Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Microgavage van zebravis Larven

17.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/4434

⸱

20 februari 2013

 , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

In dit artikel

Samenvatting

Wij presenteren een nieuwe methode voor microgavage van zebravislarven met gebruik van standaardapparatuur voor embryo-microinjectie en stereomicroscopie. We tonen aan dat microgavage een veilige en efficiënte techniek is die nuttig is voor het toedienen van gecontroleerde hoeveelheden uiteenlopende materialen specifiek in het lumen van de darm van de zebravislarve.

Samenvatting

De zebravis is een krachtig modelorganisme geworden voor het bestuderen van darmontwikkeling1-5, fysiologie6-11, ziekten12-16 en gastheer-microbe-interacties17-25. Experimentele benaderingen voor het bestuderen van de darmbiologie vereisen vaak de in vivo introductie van geselecteerde materialen in het lumen van de darm. In het larvale zebravismodel wordt dit doorgaans bereikt door vissen onder te dompelen in een oplossing van het geselecteerde materiaal, of door injectie via de buikwand. Bij de immersiemethode is het moeilijk om de route of timing van de toediening van materiaal aan de darm nauwkeurig te monitoren of te controleren. Om deze reden kan blootstelling door immersie onbedoelde toxiciteit en andere effecten op extra-intestinale weefsels veroorzaken, wat het potentiële bereik van de hoeveelheden materiaal dat in de darm kan worden afgeleverd, beperkt. Bovendien kan de hoeveelheid materiaal die tijdens blootstelling door immersie wordt opgenomen aanzienlijk variëren tussen individuele larven26. Hoewel deze problemen niet voorkomen bij directe injectie via de buikwand, is een correcte injectie moeilijk en veroorzaakt het weefselschade die de experimentele resultaten kan beïnvloeden. Wij introduceren een methode voor microgavage bij zebravislarven. Het doel van deze methode is om een veilige, effectieve en consistente manier te bieden om materiaal met een gecontroleerde timing direct in het lumen van de anterieure darm bij larvale zebravisen af te leveren. Microgavage maakt gebruik van standaard embryo-microinjectie- en stereomicroscopie-apparatuur die gebruikelijk is in de meeste laboratoria die onderzoek met zebravissen uitvoeren. Zodra de vissen correct zijn gepositioneerd in methylcellulose, kan gavage snel worden uitgevoerd met een snelheid van ongeveer 7-10 vissen/min, en de overleving na gavage nadert 100%, afhankelijk van het toegediende materiaal. We tonen ook aan dat microgavage het mogelijk maakt om het darm lumen te laden met hoge concentraties materialen die dodelijk zijn voor vissen bij blootstelling door immersie. Om het nut van deze methode aan te tonen, presenteren we een fluorescent dextran-microgavage-assay die kan worden gebruikt om het transport van het darm lumen naar extra-intestinale ruimtes te kwantificeren. Deze test kan worden gebruikt om de correcte uitvoering van de microgavage-procedure te verifiëren, en biedt ook een nieuwe zebravis-assay om de integriteit van de intestinale epitheliale barrière te onderzoeken onder verschillende experimentele omstandigheden (bijv. genetische manipulatie, medicamenteuze behandeling of blootstelling aan omgevingsfactoren). Verder laten we zien hoe gavage kan worden gebruikt om de intestinale motiliteit te evalueren door fluorescerende microsferen toe te dienen en hun daaropvolgende transport te monitoren. Microgavage kan worden toegepast om diverse materialen af te leveren, zoals levende micro-organismen, gesecreteerde microbiële factoren/toxines, farmacologische middelen en fysiologische probes. Met deze mogelijkheden heeft de microgavage-methode bij larvale zebravis het potentieel om een breed scala aan onderzoeksvelden die gebruikmaken van het zebravis-modelsysteem te verbeteren.

