij zwemmen nematoden (Figuur 6).

Deze methode heeft geleid tot resultaten voor echt vrij zwemmen C. elegans en kan worden toegepast op alle soorten die microscopische manoeuvres in een optisch transparante omgeving zoals water of verschillende ionische oplossingen. Conventionele microscopen staan ​​alleen studies met een scherptediepte in de orde van micrometers. ¹¹ Dit is te wijten aan de beperktescherptediepte bij het scherpstellen licht:

waarbij het ​​f-getal N heeft een wederzijdse relatie met de cirkel van verwarring (c) zodat een korte brandpuntsafstand is geassocieerd met een grote c. ^12,13 Hoewel deze diffractiemethode is zeker geen vervanging voor conventionele microscopie, het kan kwantitatieve resultaten te leveren snel, zodat soorten zelfs gemanipuleerd kunnen worden in real-time tegen lage kosten. De diffractiepatronen worden bepaald met een laser pointer. De diffractie patronen kunnen worden gefilmd met een lagere temporele resolutie met een gewone digitale camera. Terwijl de gebruiker geen microscoop of fotodiode beschikbaar kunnen belangrijke delen van dit experiment zoals het meten en evalueren thrashing frequenties diffractiepatronen te implementeren tegen zeer lage kosten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
543 nm Laser HeNe	Melles Griot	LGX1	Elke laser in het zichtbare gebied minder dan 5 mW worden gebruikt.
2 Front Surface Aluminium Spiegels	Thorlabs	PF10-03-F01
High Speed ​​Exilim camera	Casio
Quartz Cuvette	Starna Cellen	21/G/5
LoggerPro (Software)	Nonius		http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8	Wolfraam		http://www.wolfram.com/