Gelijktijdige Whole-cell Opnames van Photoreceptors en Tweede-orde neuronen In amfibievliegtuig netvlies Slice Voorbereiding

Samenvatting

We beschrijven de bereiding van dunne netvlies plakken uit het water levende tijger salamanders ( Ambystoma tigrinum) En leg uit hoe we deze schijfjes te synaptische verwerking in het netvlies te bestuderen door het verkrijgen van dual whole-cell voltage clamp opnamen van fotoreceptoren en tweede-orde horizontale en bipolaire cellen.

Samenvatting

Een van de centrale taken in retinale neurologie is de schakeling van retinale neuronen en hoe deze verbindingen zijn verantwoordelijk voor de vormgeving de aan de hersenen signalen begrijpen. Fotonen worden gedetecteerd in de retina van staafjes en kegeltjes fotoreceptoren, die deze energie omzetten in een elektrisch signaal, verzenden naar andere retinale neuronen, waar het wordt verwerkt en doorgegeven aan de doelen in de hersenen via de oogzenuw. Belangrijke vroege inzichten in retinale circuits en visuele verwerking kwam uit de histologische studies van Cajal ^1,2 en, later, van elektrofysiologische opnames van de spiking activiteit van retinale ganglioncellen - de uitgang cellen van de retina ^3,4.

Het begrijpen van visuele verwerking in het netvlies vereist begrip van het signaal bij elke stap in de route van fotoreceptor tot retinale ganglioncellen. Echter, veel retinale celtypen zijn buried diep in het weefsel en dus relatief ontoegankelijk voor elektrofysiologische opname. Deze beperking kan worden overwonnen door te werken met verticale segmenten, waarbij cellen die binnen elk van de retinale lagen zijn duidelijk zichtbaar en toegankelijk voor elektrofysiologische opnames.

Hier beschrijven we een methode voor het maken van verticale secties van de netvliezen van larvale tijger salamanders (Ambystoma tigrinum). Hoewel dit preparaat werd oorspronkelijk ontwikkeld voor opnames met scherpe micro-elektroden ^5,6, beschrijven we een methode voor dual whole-cell voltage clamp opnamen van fotoreceptoren en tweede-orde horizontale en bipolaire cellen waarin membraanpotentiaal de afdrukband te manipuleren we tijdens het gelijktijdig opnemen van post- synaptische reacties in horizontale of bipolaire cellen. De fotoreceptoren van de tijger salamander zijn aanzienlijk groter dan die van zoogdieren, waardoor dit een ideale voorbereiding in te voeren tzijn technisch uitdagend experimentele benadering. Deze experimenten worden beschreven met een oog naar het sonderen signaleringseigenschappen van de synaptische ribbon - een gespecialiseerde synaptische structuur die in een slechts een handvol neuronen, zoals staafjes en kegeltjes fotoreceptoren, die goed geschikt is voor het handhaven van een hoog percentage tonische neurotransmitters ^{7 , 8} - en hoe het bijdraagt ​​aan de unieke signalering eigenschappen van deze eerste retinale synaps.

