Kwantitatieve FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse voor SENP1 Protease Kinetics Bepaling

Samenvatting

Een nieuwe werkwijze die kwantitatieve analyse van FRET (Förster Resonance Energy Transfer) signalen is beschreven voor het bestuderen enzymkinetiek. K _{M En K Cat Verkregen voor de hydrolyse van het katalytische domein van SENP1 (SUMO / Sentrin specifieke protease 1) een pre-SUMO1 (Small Ubiquitin-like modifier). De algemene beginselen van dit kwantitatieve FRET-gebaseerde protease kinetisch onderzoek kan worden toegepast op andere proteasen.}

Samenvatting

Omkeerbare posttranslationele modificaties van eiwitten met ubiquitine of ubiquitine-achtige eiwitten (Ubls) worden veel gebruikt voor het dynamisch regelen eiwitactiviteit en diverse rollen in vele biologische processen. Zo wijzigt SUMO covalent een groot aantal of eiwitten met een rol in de cellulaire processen, waaronder celcyclus regulering, celoverleving en dood, DNA schade respons, en stressrespons 1-5. SENP als SUMO-specifiek protease, functies als endopeptidase in de rijping van SUMO precursors of een isopeptidase verwijderen SUMO uit de doeleiwitten en vernieuw de SUMOylation cyclus ^1,3,6,7.

De katalytische efficiëntie of specificiteit van een enzym best gekenmerkt door de verhouding van de kinetische constanten, _kcat / _M. In verscheidene studies is de kinetische parameters van SUMO-SENP paren bepaald door verschillende methoden, waaronder polyacrylamide gel gebaseerde western-blot, radIOActive-gemerkt substraat, fluorescerende verbinding of eiwit gemerkt substraat ^8-13. De polyacrylamide-gel-gebaseerde technieken, die de "natieve" eiwitten gebruikt, maar zijn omslachtig en technisch zware, die niet verder lenen zich gedetailleerde kwantitatieve analyse. De verkregen _kcat / _M van studies met tetrapeptiden of eiwitten met ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) of AMC (7-amino-4-methylcumarine) fluorofoor waren ofwel tot twee orden van grootte lager dan de natuurlijke substraten of niet duidelijk onderscheid maken tussen de iso-en endopeptidase activiteiten van SENPs.

Recentelijk FRET gebaseerde protease assays werden gebruikt om de ubiquitinerings enzymen (Dubs) of SENPs bestuderen met het FRET paar cyaan fluorescent eiwit (CFP) en geel fluorescent eiwit (YFP) ^9,10,14,15. De verhouding van acceptor emissie van de donor emissie werd gebruikt als kwantitatieve parameter voor FRET signaal monitor voor protease activiteit vastberadenheid. Deze methode signaal kruisbesmettingen genegeerd de acceptor en donor emissie golflengten door acceptor en donor fluorescentie zichzelf en was dus niet nauwkeurig.

We hebben een nieuwe, uiterst gevoelige en kwantitatieve FRET gebaseerde protease assay voor het bepalen van kinetische parameters van pre-SUMO1 volgroeiing door SENP1. Een aangelegde FRET-paar CyPet en YPet met aanzienlijk verbeterde FRET efficiency en fluorescentie kwantumopbrengst, werden gebruikt om de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substraat ¹⁶ genereren. We onderscheiden en gekwantificeerd absolute fluorescentiesignalen bijgedragen door de donor en acceptor en FRET de acceptor en emissiegolflengten respectievelijk. De waarde van k _cat / K _M werd verkregen (3,2 ± 0,55) x 10 ^{7 M-1} s ^-1 van SENP1 naar pre-SUMO1, hetgeen overeenkomt met de algemene enzymatische kinetische parameters. Daarom is deze werkwijze geldt en kan worden gebruikt eensa algemene aanpak van andere proteasen karakteriseren als goed.