Protocol

We maken gebruik van gepubliceerde protocollen voor de standaardhouderij en verzorging van zebravis om larven te verkrijgen voor microgavage27. We maken voornamelijk gebruik van natuurlijke voortplanting om de vissen te vermeerderen, en ze worden gehouden op een cyclus van 14 uur licht/10 uur donker. Dit protocol is geoptimaliseerd voor microgavage van zebravislarven op 6-7 dagen na bevruchting (dpf). We verwachten dat deze methoden over het algemeen toepasbaar zijn op jongere en oudere ontwikkelingsstadia met geringe aanpassingen. Tenzij anders vermeld, hebben we de wild-type TL zebravisstam gebruikt op 6 dpf, en de vissen zijn niet gevoed. Alle experimenten werden uitgevoerd in systeemwater afkomstig uit onze conventionele zebravis-aquacultuurfaciliteit; echter kan elk geschikt zebravismedium (bijv. embryo medium of gnotobiotisch zebravismedium (GZM)28) worden gebruikt. In dit protocol gebruiken we de term 'zebravismedia' om het medium naar keuze van de gebruiker aan te duiden.

1. Bereiding van methylcellulose, gavage-mal en fabricage van microgavage-naalden

Bereid de dag voor of vroeg op de dag van het experiment de methylcellulose, de agarosematrijs voor stabilisatie van de larven en de microgavage-naalden voor.

  1. Los 3 g methylcellulose op in 100 ml steriel, gedeïoniseerd water of zebravishodium (afhankelijk van uw toepassing) om een 3% oplossing te maken. Voeg een magnetische roerkolf toe aan de fles, verhit het water tot vlak voor het kookpunt en plaats deze op een roerplaat bij een hoge temperatuur. Strooi tijdens het roeren langzaam methylcellulose toe om klontvorming te voorkomen. Verlaag gedurende de dag langzaam de roersnelheid en de temperatuur van de roerplaat totdat deze op kamertemperatuur is.
  2. Laat de oplossing gedurende de nacht langzaam doorroeren totdat de methylcellulose volledig is opgelost. De oplossing kan gedurende enkele maanden bij kamertemperatuur worden bewaard in een luchtdichte container.
  3. Bereid een 3% agarosegelvorm voor in een Petri-schaal van 10 cm met behulp van een plastic mal (Adaptive Science Tools, TU-1) volgens de instructies van de fabrikant. Sluit af met parafilm en bewaar bij 4 °C tot gebruik om uitdroging te voorkomen. Warm voorafgaand aan het experiment op tot kamertemperatuur of 28 °C. Agarosemallen kunnen over het algemeen meerdere keren worden hergebruikt.
  4. Trek verschillende gavage-naalden uit borosilicaatglascapillairen met een Flaming Brown Micropipette Puller voorzien van een breed-trog warmtedraad (FT330B). De programma's die wij gebruiken voor de fabricage van naalden zijn als volgt:
NaaldtypeDrukWarmteTrekkenSnelheidTijd
embryo50031510050200
gavage50031512575200

Aangezien filamenten per instrument kunnen variëren, dient de opwarmtijd (actieve verwarmingstijd) te worden genoteerd. Onze opwarmtijd ligt voor dit programma tussen de 8,57-8,79 ms. Dit programma creëert kortere, robuustere naalden dan traditionele micro-injectienaalden (Figuur 1). Deze instellingen moeten mogelijk worden geoptimaliseerd voor gebruik in verschillende micropipet-pullers.

2. Afknippen, vullen en kalibreren van de microgavage-naalden

Opmerking*: Het afknippen van de naald is een kritische stap in dit protocol. Daarnaast zullen de methoden voor het laden en kalibreren van de naald variëren afhankelijk van het type micro-injectieapparaat dat wordt gebruikt. Wij hebben dit protocol geoptimaliseerd met Drummond II micro-injectoren, maar we verwachten dat dit protocol met geringe aanpassingen ook toepasbaar is op andere micro-injectie-instrumenten. Aangezien injectie-opstellingen en naaldtrekkers per laboratorium verschillen, is het belangrijk om de injectievolumes te meten/kalibreren (zie sectie 2.8).