Protocol

1. Netvlies Slices Voorbereiding

1. Monteer de kamer (ontwerp in figuur 1). Plaats twee kralen van vacuüm vet, spaced ~ 8-10 mm uit elkaar, over de opname kamer om een ​​kanaal voor superfusate vormen en waarin aan de retinale plakjes insluiten. Voeg een tweede kraal van vet een paar millimeter verder uit dan elk van deze twee parels van vet op te treden als een dijk en limiet spillover. Plaats een klein driehoekig KimWipe aan het uiteinde van de kamer om vloeistof contact met de referentie-elektrode te waarborgen.
2. Druk een stukje nitrocellulose membraan (~ 5 x 10 mm; 0,8 micrometer poriën) plat tegen het glas microscoop dia in twee kleine kralen van vacuüm vet. Voorkomen dat vet direct onder het midden van het nitrocellulosemembraan, omdat dit kan voorkomen dat de retina kleeft.
3. Om het weefsel snijmachine te bereiden, breek een dubbele rand scheermesje in 4 stukken en voeg een tot het snijden arm. Snijd een dun plakje van nitrocellulose membraan dat de snijrand van het scheermesje vlak ligt tegen de opname kamer en dus maait door het nitrocellulosemembraan.
4. Houd een kleine beker van amfibieën zoutoplossing (tabel 1) op ijs bij de dissectie station.
5. Euthanaseren salamander door onthoofding. Hemisect het hoofd saggitaal en merg via het ruggenmerg. Doe de helft van het hoofd op een stuk katoen bevochtigd met amfibie zoutoplossing boven op een linoleum blok. De andere helft van het hoofd kan worden omwikkeld met een vochtige papieren handdoek en bewaard bij 4 ° C voor later op de dag.
6. Ophelderen het oog. Met behulp van kleine Vannas een schaar, knip de huid de ogen te sluiten op de omliggende baan. Na lossnijden van de voorkant van het oog van de omliggende orbitale weefsel, trekt het oog naar voren en schuif de schaar onder het oog te snijden door de oogspieren en de oogzenuw, het oog te bevrijden van de baan.
7. Plaats de enucleated oog op een bed van katoen op delinoleumblok. Gooi de half hoofd. Knip overtollig orbitale vet van de achterkant van het oog.
8. Maak een kleine incisie in het centrum van het hoornvlies met een scherp chirurgisch mes. Verwijder het hoornvlies door te schuiven fijne Vannas schaar in de incisie en verlenging van de snede radiaal uit naar de ora serrata. Knip de omtrek rond de ora serrata door het draaien van de linoleum blok of de katoen tussen bezuinigingen.
9. Na het snijden helemaal rond de ogen, verwijder het hoornvlies en de lens door ze uit te trekken van de kant van de oogschelp. Verplaats de resulterende oogschelp op een hard oppervlak van de linoleumblok bevochtigd met amfibie zoutoplossing. Snijd het in tweederde met een scherp scheermesje, met een fijn zagende beweging om ervoor te zorgen dat u helemaal hebben gesneden door de sclera.
10. Plaats een of twee stukken oogschelp op nitrocellulose membraan met de retinale naar beneden gericht. Dompel de resterende stukken met extra zout en leg ze in de koelkast bij ca. 4 ° C.
11. Gently drukt het stuk oogschelp tegen het nitrocellulose membraan met fijn pincet. Dompel het nitrocellulose membraan en oogschelp stuk met enkele druppels koud amfibie zoutoplossing en vlek aan de randen met KimWipe te helpen het netvlies te houden. Nogmaals, onderdompelen oogschelp en nitrocellulosemembraan met verscheidene druppels koud amfibieën zoutoplossing en afpellen de sclera / vaatvlies / netvliespigmentepithelium de retina isolaat (die roze kan optreden door de aanwezigheid van ongebleekte rhodopsine). Indien nodig, knip de oogzenuw aan het netvlies te bevrijden.
12. Als het netvlies heeft niet strak nageleefd, weglopen van de zoutoplossing met een KimWipe aan het netvlies trekken steviger neer op het nitrocellulose membraan. Vervang de zoutoplossing. Herhaal, indien nodig.
13. Vult de kamer met koud amfibie zoutoplossing en overbrengen naar het stadium van het weefsel snijmachine. Snijd het netvlies en nitrocellulose membraan in dunne reepjes, het werken van de ene naar de andere door het draaien van de vernier micrometerin stappen van 125 um. Druk op de scheermesje voorzichtig maar stevig door het netvlies en nitrocellulose membraan.
14. Overdracht van het netvlies plakken door het bewegen stroken nitrocellulose membraan naar het belangrijkste kanaal van de opname kamer. Til een strook membraan gratis en dan zijn plaats te houden terwijl u de kamer eronder, en zorg ervoor dat de plakjes onder water te houden. Sluit de randen van het nitrocellulosemembraan in de stroken van vacuüm vet, wentelen 90 graden retinale lagen geven.
15. Druk op de nitrocellulose membraan plat tegen het glasoppervlak. Zelfs als er geen retina op elk stuk, plaats stroken nitrocellulose membraan regelmatig (~ 1 mm uit elkaar) langs de gehele lengte van de perfusie kanaal te breken de oppervlaktespanning verbeteren fluïdumstroom.