Protocol

1. Plasmideconstructen

1. Versterken de open reading frames van de genen door PCR en klonering van de PCR producten in pCRII-TOPO vector.
2. Bevestig de producten door sequentiebepaling en klonering van de cDNA codeert CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet en katalytische domeinen van SENP1 in de pET28 (b) vector met een N-eindstandige hexahistidine tag.

2. Protein Expression and Purification

1. Escherichia coli cellen transformeren van stam BL21 (DE3) met pET28 (b) coderen CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet en de katalytische domeinen van SENP1.
2. De getransformeerde bacteriën gekweekt in 2xYT medium gedurende 3 uur bij 37 ° C (schudden bij 250 rpm) tot een optische dichtheid van 0,5 bij 600 nm bereiken.
3. Voeg 100 uM isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) (eindconcentratie) om eiwitexpressie te induceren en gedurende 16 uur schudden bij 25 ° C bij 200 rpm.
4. Oogst de bacteriën door centrifugatie bij 10.000 rpm bij 4 ° C gedurende 5 min en resuspendeer ze in een buffer van 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl en 5 mM imidazool.
5. Sonificeer de cellen gedurende 10 min in 5 sec tussenpozen met een vermogensinstelling van 25 W met MiSonics 4000 sonicator opvangen en door centrifugeren bij 35.000 xg bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
6. Stel de kolom met 500 ml Ni-NTA beads voor 1 L cultuur en de overdracht van de supernatant in de kolom.
7. Was de hars met buffer van 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl en 10 mM imidazool tweemaal.
8. Elueer eiwit met buffer van 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl en 500 mM imidazool en dialyse in een buffer van 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl en 1 mM dithiothreitol (DTT) bij 4 ° C overnacht.
9. Wordt de concentratie van de gezuiverde eiwitten door de Bradford assay. Alternatieve methode voor eiwitconcentratie metingen SDS-PAGE-gelelektroforese zijn en vervolgens gekleurd met Coomassie blauw gevolgd met imagingkwantitatieve.

3. Kwantitatieve FRET Spectrum Analysis

1. De algemene strategie voor de assay was gebaseerd op FRET signalering (figuur 1). De FRET-paar is CyPet en YPet, gekoppeld aan de N-en C-termini, respectievelijk pre-SUMO1. SENP1 het fusie-eiwit splitst CyPet-(pre-SUMO1)-YPet de Gly-Gly site in SUMO1 de C-terminus en daarmee geeft de SUMO staart met YPet. De FRET signaal wordt verstoord, hetgeen resulteert in een toename van de emissie van CyPet en een dramatische afname van de emissie YPet's at the CyPet excitatiegolflengte.
2. Wanneer opgewekt door licht met een golflengte 414 nm, de totale fluorescentie-emissie van CyPet-(pre-SUMO1)-YPet bij 530 nm kan worden uit drie bronnen: de absolute FRET geïnduceerde YPet de emissie CyPet direct emissie en YPet directe emissie (Fig. 2).

waar FL _{530/414 <}/ Sub> is de totale fluorescentie-emissie bij 530 nm wanneer opgewekt bij 414 nm, FL _FRET is de absolute FRET signaal, FL _{CyPet (cont)} is de CyPet directe emissie wanneer opgewekt bij 414 nm, en FL _{YPet (cont)} is de YPet directe emissie wanneer opgewekt bij 414 nm. De subscript van (vervolg) staat voor bijdrage.