  1. De naalden worden afgeknipt onder een stereomicroscoop. Wij gebruiken een Leica S6E stereomicroscoop ingesteld op een vergroting van 2,5x. Bij deze instelling is ons oculair-meetraster met 100 indelingen 2 mm lang.
  2. Rij de punt van de naald uit met het uiteinde van de meetlat van het raster (indeling 100) en knip de naald af met fijne horlogemakerspincetten op ~1 mm van de punt (indeling 48-50) (Figuur 1A).
  3. De naald moet stomp zijn en een diameter van ~27-30 μm hebben. Inspecteer de naaldpunten bij een vergroting van 100x. Scherpe of gekartelde naalden leiden tot een hogere kans op schade tijdens de gavage en moeten indien mogelijk worden vermeden.
  4. Als alternatief kan, indien beschikbaar, een microforge worden gebruikt om het knippunt van de naald beter te beheersen en de naaldpunten vuurgepolijst te maken om scherpe randen te verwijderen (Figuur 1B).
  5. Bereid de gavage-oplossing voor. Voor de meeste toepassingen bereiden wij de oplossing voor met toevoeging van een 1:10 verdunning van een 0,5% fenolrood-oplossing in Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) (Sigma-Aldrich), om ervoor te zorgen dat de oplossing onder de stereomicroscoop zichtbaar is om de juiste werking van de micro-injector en de plaatsing van de gavage-oplossing in de anterieure bulb te bewaken. Andere laadkleurstoffen dan fenolrood zijn niet geëvalueerd, maar zouden gebruikt kunnen worden.
  6. Bereid de gavage-naald voor door deze te vullen met minerale olie met behulp van een 1 ml spuit met een 25G 5/8-naald. Monteer deze op de Nanoject II micro-injectie-unit.
  7. Wikkel een plastic Petri-schaal van 10 cm in parafilm om een vlak, waterdicht oppervlak te verkrijgen en breng ~2 μl van de gavage-oplossing aan op de parafilm. Vul de gavage-naald handmatig van achteren, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen luchtbellen in de minerale olie ontstaan.
  8. Om de functie van de micro-injector te testen en het uitstootvolume te kalibreren, vult u een Petri-schaal van 3 cm met minerale olie en injecteert u in de olie totdat de druppels consistent in grootte zijn. Meet de diameter van de druppels met behulp van het meetraster of een meetfunctie op de stereomicroscoop, indien beschikbaar. Bereken het druppelvolume (Vergelijking: V=4/3πr3). De volumiconsistentie tussen naalden is uitgezet (Figuur 1C).
  9. Spoel de punt van de naald door herhaaldelijke onderdompeling in schoon zebravismedium om residuen van minerale olie te verwijderen voordat u met de gavage begint. Minerale olie is zeer dicht en kan schade aan epitheelweefsels veroorzaken als het niet van de naaldpunt wordt gewassen.