2. Gepaarde Whole-cell Recordings

1. Nadat alle segmenten zijn overgedragen, verplaatst u de opname kamer op het podium van een rechte, vastestadium microscoop en bevestig de referentie-elektrode lood. Focus op de plakjes met behulp van een lange-werkafstand, onderdompeling in water, 40-60X objectief. De microscoop moet op een lucht tafel om trillingen te dempen worden geplaatst en opgesloten in een kooi van Faraday om elektrische interferentie te verminderen.
2. Superfuse de plakjes continu met een snelheid van 1 ml / min met amfibie zoutoplossing geborreld 100% O _2. Sluit de zuig-, zorg ervoor dat de in-en uitstroom in balans zijn. Uitstroom kan worden geregeld door rotatie van de afgeschuinde uiteinde van de naald afzuiging en bewegende KimWipe het eind van de kamer dichterbij of verder van de uitstroom naald. Het preparaat kan bij kamertemperatuur worden bewaard of koelen met een Peltier apparaat of om eenvoudigweg een pak ijs op de microscoop podium.
3. Onderzoeken schijfjes onder gedimd of infra-rood licht en identificeren van een paar cellen - een photoreceptor (staaf of kegel) en omgeving horizontale of bipolaire cel - tot doelwit voor whole-cell opname. Staven kan worden identified door hun grote cellichamen en prominente staafvormige buitenste segmenten (Figuur 2A). Kegels zijn kleiner dan hengels en hebben kleine taps toelopende buitenste segmenten. Bipolaire cel en horizontale cel SOMA zijn in de buitenste rij van cellichamen in de binnenste nucleaire laag (INL; figuren 2B en 2C).
4. Alvorens plakken, gebruik dan een pipet trekker te micropipetten vervaardigen van borosilicaatglas (1,2 mm buitendiameter, 0,95 mm binnendiameter met een glas gloeidraad). Het uiteinde van elke micropipet moet -1-2 micron in diameter.
5. Een niet-metalen vulling naald (bijvoorbeeld een vervaardigd van een 1 cc spuit of een microfilter), vul pipetten met het intracellulaire oplossing (tabel 1) en hechten aan de elektrodehouder.
6. De microscoop doelstelling enigszins verheffen. Plaats de photoreceptor pipet onder de doelstelling en dan zakken zodat het uiteinde is geplaatst net boven de plakjes. Herhaal dit met thij tweede pipet.
7. Pas enige compensatie in de basislijn huidige niveau op de versterker. Controleer de pipet weerstand met een 5-10 mV depolariserende puls. We gebruiken meestal pipetten die variëren 10-15 MQ, het resultaat van de lange tapsheid van de as en lage osmolariteit van de oplossingen amfibieën pipet. Met hogere osmolariteit zoogdieren oplossingen, deze zelfde pipetten vertonen weerstand waarden van ~ 8-12 MQ. Hoewel we hebben gebruikt grotere tip diameters met weerstandswaarden van 3-4 MQ in amfibie oplossingen, zijn de voordelen van een lagere toegang weerstand gecompenseerd door een grotere moeilijkheid in het afdichten op celmembranen en een snellere afbouw van calcium stromingen en andere second messenger -gevoelige reacties.
8. Terwijl het toepassen van lichte positieve druk, de positie van de post-synaptische pipet, zodat deze de horizontale of bipolaire cel lichaam. Vervolgens de presynaptische pipet, zodat deze de cel lichaam van een staaf of kegel fotoreceptoren. Opnames Appear stabieler te zijn bij pipetpunten contact binnenste segment dan de soma, vooral kegels.
9. Terwijl het toezicht op de weerstand, laat de positieve druk op de post-synaptische pipet. Soms is de publicatie van positieve druk voldoende om een ​​gigaohm afdichting. Zo niet, zachtjes zuig met een 1 ml spuit of via de mond. Na de tip weerstand gegroeid tot> 100 MQ, breng dan een bedrijf potentieel van -60 mV. Na het behalen van een gigaohm zegel, null uit elke pipet capacitieve transiënten en herhaal de afdichting procedure voor de photoreceptor pipet, het aanbrengen van een bedrijf potentieel van -70 mV.
10. Rupture de patch met behulp van uw mond of een spuit te zuigen gelden voor elke cel in de beurt. Staafjes, kegels, en bipolaire cellen zullen doorgaans breuk met zachte zuigkracht. Verkrijgen whole-cell configuratie met een horizontale cel grotere zuigkracht (dwz met een 3 cc injectiespuit) in combinatie met sterke lijst spanningspulsen geleverd met "zap" f vereiseneature van de patch-clamp versterker. Breuk van het membraan en vestiging van hele-cel configuratie zal duidelijk zijn door de verschijning van hele-cel capaciteit transiënten.
11. Bevestig de identiteit van de postsynaptische cel fysiologisch door een lichtflits en met een reeks stappen spanning van -120 tot +40 mV in stappen van 20 mV (figuren 3 en 4).
12. Te beoordelen of het paar cellen synaptisch verbonden, leveren een korte (25-100 msec), 60 mV depolarisatie stap naar de fotoreceptor (tot -10 mV, bij de piek van het L-type voltage-gated calcium stroom) en kijk voor post-synaptische stromen in de tweede orde neuronen (Figuur 5). Een sterke depolariserende stap moet een snelle, voorbijgaande actieve postsynaptische stroom roepen in de postsynaptische horizontale of OFF bipolaire cel door een uitbarsting van blaasjes afgifte uit de conus (figuur 5).

