Seriële Verrijking van spermatogonia stam-en progenitorcellen (SSC's) in cultuur voor het afleiden van lange termijn Adult Mouse SSC Lines

Samenvatting

Een eenvoudige methode voor het afleiden van en onderhouden van SSC en stamceltransplantatie lijnen van volwassen muizen wordt hier gepresenteerd. De werkwijze gebruikt voedingscellen afkomstig van de somatische cel compartiment van de volwassen muis testis. Deze techniek is voor het gemeenschappelijk muizenstammen, inclusief transgene, knock-out en knock-in muizen.

Samenvatting

SSC en progenitorcellen (SSC) van de testis zijn een klassiek voorbeeld van volwassen zoogdier stamcellen en behouden vruchtbaarheid bijna de levensduur van het dier. Hoewel de precieze mechanismen die zelfvernieuwing en differentiatie regeren in vivo zijn uitdagend om te studeren, zijn er verschillende systemen zijn eerder ontwikkeld voor muriene SSC's in vitro met behulp van een combinatie van gespecialiseerde cultuurmedia en feeder cellen ^{1 tot 3} propageren.

De meeste in vitro uitstapjes naar de biologie van SSCs zijn afgeleide cellijnen van pasgeborenen, mogelijk vanwege de moeilijkheid om volwassen cellijnen ^4. De testis verder te rijpen tot ~ 5 weken oud in de meeste muizenstammen. In de vroege postnatale periode dramatische veranderingen in de architectuur van de testis en de biologie van zowel somatische cellen en spermatogenese, met inbegrip van wijzigingen in expressieniveaus van tal stamcel-gerelateerdegenen. Daarom kan neonataal afgeleide SSC lijnen niet volledig herhalen de biologie van volwassen SSC's die blijven bestaan ​​na de volwassen testis heeft bereikt een steady state.

Verschillende factoren hebben gehinderd de productie van volwassen SSC lijnen historisch. Ten eerste kan de verhouding van functionele stamcellen afnemen in volwassenheid, hetzij door intrinsieke of extrinsieke factoren ^5,6. Zoals met andere volwassen stamcellen, was het moeilijk voldoende verrijking van SSCs totale volwassen zaadcellen zonder een combinatie van immunoselectie of sorteren strategieën ^7. Gewoonlijk toegepast omvatten het gebruik van cryptorchide muizen als bron van donor cellen door een hogere verhouding van stamcellen om andere celtypen ^8. Gebaseerd op de hypothese dat de verwijdering van somatische cellen van het oorspronkelijke kweek interacties met de stamcellen niche die essentieel zijn voor overleving SSC verstoort, we eerder ontwikkelde methoden voor het afleiden volwassen lines die geen immunoselectie of cryptorchide donoren, maar eerder in dienst seriële verrijking van SSC's in de cultuur, hierna te noemen SESC ^2,3.

De hieronder beschreven methode brengt een eenvoudige procedure voor het afleiden van volwassen SSC lijnen door dissociëren volwassen donor testes, gevolgd door platen van cellen op feeders bestaat uit een testiculaire stromale cellijn (JK1) ^3. Door middel van seriële passage, sterk hechtende, niet-vervuilende kiemcellen worden uitgeput uit de cultuur met bijkomende verrijking van SSC's. Culturen die op deze wijze een mengsel van spermatogonia in verschillende stadia van differentiatie, die bevatten SSCs, gebaseerd op lange termijn zelfvernieuwing vermogen. De kern van de SESC methode is dat het SSC's in staat stelt om de moeilijke overgang van zelf-vernieuwing in vivo te maken op de lange termijn zelfvernieuwing in vitro in een radicaal andere micro-omgeving, produceert lange termijn SSC lijnen, vrij van verontreinigendesomatische cellen, en op basis waarvan daaropvolgende experimentele manipulatie van SSC.

Protocol

1. Bereiding van voedingscellen

Merk op dat alle reagentia hieronder beschreven worden bereid in steriele wijze (zie tabellen 1 en 2). Dit protocol maakt gebruik van de JK1 cellijn (Cell Biolabs, Inc, catalogus # CBA-315) als feeders die een getransformeerde afgeleide van volwassen muis testiculaire somatische cellen en elders is ³ beschreven. Merk ook op dat alle dierlijke procedures moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en voorschriften.