3. Anesthesie, Montage en Gavage van Zebravissenlarven

  1. Warm de agarosematrijs op bij kamertemperatuur of 28 °C voorafgaand aan het experiment.
  2. Bereid de agarosematrijs voor op gavage door 3 groeven te bedekken met 3% methylcellulose. Gebruik een hoeveelheid methylcellulose die voldoende is om de groeven te vullen en de vissen vast te houden, maar niet zo weinig dat het snel uitdroogt.
  3. Portioneer in een schone 6-wellplaat zebrafishlarven voor elke experimentele groep in afzonderlijke wells, die elk 3,5-4,0 ml zebrafishmedium bevatten.
  4. Bereid een 3x tricaine-oplossing (0,05% w/v) in het juiste zebrafishmedium. Anestheseer de vissen well voor well door een gelijk volume 3x tricaine in de well met larven te mengen voor een uiteindelijke concentratie van 1,5x (0,025%), en zwenk voorzichtig.
  5. Zodra de zebrafish stoppen met bewegen, worden ze met een glazen Pasteurpipet met wijde boring en een pipetpomp uit de well gehaald en één voor één op de methylcellulose geplaatst, met hun kop op de 45° hoek van de groef en hun staart gericht naar de 90° hoek van de groef. Druk ze voorzichtig in de methylcellulose met een stompe dissectiesonde om hun positie te stabiliseren.
  6. Stel de Nanoject II micro-injectieopstelling zo in dat de naald in een flauwe hoek staat die ongeveer parallel loopt aan de 45° hoek van de agarosematrijs. Zorg ervoor dat het bereik van de naald voldoende is om voorbij de bodem van de matrijs-well te reiken, zodat er minder aanpassingen nodig zijn zodra de vissen op hun plaats liggen.
  7. Stel de micro-injectie-unit in om maximaal 4,6 nl af te geven op de slow-injectieinstelling (23 nl/sec). Bij deze instellingen moet het afgeleverde volume net de anterieure bulb van de darm vullen en niet uit de slokdarm of cloaca lekken. Afhankelijk van het doel van het experiment kunnen kleinere volumes worden gebruikt.
  8. Gebruik één hand om kleine aanpassingen aan de plaat met de geïmmobiliseerde larven te maken, terwijl u tegelijkertijd de andere hand gebruikt om de manipulator van de micro-injectie-unit te bedienen.
  9. Manoeuvreer de gavanenaald voorzichtig in de bek van de geanestheseerde vissen, door de slokdarm, en druk de slokdarmsfincter licht in om de punt van de gavanenaald net binnen de anterieure intestinale bulb te brengen (Figuur 2, stap 1-2, a&b).
  10. Zodra de naald zich in de anterieure bulb bevindt, wordt het voetpedaal of de injectieknop voorzichtig ingedrukt om het materiaal toe te dienen. Trek de naald snel en vloeiend terug, waarbij u probeert geen aanzienlijke hoeveelheden materiaal in de slokdarm achter te laten (Figuur 2, stap 3-4).
  11. Verplaats na de gavage de zebrafishlarven met een glazen Pasteurpipet met wijde boring en een pipetpomp voorzichtig naar vers medium. Vul de pipet met water tot ongeveer 1 inch boven de knik in de hals, maak een klein waterzakje in de methylcellulose bij de kop van de larve om deze los te maken, til de kop voorzichtig in de opening van de pipet en zuig de larve uit de methylcellulose. Expelleer de vis en al het water voorzichtig uit de pipet in een schaal met vers medium.
  12. Spoel de larven in vers medium door ze voorzichtig op en neer te pipetteren of meerdere keren te besprenken met medium om de methylcellulose te verwijderen en de larven uit de anesthesie te laten ontwaken. Verplaats de larven naar een Petrischaal of 6-wellplaat totdat ze nodig zijn voor daaropvolgende beeldvorming en analyse.

4. Dextran-assay om de veiligheid van gavage en de integriteit van de darmbarrière te testen

Microgavage kan worden gebruikt om diverse materialen in de darm toe te dienen. Als voorbeeld geven we hieronder een protocol voor het toedienen van een 10 kD dextran geconjugeerd aan Texas Red om de barrièreintegriteit van het darmepitheel te analyseren. Er bestaan ten minste twee potentiële routes voor paracellulaire permeabiliteit, met verschillen in selectiviteit op basis van lading en grootte van de opgeloste stoffen, aangeduid als de "pore"- of "leak"-routes29. Aangezien dit dextran te groot is om via de paracellulaire pore-route door het darmepitheel te worden geabsorbeerd (groottebeperking ~4Å, 10kD dextran= ~23Å)9,30-32, zou het in het lumen moeten blijven indien de integriteit van de darmbarrière niet is aangetast. Hoewel 10 kD dextran via de paracellulaire leak-route getransporteerd zou kunnen worden, heeft deze route een lagere capaciteit en tragere kinetiek29,33 en is het daarom onwaarschijnlijk dat dit plaatsvindt binnen het tijdsbestek van deze assay. Een 'positieve controle'-behandeling om de barrièreintegriteit te verstoren, wordt verschaft door de toevoeging van EDTA, wat de epitheliale tight junctions verstoort34,35. Deze dextran gavage-assay kan worden gebruikt als kwaliteitscontrole om aan te tonen dat de gavage-procedure veilig wordt uitgevoerd zonder onbedoelde weefselschade. Daarnaast kan deze assay worden gebruikt om de integriteit van de darmbarrière te testen als functie van genotype of behandeling.

