Een nieuwe werkwijze die kwantitatieve analyse van FRET (Förster Resonance Energy Transfer) signalen is beschreven voor het bestuderen enzymkinetiek. K M En K Cat Verkregen voor de hydrolyse van het katalytische domein van SENP1 (SUMO / Sentrin specifieke protease 1) een pre-SUMO1 (Small Ubiquitin-like modifier). De algemene beginselen van dit kwantitatieve FRET-gebaseerde protease kinetisch onderzoek kan worden toegepast op andere proteasen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwantitatieve FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse voor SENP1 Protease Kinetics Bepaling
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Omkeerbare posttranslationele modificaties van eiwitten met ubiquitine of ubiquitine-achtige eiwitten (Ubls) worden veel gebruikt voor het dynamisch regelen eiwitactiviteit en diverse rollen in vele biologische processen. Zo wijzigt SUMO covalent een groot aantal of eiwitten met een rol in de cellulaire processen, waaronder celcyclus regulering, celoverleving en dood, DNA schade respons, en stressrespons 1-5. SENP als SUMO-specifiek protease, functies als endopeptidase in de rijping van SUMO precursors of een isopeptidase verwijderen SUMO uit de doeleiwitten en vernieuw de SUMOylation cyclus 1,3,6,7.
De katalytische efficiëntie of specificiteit van een enzym best gekenmerkt door de verhouding van de kinetische constanten, kcat / M. In verscheidene studies is de kinetische parameters van SUMO-SENP paren bepaald door verschillende methoden, waaronder polyacrylamide gel gebaseerde western-blot, radIOActive-gemerkt substraat, fluorescerende verbinding of eiwit gemerkt substraat 8-13. De polyacrylamide-gel-gebaseerde technieken, die de "natieve" eiwitten gebruikt, maar zijn omslachtig en technisch zware, die niet verder lenen zich gedetailleerde kwantitatieve analyse. De verkregen kcat / M van studies met tetrapeptiden of eiwitten met ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) of AMC (7-amino-4-methylcumarine) fluorofoor waren ofwel tot twee orden van grootte lager dan de natuurlijke substraten of niet duidelijk onderscheid maken tussen de iso-en endopeptidase activiteiten van SENPs.
Recentelijk FRET gebaseerde protease assays werden gebruikt om de ubiquitinerings enzymen (Dubs) of SENPs bestuderen met het FRET paar cyaan fluorescent eiwit (CFP) en geel fluorescent eiwit (YFP) 9,10,14,15. De verhouding van acceptor emissie van de donor emissie werd gebruikt als kwantitatieve parameter voor FRET signaal monitor voor protease activiteit vastberadenheid. Deze methode signaal kruisbesmettingen genegeerd de acceptor en donor emissie golflengten door acceptor en donor fluorescentie zichzelf en was dus niet nauwkeurig.
We hebben een nieuwe, uiterst gevoelige en kwantitatieve FRET gebaseerde protease assay voor het bepalen van kinetische parameters van pre-SUMO1 volgroeiing door SENP1. Een aangelegde FRET-paar CyPet en YPet met aanzienlijk verbeterde FRET efficiency en fluorescentie kwantumopbrengst, werden gebruikt om de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substraat 16 genereren. We onderscheiden en gekwantificeerd absolute fluorescentiesignalen bijgedragen door de donor en acceptor en FRET de acceptor en emissiegolflengten respectievelijk. De waarde van k cat / K M werd verkregen (3,2 ± 0,55) x 10 7 M-1 s -1 van SENP1 naar pre-SUMO1, hetgeen overeenkomt met de algemene enzymatische kinetische parameters. Daarom is deze werkwijze geldt en kan worden gebruikt eensa algemene aanpak van andere proteasen karakteriseren als goed.
Protocol
1. Plasmideconstructen
- Versterken de open reading frames van de genen door PCR en klonering van de PCR producten in pCRII-TOPO vector.
- Bevestig de producten door sequentiebepaling en klonering van de cDNA codeert CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet en katalytische domeinen van SENP1 in de pET28 (b) vector met een N-eindstandige hexahistidine tag.
2. Protein Expression and Purification
- Escherichia coli cellen transformeren van stam BL21 (DE3) met pET28 (b) coderen CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet en de katalytische domeinen van SENP1.
- De getransformeerde bacte....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
FRET technologie is gebruikt om vooraf SUMO1 de rijping studie door SENP1 9. CFP-YFP werd gebruikt als FRET-paar en ratiometrische analyse, is de verhouding van donor acceptor aan emissies, werd gebruikt om de kinetische eigenschappen karakteriseren. Er is echter geen rekening gehouden met donor en acceptor zelf fluorescentie in de traditionele ratiometrische FRET analyse. De verhouding niet rechtstreeks verband met de hoeveelheid gedigesteerd substraat.
Hier rapporteren we een on.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
We zijn erg dankbaar voor Victor GJ Rodgers voor waardevolle adviezen. Wij danken alle leden van de Liao-groep voor zeer nauwe samenwerking werk en voor hulp bij dit onderzoek. Dit onderzoek werd ondersteund door de National Institutes of Health (Grant AI076504 naar JL).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 | |
| 2xYT | Onderzoek Producten Internationa.l Corp | X15600 | |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 | |
| Coomassie plus (Bradford) Gehalte Regent | Thermo Scientific | 23238 | |
| 384-wells plaat (glazen bodem) | Greiner | 781892 | |
| FlexStation II 384 plaatlezer | Molecular Device |
Referenties
- Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
- Hay, R. T.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
