Wij presenteren een nieuwe methode voor microgavage van zebravislarven met gebruik van standaardapparatuur voor embryo-microinjectie en stereomicroscopie. We tonen aan dat microgavage een veilige en efficiënte techniek is die nuttig is voor het toedienen van gecontroleerde hoeveelheden uiteenlopende materialen specifiek in het lumen van de darm van de zebravislarve.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De zebravis is een krachtig modelorganisme geworden voor het bestuderen van darmontwikkeling1-5, fysiologie6-11, ziekten12-16 en gastheer-microbe-interacties17-25. Experimentele benaderingen voor het bestuderen van de darmbiologie vereisen vaak de in vivo introductie van geselecteerde materialen in het lumen van de darm. In het larvale zebravismodel wordt dit doorgaans bereikt door vissen onder te dompelen in een oplossing van het geselecteerde materiaal, of door injectie via de buikwand. Bij de immersiemethode is het moeilijk om de route of timing van de toediening van materiaal aan de darm nauwkeurig te monitoren of te controleren. Om deze reden kan blootstelling door immersie onbedoelde toxiciteit en andere effecten op extra-intestinale weefsels veroorzaken, wat het potentiële bereik van de hoeveelheden materiaal dat in de darm kan worden afgeleverd, beperkt. Bovendien kan de hoeveelheid materiaal die tijdens blootstelling door immersie wordt opgenomen aanzienlijk variëren tussen individuele larven26. Hoewel deze problemen niet voorkomen bij directe injectie via de buikwand, is een correcte injectie moeilijk en veroorzaakt het weefselschade die de experimentele resultaten kan beïnvloeden. Wij introduceren een methode voor microgavage bij zebravislarven. Het doel van deze methode is om een veilige, effectieve en consistente manier te bieden om materiaal met een gecontroleerde timing direct in het lumen van de anterieure darm bij larvale zebravisen af te leveren. Microgavage maakt gebruik van standaard embryo-microinjectie- en stereomicroscopie-apparatuur die gebruikelijk is in de meeste laboratoria die onderzoek met zebravissen uitvoeren. Zodra de vissen correct zijn gepositioneerd in methylcellulose, kan gavage snel worden uitgevoerd met een snelheid van ongeveer 7-10 vissen/min, en de overleving na gavage nadert 100%, afhankelijk van het toegediende materiaal. We tonen ook aan dat microgavage het mogelijk maakt om het darm lumen te laden met hoge concentraties materialen die dodelijk zijn voor vissen bij blootstelling door immersie. Om het nut van deze methode aan te tonen, presenteren we een fluorescent dextran-microgavage-assay die kan worden gebruikt om het transport van het darm lumen naar extra-intestinale ruimtes te kwantificeren. Deze test kan worden gebruikt om de correcte uitvoering van de microgavage-procedure te verifiëren, en biedt ook een nieuwe zebravis-assay om de integriteit van de intestinale epitheliale barrière te onderzoeken onder verschillende experimentele omstandigheden (bijv. genetische manipulatie, medicamenteuze behandeling of blootstelling aan omgevingsfactoren). Verder laten we zien hoe gavage kan worden gebruikt om de intestinale motiliteit te evalueren door fluorescerende microsferen toe te dienen en hun daaropvolgende transport te monitoren. Microgavage kan worden toegepast om diverse materialen af te leveren, zoals levende micro-organismen, gesecreteerde microbiële factoren/toxines, farmacologische middelen en fysiologische probes. Met deze mogelijkheden heeft de microgavage-methode bij larvale zebravis het potentieel om een breed scala aan onderzoeksvelden die gebruikmaken van het zebravis-modelsysteem te verbeteren.