  1. Bereid de volgende gavage-oplossingen: 1% dextran/1x PBS/0,05% fenolrood en 1% dextran/20 mM EDTA/1x PBS/0,05% fenolrood (positieve controle). De 5% dextran-voorraadoplossing in ddH2O wordt bewaard in aliquots van 50 μl bij -20 °C om het aantal vries-dooi-cycli te beperken. Bereid daarnaast een mock gavage-oplossing van 1x PBS/0,05% fenolrood.
    + controle (EDTA)zonder EDTA
 stockfinaleverdunningsfactor10 μl10 μl
EDTA, pH 8200 mM20 mM1010
Dextran5%1%522
PBS10x1x1011
Fenolrood0,50%0,05%1011
   subtotaal:54
   ddH2O:56
   Totaal:1010
  1. Gebruik het protocol in sectie 3 om groepen van 10-20 zebravislarven voor elke experimentele conditie te gavageren. Herhaal dit indien mogelijk in dubbele of driedubbele groepen.
  2. Laat de larven na de gavage herstellen van de anesthesie en laat ze vrij zwemmen in vers medium.
  3. Anestheseer de larven 18-20 min na de gavage opnieuw zoals beschreven in stap 3.3. Positioneer de larven in 3% methylcellulose bovenop een blok 3% agarose (dit vermindert achtergrondreflectie tijdens de beeldvorming).
  4. Beeld de larven uit met een fluorescentiestereoscoop (bijv. Leica M205C) en een Texas Red-filterset bij een vergroting waarbij de larven zichtbaar zijn van de snuit tot net posterior van het einde van de cloaca.
  5. Neem alle beelden op met dezelfde belichtingsinstellingen zodat ze later gekwantificeerd en vergeleken kunnen worden. De fluorescentie zal intens zijn in het lumen van de darm bij alle dextraan-geïnjecteerde larven, maar de barrièrefunctie wordt geëvalueerd op basis van de hoeveelheid dextraan die verschijnt in extra-intestinale weefsels (d.w.z. de romp en bloedvaten) (Figuur 5). Stel de belichting zo in dat fluorescentie in de romp zichtbaar is, zelfs als dit leidt tot overbelichting van de fluorescentie in het lumen.
  6. Verspreid de gavage-tijden zodat elke groep ongeveer dezelfde tijd kan herstellen na de gavage en op ongeveer hetzelfde tijdstip na de gavage wordt gefotografeerd. Voor dit experiment kost elke groep ongeveer 1 uur voor één persoon. Vissen worden geanestheseerd 18-20 min na de gavage, en de beeldvorming duurt ~1-2 min per vis.
  7. Gebruik een programma voor beeldanalyse, zoals ImageJ, om de relatieve gemiddelde fluorescentie-intensiteit te kwantificeren in een gebied van de romp net boven de darm. Normaliseer deze waarden door een achtergrondmeting af te trekken die is genomen in een gebied van het beeld buiten de vis.
  8. Zet de gegevens uit de beeldanalyse in grafieken en analyseer deze met GraphPad Prism of soortgelijke statistische software.

5. Fluorescerende microsfeer-assay om de intestinale motiliteit te testen

Gavage biedt een verbeterde controle over de timing en de hoeveelheid toegediend materiaal aan de darm, waardoor het een ideale alternatieve methode is voor studies naar de intestinale motiliteit. Eerder gepubliceerde technieken voor het meten van de intestinale motiliteit in zebravislarven omvatten directe observatie van intestinale contracties en golven via microscopie1,21,36, of het voeren van larven met voedsel gemengd met geel-groene fluorescerende polystyreen microbolletjes26. In sommige studies is de kwantificering van intestinale motiliteitspatronen verbeterd door larven onder te dompelen in media die voedselkleurstof bevatten37 of door een gespecialiseerde videoanalysetechniek genaamd spatiotemporele mapping38,39. Hier presenteren wij een proof-of-concept studie om aan te tonen dat het mogelijk is om fluorescerende microbolletjes via gavage in de anterieure darmbol te brengen, en dat het volgen van de beweging van de microbolletjes kan worden gebruikt om de intestinale motiliteit te beoordelen (Figuur 6). Het primaire verschil tussen deze methode en de aanpak van Field en collega's26 is dat de bolletjes afzonderlijk worden ingebracht en niet in voedsel kunnen worden verwerkt vanwege de beperkingen in de diameter van de gavenageld).