Resultaten

Representatieve sporen van licht antwoorden van neuronen in verticale plakjes salamander netvlies afgebeeld in figuur 3. De kegel, horizontale cel en UIT bipolaire cel al weer een buitenwaartse stroom in reactie op licht ontstaan. De prominente innerlijke stroom na de lichtflits in de horizontale en bipolaire cel opnames wordt veroorzaakt door de verhoogde afgifte van glutamaat uit fotoreceptoren als ze depolariseren op licht te compenseren. De OP bipolaire cel reageert met een innerlijke stroom bij het ​​aanzetten van licht als gevolg van een teken-omkeren metabotrope glutamaat receptor signalering cascade en activering van TRPM1 kanalen ^9. Horizontale cellen en bipolaire cellen kunnen worden onderscheiden van elkaar door de verhoudingen IV (Figuur 4). Horizontale cellen hebben meestal een lineaire of innerlijk rectificeren IV en lage input weerstand (<500 MQ; figuur 4A), terwijl bipolaire cellen hebben een hoge input weerstand(0.5-2 GQ) en buiten-rectificatie van I - V (figuur 4B) Figuur 5 toont representatieve resultaten uit opnames van een kegel-horizontale cel pair (figuur 5A) en kegel-OFF bipolaire cel pair (Figuur 5B).. In elk, depolariserend de kegel tot -10 mV van een bedrijf potentieel van -70 mV opgeroepen een voltage-gated calcium stroom in de kegel en snel naar binnen EPSC in de horizontale of bipolaire cel. Deze sterke stimulans is voldoende om de direct-afgeefbare pool van ~ 20 blaasjes uit elke synaptische lint, resulterend in een EPSC van ~ 47 pA / lint ¹⁰ legen. De horizontale cel EPSC in figuur 5A was 232 pA, wat suggereert dat het ontvangen 5 lint contacten uit de presynaptische kegel. Een soortgelijke schatting van de 178 pA EPSC in de off bipolaire cel (Figuur 5B) suggereert dat het ontvangen 4 lint contacten uit de presynaptische kegel.