Protocol
We maken gebruik van gepubliceerde protocollen voor de standaardhouderij en verzorging van zebravis om larven te verkrijgen voor microgavage27. We maken voornamelijk gebruik van natuurlijke voortplanting om de vissen te vermeerderen, en ze worden gehouden op een cyclus van 14 uur licht/10 uur donker. Dit protocol is geoptimaliseerd voor microgavage van zebravislarven op 6-7 dagen na bevruchting (dpf). We verwachten dat deze methoden over het algemeen toepasbaar zijn op jongere en oudere ontwikkelingsstadia met geringe aanpassingen. Tenzij anders vermeld, hebben we de wild-type TL zebravisstam gebruikt op 6 dpf, en de vissen zijn niet gevoed. Alle experiment....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wanneer gavage correct wordt uitgevoerd, moet het toegediende materiaal volledig in de anterior darm verblijven, met weinig tot geen residu in de slokdarm (Figuur 3). Er moet een toedieningsvolume worden gekozen dat in de anterieure bulb past en niet via de cloaca of de slokdarm weglekt. Als het volume van het materiaal of de toedieningsdruk te hoog is, kan de fysieke kracht van de gavage leiden tot beschadiging van of lekkage door het epitheel. Het kan daarnaast andere componenten van het luminale milie.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit werk beschrijven we een nieuw protocol voor de directe toediening van materialen aan de darm van zebravissenlarven via microgavage. Er zijn verschillende kritieke stappen gedurende de procedure waar rekening mee moet worden gehouden. Ten eerste moeten de zebravissenlarven in goede gezondheid verkeren vóór het gavage-experiment om sterfte die niet gerelateerd is aan de behandeling te voorkomen. Een andere belangrijke factor is de kwaliteit van de gavage-naald. Een van de moeilijkste delen van het protocol is het af.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenverstrengelingen gemeld.
Dankbetuigingen
Wij danken de leden van het Rawls-laboratorium voor nuttige suggesties over de inhoud en Dr. Alan Fanning voor waardevolle discussies over de permeabiliteit van tight junctions wat betreft grootte en disruptiemethoden. We danken tevens Dr. Michael Chua en Dr. Neal Kramarcy van de Michael Hooker Microscopy Facility voor de ondersteuning bij het gebruik van de confocale microscoop. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health-beurzen T32 DK007737-15 (voor trainee J.L.C.), F32 DK094592 (voor J.L.C.) en R01 DK081426 (voor J.F.R.).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Finquel (Tricaine methanesulfonate) | Argent Chemical Laboratories | MS-222 | Anesthesie voor larven |
| Fenolrood-oplossing | Sigma-Aldrich | P0290-100 ml | 0,5% in DPBS, getest op celkweek |
| Minerale olie, licht, wit (hoge zuiverheid) | Amresco | J217-500 ml | Voor het vullen van de naald en volumetests |
| TxRed-Dextran, 10.000 MW, lysine-fixeerbaar | Invitrogen/ Molecular Probes | D-1863 | 1% suspensie in 1x PBS/fenolrood |
| FM4-64FX | Invitrogen/ Molecular Probes | F34653 | 5 mM stockoplossing in water |
| Methylcellulose | MP Biochemicals | 0215549590 | |
| Borosilicaatglazen capillairen | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | OD 1,14 mm, ID 0,53 mm, 3,5 inch lengte |
| Plastic vorm voor het maken van mallen | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Nanoject II micro-injectie-unit | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Flaming Brown micropipet-puller, 3,0 mm breed filamentgoot | Sutter Instrument Co. | P-97, FT330B | Fabricage van naalden |
| Student Dumont #5 pincet | Fine Science Tools | 91150-20 | 0,1 x 0,06 mm, afknippen van naalden |
| Oculairraster, 5 mm - 100 divisies | Leica | 10394771 | Afknippen van naalden |
| Microforge | Narishige | MF-900 | Afknippen en vuurpolijsten van naalden |
| Tuberculine SlipTip spuitennaald | Becton Dickinson | 309626 | 1 ml, 25G 5/8-naald |
| Fluoresbrite YG microsferen (2,0 μm) | Polysciences, Inc. | 18338 | Analyse van intestinale motiliteit |
| Dissectiemicroscoop | Leica | S6E | Gavage-procedure |
| Fluorescentie-stereomicroscoop | Leica | M205C | Dextran-barrière-assay |
| Confocale microscoop | Zeiss | LSM510 | Beeldvorming van dextran in circulatie |
Referenties
- Kuhlman, J., Eisen, J. S. Genetic screen for mutations affecting development and function of the enteric nervous system. Dev. Dyn. 236, 118-127 (2007).
- Pack, M., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. <....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