  1. Houd de zebrafish-larven in 10 cm platen met 35 ml medium tot het experiment wordt uitgevoerd op 7 dpf. Begin met het voeren van de larven elke ochtend vanaf 5 dpf met ~0,6 mg poedervoeder (larven dieet, zoals eerder beschreven40; toegediend met een steriele, 1 mm inoculatielus).
  2. Schud de fles Fluoresbrite YG 2,0 μm polystyreen microsferen (~2,5% waterige suspensie) voorzichtig om de suspensie te mengen. Breng een druppel uit de fles over op parafilm, zodat een specifiek volume via pipetteren kan worden gemeten.
  3. Centrifugeer de beads in een Eppendorf-buisje op lage snelheid in een benchtop microcentrifuge, verwijder het supernatant en vervang dit door 1x PBS in het oorspronkelijke volume. Herhaal dit proces om de microsferen 2 keer te wassen.
  4. Bereid een gavage-suspensie voor bestaande uit 0,25% microsferen (1:10 verdunning van de stocksuspensie)/1x PBS/0,05% fenolrood. Er bevinden zich ~2,6x103 microsferen in het gavage-volume van 4,6 nl dat per larve wordt toegediend.
  5. Gebruik het protocol in sectie 3 om het gewenste aantal larven te gavageren. Microsferen hebben een zekere drijfkracht; daarom moet de gavage zo snel mogelijk worden uitgevoerd om de consistentie van de suspensie te maximaliseren.
  6. In dit experiment werden 15 larven gavaged en vervolgens, na het herstel van de anesthesie, ondergebracht in individuele wells van een 12-wells plaat om de transit in individuen te kunnen volgen. Grotere groepen kunnen echter ook worden gegavaged, waarbij de transit als populatie in plaats van individueel wordt beoordeeld. Raadpleeg Field et al. voor standaardprocedures26.
  7. Beoordeel de intestinale motiliteit door de meest rostrale (of anterieure) locatie van de fluorescerende microsferen in levende larven op verschillende tijdstippen te scoren met een fluorescent stereomicroscoop. Anestheseer de larven kort in 1x (0,017%) tricaine en score de zones van de locatie van de microsferen of maak afbeeldingen om deze later te scoren.
  8. Zet het percentage van het totaal aantal larven met microsferen in een bepaalde intestinale regio in de loop van de tijd in een grafiek en vergelijk deze gegevens.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Wanneer gavage correct wordt uitgevoerd, moet het toegediende materiaal volledig in de anterior darm verblijven, met weinig tot geen residu in de slokdarm (Figuur 3). Er moet een toedieningsvolume worden gekozen dat in de anterieure bulb past en niet via de cloaca of de slokdarm weglekt. Als het volume van het materiaal of de toedieningsdruk te hoog is, kan de fysieke kracht van de gavage leiden tot beschadiging van of lekkage door het epitheel. Het kan daarnaast andere componenten van het luminale milie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit werk beschrijven we een nieuw protocol voor de directe toediening van materialen aan de darm van zebravissenlarven via microgavage. Er zijn verschillende kritieke stappen gedurende de procedure waar rekening mee moet worden gehouden. Ten eerste moeten de zebravissenlarven in goede gezondheid verkeren vóór het gavage-experiment om sterfte die niet gerelateerd is aan de behandeling te voorkomen. Een andere belangrijke factor is de kwaliteit van de gavage-naald. Een van de moeilijkste delen van het protocol is het af...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenverstrengelingen gemeld.