	Amfibie zoutoplossing	Presynaptische pipet	Postsynaptische pipet
NaCl	116 mM	3,5 mM	3,5 mM
KCl	2,5 mM
CaCl2	1.8 mM	1 mM	1 mM
MgCl2	0,5 mM	1 mM	1 mM
HEPES	10 mM	10 mM	10 mM
Glucose	5 mM
Cs-glutamaat *		40 mM
Cs-gluconaat **		50 mM	90 mM
Tetraethylammoniumchloride		10 mM	10 mM
ATP-Mg		9 mM	9 mM
GTP		0,5 mM	0,5 mM
EGTA		5 mM	5 mM
pH ***	7.8	7.2	7.2
Osmolariteit ****	245 mOsm	240 mOsm	240 mOsm

* Cs-glutamaat door neutraliseren 40 mM L-glutaminezuur met 40 mM CsOH in de pipetoplossing. ** A 1 M voorraadoplossing van Cs-gluconaat wordt door neutraliseren van een oplossing van CsOH met 45-50% D-gluconzuur. *** De pH moet worden bijgesteld met NaOH voor de extracellulaire oplossing en CsOH de pipet oplossingen. **** Houd de osmolariteit van de oplossingen pipet net onder die van de extracellulaire oplossing voorkomt cel zwelling en verhoogt de levensduur van de opname.

Tafel1. Onderdelen en parameters voor de standaard intracellulaire en extracellulaire oplossingen die in dit protocol.

Figuur 1. Opname kamer ontwerp. (AC) Top, kant en opengewerkte uitzicht op de opname kamer met afmetingen. De kamer wordt vervaardigd uit een 2 mm dik stuk acryl. (D) Gemonteerd kamer. Superfusate komt in de kamer door een 10 cm lengte van Teflon buis (kolf; soort 24LW). Superfusate wordt verwijderd door toepassing van een geringe zuigdruk een schuine 20 metalen buis aan de andere zijde van de kamer. Grenzend aan deze uitgang buis is een Ag / AgCl pellet referentie-elektrode. De leiding van de referentie-elektrode is verbonden met de referentie-ingang van de headstage. Een kleine driehoek van KimWipewordt geplaatst over de referentie-elektrode te houden in contact met de oplossing en reguleren vloeistoftoevoer naar de uitlaatbuis. De basis van de kamer wordt gevormd door een microscoopglaasje in de verzonken randen van de kamer. De dia wordt op zijn plaats gehouden met een kraal van vacuüm vet. Stroken nitrocellulose membraan met retinale plakjes worden ingebed in kralen van vacuüm vet dat een kanaal voor oplossing stromen te vormen. Voorafgaand aan het maken van plakjes, wordt een 5 x 10 mm stukje nitrocellulose membraan aangebracht op de kamer met twee kleine kralen van vacuüm vet. Een stuk van de oogschelp is om geplaatst vitreale kant op deze nitrocellulose membraan en tilde weg zodra het netvlies kleeft. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2. Kleurstof gevulde cel paren in vertical slice voorbereiding. A) Beelden van een staaf en synaptically-gekoppelde horizontale cel die waren gevuld met contrasterende fluorescente kleurstoffen ingebracht via de patch pipet tijdens simultane whole-cell opname. Lucifer geel (2 mg / ml) werd opgenomen in de staaf pipetoplossing (geel) en sulfarhodamine B (1 mg / ml) werd opgenomen in de horizontale cel pipetoplossing (paars). Fluorescerende beelden werden opgenomen met een draaiende schijf confocale microscoop (Perkin Elmer Ultraview LCI) uitgerust met een gekoelde CCD-camera (Orca ER) en gemonteerd aan de vaste fase microscoop (Nikon E600 FN met 60X, 1.0 NA water immersie objectief). Deze beelden werden geplaatst op een helder veld beelden van de overeenkomstige netvlies plakken met behulp van Adobe Photoshop. B) afbeeldingen van een kegel en synaptically-gekoppelde OFF bipolaire cel. De bipolaire cel axon terminal vertakt zich in de buitenste (S1) sublamina van de binnenste plexiform laag in de buurt van de grens met de binnenste nucleaire laag. C) Beelden van een kegel en synaptically-gekoppelde horizontale cel. Merk op dat de kegel terminals zijn aanzienlijk groter dan de axon terminal van de staaf. Hoewel horizontale cellen kunnen worden geïdentificeerd door de langwerpige vorm van hun cellichamen, cellichamen van de ON-en OFF-soort bipolaire cellen in de INL niet gemakkelijk worden voorafgaand aan de opname onderscheiden. Echter, een doel verplaatst kegel aangedreven OFF bipolaire cellen die cel organen in de ONL kan worden onderscheiden uit kegels door de afwezigheid van binnenste en buitenste segmenten. De schaal bar is 20 micrometer.