3. De directe emissie van CyPet bij 530 nm is evenredig aan de emissie bij 475 nm na excitatie bij 414 nm met een constante verhouding van α. CyPet-SUMO1 werd bereid in concentraties van 50, 100, 200, 500 en 750 nM en 1 mM en emissie bij 475 en 530 nm werden gemeten na excitatie bij 414 nm om α (Figuur 3-1) bepalen.
4. De directe emissie van YPet bij 530 nm onder excitatie bij 414 nm is evenredig aan de emissie bij 530 nm na excitatie bij 475 nm met een constante verhouding van β. YPet werd bereid in concentraties van 50, 100, 200, 500, 750 eennd 1000 nM en de emissie bij 530 nm werd gemeten toen de monsters werden opgewekt door golflengten van 414 en 475 nm om β (figuur 3-2) bepalen.
5. Wanneer CyPet-(pre-SUMO1)-YPet werd verteerd door SENP1, de splitsing vrijgegeven CyPet-SUMO1 en de SUMO1 staart met YPet. Wanneer de verbinding werd geëxciteerd bij 414 nm, werd de fluorescentie-emissie bij 530 nm (FL _'530/414) met maar nog worden onderverdeeld in drie categorieën:

waar FL _'530/414 is de totale fluorescentie-emissie bij 530 nm na de spijsvertering wanneer opgewekt bij 414 nm, FL' _FRET is de resterende absolute FRET signaal, FL _{'CyPet (475/414)} is de CyPet emissie bij 475 nm na de spijsvertering als opgewonden bij 414 nm (hier de CyPet emissie uit twee delen: onverteerde CyPet-(pre-SUMO1)-YPet en verteerd CyPet-SUMO1), en FL _YPet(530/475) is YPet emissie bij excitatie bij 475 nm, die constant of CyPet-(pre-SUMO1)-YPet wordt verteerd of niet.

6. Na digestie door SENP1, de resterende FRET emissie (FL _"FRET) is:

waarin C de totale concentratie van CyPet-(pre-SUMO1)-YPet en x de concentratie van gedigereerde CyPet-(pre-SUMO1)-YPet.

7. Door het combineren van alle items, de gedetecteerde fluorescentie-emissie bij 530 nm onder excitatie van 414 nm (FL _'530/414) is:

4. FRET gebaseerde Protease Assay voor Enzyme Kinetic Study

1. CyPet-(pre-SUMO1)-YPet werd geïncubeerd met het katalytische domein van SENP1 bij 37 ° C in een buffer van 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 0,1% (v /v) Tween-20 en 1 mM DTT tot een totaal volume van 80 ml en overgebracht naar 384-wells plaat.
2. Runs werden uitgevoerd door het meten van de fluorescentie-emissie bij 475 en 530 nm na excitatie bij 414 nm in een fluorescentie-plaatlezer multiwell gedurende 5 min met 15 seconde.
3. De reactiesnelheid (v) is gecorreleerd met de verandering in de hoeveelheid substraat (S) als:

4. De concentratie van product exponentieel van 0 als [S] ₀ (oorspronkelijke substraatconcentratie) bij t = 0:

5. Op t = 0, de oorspronkelijke snelheid (V ₀₎ is:

6. Het concentration van SENP1 werd vastgesteld en de concentratie van CyPet-(pre-SUMO1)-YPet verhoogd van 100 keer meer dan de concentratie van het enzym, dat volgens Michaelis-Menten vergelijking.
7. Alle fluorescente metingen werden geanalyseerd door de kwantitatieve analysemethode FRET en afgebeeld in GraphPad Prism V Software de Michaelis-Menten vergelijking passen. De niet-lineaire regressie kan ook worden uitgevoerd met behulp van meer gebruikelijke softwarepakketten zoals spreadsheet programma's (zoals Microsoft Excel).

5. Representatieve resultaten

Rijping van pre-SUMO1 door SENP1 kan worden bepaald door het volgen van de veranderingen in de fluorescentie signaal bij 475 en 530 nm tijdens het proces. Het resultaat toonde dat de snelheid van pre-SUMO1 digestie door SENP1 in een substraat dosis afhankelijke wijze (Figuur 4). Dit suggereert dat het katalytische domein van SENP1 vertoont uitstekende activiteit voor rijping pre-SUMO1's. De eerste reactie snelheden werden berekend volgens bovenstaande analyse met verschillende substraatconcentraties (tabel 1).