Dankbetuigingen

Wij danken de leden van het Rawls-laboratorium voor nuttige suggesties over de inhoud en Dr. Alan Fanning voor waardevolle discussies over de permeabiliteit van tight junctions wat betreft grootte en disruptiemethoden. We danken tevens Dr. Michael Chua en Dr. Neal Kramarcy van de Michael Hooker Microscopy Facility voor de ondersteuning bij het gebruik van de confocale microscoop. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health-beurzen T32 DK007737-15 (voor trainee J.L.C.), F32 DK094592 (voor J.L.C.) en R01 DK081426 (voor J.F.R.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Finquel (Tricaine methanesulfonate)Argent Chemical LaboratoriesMS-222Anesthesie voor larven
Fenolrood-oplossingSigma-AldrichP0290-100 ml0,5% in DPBS, getest op celkweek
Minerale olie, licht, wit (hoge zuiverheid)AmrescoJ217-500 mlVoor het vullen van de naald en volumetests
TxRed-Dextran, 10.000 MW, lysine-fixeerbaarInvitrogen/ Molecular ProbesD-18631% suspensie in 1x PBS/fenolrood
FM4-64FXInvitrogen/ Molecular ProbesF346535 mM stockoplossing in water
MethylcelluloseMP Biochemicals0215549590
Borosilicaatglazen capillairenDrummond Scientific3-000-203-G/XOD 1,14 mm, ID 0,53 mm, 3,5 inch lengte
Plastic vorm voor het maken van mallenAdaptive Science ToolsTU-1
Nanoject II micro-injectie-unitDrummond Scientific3-000-204
Flaming Brown micropipet-puller, 3,0 mm breed filamentgootSutter Instrument Co.P-97, FT330BFabricage van naalden
Student Dumont #5 pincetFine Science Tools91150-200,1 x 0,06 mm, afknippen van naalden
Oculairraster, 5 mm - 100 divisiesLeica10394771Afknippen van naalden
MicroforgeNarishigeMF-900Afknippen en vuurpolijsten van naalden
Tuberculine SlipTip spuitennaaldBecton Dickinson3096261 ml, 25G 5/8-naald
Fluoresbrite YG microsferen (2,0 μm)Polysciences, Inc.18338Analyse van intestinale motiliteit
DissectiemicroscoopLeicaS6EGavage-procedure
Fluorescentie-stereomicroscoopLeicaM205CDextran-barrière-assay
Confocale microscoopZeissLSM510Beeldvorming van dextran in circulatie