Figuur 3. Licht-opgewekte stromen opgenomen onder spanning klem uit vier verschillende retinale neuronen in reactie op een heldere 500 msec flits van wit licht. De conus (A), horizontale cel (B), en uit bipolaire cellen (C) al gereageerd op het licht met een buitenwaartse stroom. (D) De op bipolaire cellen reageerden op hetzelfde licht stimulus met een innerlijke stroom. De basislijnruis tentoongesteld door de off bipolaire cel (C) geeft een continue afgifte van synaptische blaasjes in de duisternis die verdwijnt wanneer fotoreceptoren hyperpolariseren in licht. Reacties van deze vier cellen werden verkregen in afzonderlijke opnamen met plakjes bereid onder wit licht. De intensiteit van het witte licht stimulus die in deze voorbeelden geproduceerd reacties in horizontale en bipolaire cellen gelijk aan 580 nm foton flux van 1 x 10 ⁵ fotonen / sec / um ^2.

Figuur 4. Stroom-spanning (IV) relaties van horizontal en uit bipolaire cellen. (A) Bovenpaneel, membraan stromen opgewekt door een reeks 150 msec spanning stappen van -120 tot +40 mV toegepast in stappen 20 mV (onderste paneel) een horizontale cel. Horizontale cellen hebben typisch een lage ingangsweerstand en lineaire of binnenwaarts rectificeren IV verhoudingen. (B) IV relatie van een off bipolaire cel in reactie op een aantal spanningsstappen. Bipolaire cellen een hogere ingangsweerstand en een buitenwaarts rectificeren IV, op de activering van voltage-gated kalium stromen.

Figuur 5. Voorbeelden van gepaarde opnamegegevens. (A) Opname van de kegel voltage-gated calcium stroom (Cone I _Ca ) in reactie op een 100 msec stap naar -10 mV met een potentiaal van -70 mV (Cone _Vm). Lek en capaciteit transiënten werden afgetrokken met een P / 8 lek aftrekken protocol. Een snelle prikkelende postsynaptische stroom (EPSC, HC PSC) werd gelijktijdig opgenomen van een horizontale cel, waaruit blijkt dat deze twee cellen synaptisch gekoppeld (B) een EPSC werd opgenomen in een off bipolaire cel in reactie op dezelfde stimulus in de andere. kegel.