De _kcat / _M-verhouding wordt algemeen gebruikt om de efficiëntie van verschillende enzymen vergelijken met een substraat of een bepaald enzym met verschillende substraten. K _M en V _max te verkrijgen bij de Michaelis-Menten vergelijking door het uitzetten van de verschillende initiële snelheden, die overeenkomen de verschillende concentraties CyPet-(pre-SUMO1)-YPet (Figuur 5) k _cat werd verkregen.:

Volgens de bovenstaande analyse de berekende K _M 0,21 ± 0,04 uM, de _kcat was 6,90 ± 0,28 ^s-1 en de _kcat / _M bedroeg (3,2 ± 0,55) x 10 ^{7 M-1} > S ^-1.

Figuur 1. Grafiek van FRET-gebaseerde assay voor protease SENP pre-Sumos rijping.

Figuur 2. Kwantitatieve analyse van fluorescent signaal als bijdragen van de donor, acceptor en FRET. Dissectie van de emissie spectra van CyPet-(pre-SUMO1)-YPet onder excitatie bij 414 nm. FL _{CyPet (530/414)} wordt CyPet De emissie bij 530 nm onder excitatie van 414 nm, FL _FRET is de FRET-geïnduceerde YPet emissie bij 530 nm onder excitatie van 414 nm, en FL _{YPet (530/414)} is YPet's emissie bij 530 nm onder excitatie van 414 nm.

load/4430/4430fig3.jpg "/>
Figuur 3. Berekening van richting emissiefactor α en β.

Figuur 4. Kwantitatieve analyse van CyPet-(pre-SUMO1)-YPet gedigereerd met verschillende verhoudingen van het katalytische domein van SENP1. Reacties werden gevolgd binnen de eerste 5 minuten.

Figuur 5. Michaelis-Menten grafische analyse van digestie CyPet-(pre-SUMO1)-YPet's door SENP1. De gegevens werden uitgezet en geanalyseerd met GraphPad Prism V en niet-lineaire regressie.

[S] (uM)	V 0 (uM / s)
0.115	0,0023 ± 0,00005
0.214	0,0028 ± 0,00004
0.407	0,0033 ± 0,00007
0.594	0,0037 ± 0,00013
0.725	0,0043 ± 0,00012
1.471	0,0051 ± 0,00036
1.899	0,0050 ± 0,00031
2.300	0,0050 ± 0,00062

Tabel 1. Eerste snelheden bepaling van rijping pre-SUMO1's door SENP1. In elk substraatconcentratie werden vier monsters voor de vertering te meten. De standaardafwijking kwam van de variaties van deze vier monsters.

K M (uM)	k cat (s-1)	kcat / M (M-1 s •-1)
0,21 ± 0,04	6,90 ± 0,28	3,2 ± 0,55 x 10 7

Tabel 2. Kinetische parameters van rijping pre-SUMO1's door SENP1 door kwantitatieve analyse FRET. De standaardafwijking was van de vier monsters in elk substraatconcentratie.

Discussie

FRET technologie is gebruikt om vooraf SUMO1 de rijping studie door SENP1 ^9. CFP-YFP werd gebruikt als FRET-paar en ratiometrische analyse, is de verhouding van donor acceptor aan emissies, werd gebruikt om de kinetische eigenschappen karakteriseren. Er is echter geen rekening gehouden met donor en acceptor zelf fluorescentie in de traditionele ratiometrische FRET analyse. De verhouding niet rechtstreeks verband met de hoeveelheid gedigesteerd substraat.

Hier rapporteren we een on...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer
PCR II TOPO Kit	Invitrogen	K466040
2xYT	Onderzoek Producten Internationa.l Corp	X15600
Ni-NTA Agrose	Thermo Scientific	88222
Coomassie plus (Bradford) Gehalte Regent	Thermo Scientific	23238
384-wells plaat (glazen bodem)	Greiner	781892
FlexStation II 384 plaatlezer	Molecular Device