Referenties

  1. Kuhlman, J., Eisen, J. S. Genetic screen for mutations affecting development and function of the enteric nervous system. Dev. Dyn. 236, 118-127 (2007).
  2. Pack, M., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  3. Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Dev. Biol. 255, 12-29 (2003).
  4. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mech. Dev. 122, 157-173 (2005).
  5. Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Dev. Biol. 286, 114-135 (2005).
  6. Hama, K., et al. In vivo imaging of zebrafish digestive organ function using multiple quenched fluorescent reporters. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 445-453 (2009).
  7. Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev. Biol. 360, 276-285 (2011).
  8. Rich, A. A new high-content model system for studies of gastrointestinal transit: the zebrafish. Neurogastroenterol Motil. 21, 225-228 (2009).
  9. Bagnat, M., Cheung, I. D., Mostov, K. E., Stainier, D. Y. Genetic control of single lumen formation in the zebrafish gut. Nat. Cell Biol. 9, 954-960 (2007).
  10. Bagnat, M., et al. Cse1l is a negative regulator of CFTR-dependent fluid secretion. Curr. Biol. 20, 1840-1845 (2010).
  11. Shepherd, I., Eisen, J. Development of the zebrafish enteric nervous system. Methods Cell Biol. 101, 143-160 (2011).
  12. Brugman, S., et al. Oxazolone-induced enterocolitis in zebrafish depends on the composition of the intestinal microbiota. Gastroenterology. 137, 1757-1767 (2009).
  13. Oehlers, S. H., et al. The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish. Dis. Model Mech. 4, 832-841 (2011).
  14. Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240, 288-298 (2011).
  15. Faro, A., Boj, S. F., Clevers, H. Fishing for intestinal cancer models: unraveling gastrointestinal homeostasis and tumorigenesis in zebrafish. Zebrafish. 6, 361-376 (2009).
  16. Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: a feasibility study. Inflamm. Bowel Dis. 16, 1162-1172 (2010).
  17. Kanther, M., et al. Microbial colonization induces dynamic temporal and spatial patterns of NF-kappaB activation in the zebrafish digestive tract. Gastroenterology. , (2011).
  18. Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4596-4601 (2004).
  19. Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Goodman, A. L., Trent, C. M., Gordon, J. I. In vivo imaging and genetic analysis link bacterial motility and symbiosis in the zebrafish gut. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7622-7627 (2007).
  20. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
  21. Bates, J. M., et al. Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation. Dev. Biol. 297, 374-386 (2006).
  22. Cheesman, S. E., Guillemin, K. We know you are in there: conversing with the indigenous gut microbiota. Res Microbiol. 158, 2-9 (2007).
  23. Bates, J. M., Akerlund, J., Mittge, E., Guillemin, K. Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota. Cell Host Microbe. 2, 371-382 (2007).
  24. Camp, J. G., Jazwa, A. L., Trent, C. M., Rawls, J. F. Intronic cis-regulatory modules mediate tissue-specific and microbial control of angptl4/fiaf transcription. PLoS Genetics. , In Press (2012).
  25. Cheesman, S. E., Neal, J. T., Mittge, E., Seredick, B. M., Guillemin, K. Epithelial cell proliferation in the developing zebrafish intestine is regulated by the Wnt pathway and microbial signaling via Myd88. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4570-4577 (2011).
  26. Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterol. Motil. 21, 304-312 (2009).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book. , 4 edn, University of Oregon Press. (2000).
  28. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nat. Protoc. 3, 1862-1875 (2008).
  29. Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: a dynamic duo. Annu. Rev. Physiol. 73, 283-309 (2011).
  30. Van Itallie, C. M., et al. The density of small tight junction pores varies among cell types and is increased by expression of claudin-2. J. Cell. Sci. 121, 298-305 (2008).
  31. Van Itallie, C. M., Anderson, J. M. Measuring size-dependent permeability of the tight junction using PEG profiling. Methods Mol. Biol. 762, 1-11 (2011).
  32. Watson, C. J., Rowland, M., Warhurst, G. Functional modeling of tight junctions in intestinal cell monolayers using polyethylene glycol oligomers. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, 388-397 (2001).
  33. Rodgers, L. S., Fanning, A. S. Regulation of epithelial permeability by the actin cytoskeleton. Cytoskeleton (Hoboken). 68, 653-660 (2011).
  34. Gonzalez-Mariscal, L., Chavez de Ramirez, B., Cereijido, M. Tight junction formation in cultured epithelial cells (MDCK). J. Membr. Biol. 86, 113-125 (1985).
  35. Palant, C. E., Duffey, M. E., Mookerjee, B. K., Ho, S., Bentzel, C. J. Ca2+ regulation of tight-junction permeability and structure in Necturus gallbladder. Am. J. Physiol. 245, C203-C212 (1983).
  36. Holmberg, A., Schwerte, T., Pelster, B., Holmgren, S. Ontogeny of the gut motility control system in zebrafish Danio rerio embryos and larvae. J. Exp. Biol. 207, 4085-4094 (2004).
  37. Rich, A., et al. Kit-like immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal tract reveals putative. 236, 903-911 (2007).
  38. Holmberg, A., Olsson, C., Hennig, G. W. TTX-sensitive and TTX-insensitive control of spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae. J. Exp. Biol. 210, 1084-1091 (2007).
  39. Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J. Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
  40. Flynn, E. J. 3rd, Trent, C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio. J. Lipid Res. 50, 1641-1652 (2009).
  41. Clifton, J. D., et al. Identification of novel inhibitors of dietary lipid absorption using zebrafish. PLoS One. 5, e12386(2010).
  42. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  43. Berghmans, S., Hunt, J., Roach, A., Goldsmith, P. Zebrafish offer the potential for a primary screen to identify a wide variety of potential anticonvulsants. Epilepsy Res. 75, 18-28 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Microgavage techniekdarm lumenfluorescent dextranembryo microinjectiestereomicroscopie apparatuurpositionering met methylcellulosenaaldkalibratiebarri re integriteitsassaydarmmotiliteit
Microgavage van zebravis Larven
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.