Discussie

Het netvlies slice voorbereiding is zeer nuttig gebleken voor het analyseren van de circuits en mechanismen in dienst van het netvlies om visuele informatie te verwerken. Het vermogen om hele cellen opnamen gelijktijdig verkrijgen van pre-en post-synaptische neuronen is bijzonder nuttig in dit streven. Gepaarde whole cell opnames zijn veel gemakkelijker te bereiken met plakjes dan met een flatscreen-mount netvlies voorbereidingen omdat de verschillende netvlies lagen worden blootgesteld. Bovendien, vanwege hun grote retinale neuronen, salamanders hebben een lange geschiedenis als een netvlies voorbereiding en dus zorgen voor een bijzonder goed gekarakteriseerd modelsysteem.

Met de praktijk, kunnen gezonde sneetjes salamander netvlies regelmatig worden voorbereid. Een paar belangrijke stappen kunnen het verschil tussen succes en mislukking. 1) Zorg ervoor dat het scheermesje wordt op het weefsel snijmachine gemonteerd, zodat het vlak ligt tegen het glasoppervlak en plakken netjes hoewel zowel het weefsel en underlying nitrocellulose membraan. Als u een schone snede hebben gemaakt door het nitrocellulose membraan, moet u een zachte klik hoort als het scheermes het oppervlak van het glasplaatje slaat. 2) Zorg ervoor dat het netvlies heeft gehandeld op grond van het nitrocellulose membraan. Anders kan het netvlies weg te drijven van het membraan tijdens elke stap van de procedure. 3) Gebruik geen gesneden plakjes bloot aan de lucht, omdat dit veel van de oppervlakkige cellen beschadigen. 4) Zorg ervoor dat de plakjes en nitrocellulose membraan liggen plat tegen het glaasje zodat de retinale lagen zijn duidelijk zichtbaar onder de microscoop ontleden. 5) De balans van de tarieven van superfusate-en uitstroom in om te voorkomen dat overloopt de opname kamer. Dit voorkomt plotselinge oplossing niveaus, die abrupte bewegingen weefsel kan veroorzaken. 6) Kies gezonde paar cellen dicht bij elkaar. Cellen met gladde cytoplasma gezonder zijn dan cellen met korrelig cytoplasma. Cellen dieper in de slice hebben meer kans op intacte synaptische con behoudencontacten. 7) Zorg ervoor dat de pipet tip is niet gebroken of geborsteld tegen andere weefsel of puin op de weg naar beneden naar de cellen. 8) Controleer de pipet weerstand zodat deze niet verstopt met vuil of een bel, die beide kunnen het moeilijk een kwalitatief whole-cell opname te verkrijgen.

Inplaats van de retina op nitrocellulose filterpapier, sommige onderzoekers insluiten retina in een blok van agar en gebruik een vibratome om retinale plakjes. Hoewel we deze aanpak niet geprobeerd, Kim et al.. ¹¹ bespreken voordelen van beide benaderingen. In hun ervaring, de agar-gebaseerde benadering zorgt voor een meer consistente opbrengst van platte schijfjes met goed afgebakende retinale lagen, maar het filter papier gebaseerde aanpak levert gezondere fotoreceptoren.

Staafjes en kegeltjes zijn verantwoordelijk voor transducing licht in veranderingen in de membraanpotentiaal. Met gepaarde opnames, kan de membraanpotentiaal van staven of kegels MANIPUL zijndirect en zo ated het vermogen om licht reacties genereren, terwijl nuttig voor het identificeren van celtypen, kan niet essentieel zijn. We bereiden daarom vaak segmenten in wit licht. Echter, zelfs wanneer bereid onder felle verlichting, salamander retinale neuronen kunnen grote licht responsen genereren zoals blijkt uit de reacties in Fig. 3. Dit is deels te wijten aan een relatief groot reservoir van chromofoor in de grote buitenste segment van volume, maar kan ook een uiting van het vermogen van Müller cellen tot 11-cis-retinal regenereren voor kegels ^12. Om volledig donker aangepaste licht reacties te verkrijgen, kan men de plakjes bereiden onder infrarood verlichting. Voor dissecties onder infrarood licht, hechten we GenIII beeldversterkers (Nitemate NAV3, Litton Industries, Tempe, AZ) om de lenzen van de microscoop ontleden en verlichten het weefsel met een infrarood LED-zaklamp. Voor het snijden en andere procedures die niet zijn uitgevoerd onder de microscoop ontleden, maken we gebruik van een head-mounted image versterker. Voor de plaatsing van de patch pipetten, visualiseren we plakken met behulp van een infrarood-gevoelige CCD-camera (bv. Watec 502H, Watec Inc, Middletown, NY) gemonteerd aan de staander, vaste-fase microscoop. Met deze voorzorgsmaatregelen, kan een hengel reacties vertoont enkel foton gevoeligheid ^{6, 13} te verkrijgen.

Een beperking van het werken in het netvlies plakken is dat lang cellulaire processen van groot veld retinale neuronen tijdens het snijden procedure veel van hun dendrieten kunnen verliezen. Retinale slice preparaten zijn daarom bruikbaar voor de fysiologie van cellen waarin het synaptische contacten betrokken processen dichtbij het cellichaam. Amfibieën en zoogdieren netvliezen delen veel van dezelfde celtypen en gebruik maken van soortgelijke fysiologische mechanismen ^14-16. Terwijl salamander netvlies is een goed model voor veel aspecten van zoogdierretina blijkt een belangrijk verschil met de aanwezigheid van een specifieke staaf route in zoogdieren die involves contacten van gespecialiseerde staf bipolaire cellen op AII amacrinecellen ^14. Een extra beperking van de salamander netvlies is het kleine aantal genetische instrumenten die specifiek ontwikkeld voor deze soort. Echter, antilichamen en reagentia die shRNA doel goed geconserveerde gebieden in andere species met succes kan worden gebruikt salamander, evenals vele kleine molecule inhibitoren en peptide reagentia. Bovendien, met enkele wijzigingen in techniek netvlies plakjes kunnen worden bereid uit andere soorten waarbij sommige van deze instrumenten zijn beschikbaar.

Naast zijn bruikbaarheid voor gepaarde whole-cell opname, de salamander netvlies slice voorbereiding is vatbaar voor een aantal andere benaderingen. Zoals hierboven besproken kan netvlies segmenten worden gebruikt om licht reacties in combinatie met diverse onderzoeken voltage clamp protocollen ^17. Retinale neuronen kunnen geladen worden met fluorescerende kleurstoffen gevoelig voor ^{Ca2 +,} Cl ^- of Na+ Geïntroduceerd door de patch pipet of door bad-applicatie ^15,18-20. Een fluorescent peptide dat bindt aan de synaptische lint ²¹ kan worden ingevoerd via de patch pipet en gebruikt voor beeldvorming van het lint ¹⁰ of, wanneer geconjugeerd aan fluoresceïne, voor acuut en selectief beschadiging van de band ^22. We hebben ook netvlies segmenten in combinatie met quantum dots op de bewegingen van afzonderlijke calciumkanalen in staafjes en kegeltjes synaptische terminals ²³ volgen. Dus de verticale netvlies slice is een veelzijdige experimentele voorbereiding bestuderen basic synaptische mechanismen en unieke verwerkingsfuncties uitgevoerd bij de eerste synaps in de signalisatie pathway.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tissuse slicer	Stoelting	51425
Dubbelzijdige scheermessen	Ted Pella, Inc	121-6
Nitrocellulose membranen	Millipore	AAWP02500	Type AAWP 0,8 mm porie
Borosilicaat glas pipetten	World Precision Instruments	TW120F-4	1,2 mm OD 0,95 mm ID
Ag/AgCl pellet	Warner	E206
MicroFil	World Precision Instruments	MF34G-5	34 ga. Vulnaald, 67 mm lang