1. JK1 cellen kunnen in cultuur worden gehouden en met succes gebruikt als voeders tot doorgang 39. Cultuur JK1 cellen in een 100 mm celkweekschaal (BD Falcon, catalogus # 353003) met 10 ml filter gesteriliseerd feeder groeimedium (DMEM aangevuld met 10% foetaal bovine serum [FBS], 2 mM L-glutamine en antibiotica). Wanneer de cultuur 95% confluentie bereikt, splitsen de cellen 1:06 -1:10 verhouding.
2. Verwijder medium van samenvloeiende JK1 feeder cel monolaag.
3. Eenmaal wassen met cellaag PBS zonder calcium en magnesium.
4. Voeg voorverwarmde trypsine / EDTA, 1x (0,05% trypsin/0.53 mM EDTA; Corning Cellgro, catalogus nr. 25-051-CI), en incuberen bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten.
5. Inactiveren trypsine met een gelijk volume van feeder groeimedium. Verzamel cellen en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen in feeder groeimedium.
6. Grondlaag multi-well platen celkweek door toevoegen van voldoende 0,4% gelatine oplossing te dekken de put en na 5 min bij kamertemperatuur verwijderen.
7. Plaat ~ 250 cellen per ^mm2 in gelatine beklede celkweekplaat (bijv. 48-well of 6-well formaat). Incubeer kweek bij 37 ° C gedurende 16 tot 24 uur.
8. Verwijder kweekmedium uit putten. WAARSCHUWING: celgroei inactiveren, voeg een verse oplossing van mitomycine-C bij 10 ug / ml verdund in DMEM aan elk putje (bijv. 200 ul / putje van een 48 well plaat). Mitomycine-C is giftig. Worden gehanteerd en afgevoerd met zorg. Incubeer bij37 ° C gedurende 4 uur.
9. Verwijderen mitomycine-C oplossing van cellen. 3 keer wassen met DMEM vóór plating stamcellen.
10. Verwijderen van DMEM voedingscellen putjes en voeg genoeg stamcellen medium (100 ul / putje van een 48 well plaat, zie Tabel 3) om uitdroging van de voedingsdraden te voorkomen tijdens passage. Voeg SSC's op dezelfde dag, zoals hieronder beschreven in de punten 3.1 en 3.4, met behulp van de aangegeven maten van putjes die feeders.

2. Dissociatie van de muis testis weefsel te Donor Germ cellen te verkrijgen

1. Oogst volwassen muis testes in steriele mode en tijdelijk de testikels op te slaan in een overdekte petrischaal (zonder vloeistof toegevoegd). De schotel moet onmiddellijk op ijs geplaatst om uitdroging te voorkomen en te onderhouden cellevensvatbaarheid.
2. Met behulp van steriele fijne tang en een boete schaar in een celkweek kap, maak een dwarse snede in de tunicaalbuginea zonder volledig doorsnijden van de testis (dat wil zeggen, gesneden ~ ½ - ¾ afstand thrdoorgedreven) en gebruik een tang om squeeze out testes in een hoek van de plaat; aflegstapel tunica en een aangrenzende weefsel. Houd plaat op ijs gedurende houden weefsel gekoeld, met behoud van de integriteit en het voorkomen van verdamping.
3. Snel gehakt buisjes met fijne lente schaar minstens 3 minuten per testis, terwijl plaat op ijs.
4. Verzamel de tubulus fragmenten in een 50 ml conische buis en wassen ~ 40 ml koud PBS / 1% bovine serum albumine.
5. Centrifugeer bij 60 xg gedurende 10 min om tubulus fragmenten scheiden van spermatozoa en vuil. Gooi supernatant.
6. In een 15 ml conische buis, resuspendeer de pellet in 3 ml per testis van voorverwarmde dissociatie buffer (DMEM, 0,05% trypsine, 0,03% collagenase type I, 80 U / ml DNAse I en 0,5% runderserumalbumine, zie Tabel 2 voor meer specifieke details van dissociatie buffer).
7. Horizontale positie de conische buis in een rek in een shaker ingesteld op 150 rpm bij 37 ° C gedurende 15 minuten een maximalegitation.
8. Spin down bij 60 xg gedurende 10 min te scheiden afzonderlijke cellen van gedissocieerde brokken.
9. Sla de pellet met brokken tot de volgende stap. Verzamel supernatant uit stap 2.8 en 3 ml DMEM/10% foetaal runderserum dissociatie buffer te neutraliseren. Plaats buis op ijs tijdelijk.
10. Herhaal stap 2,6 tot 2,7 met de opgeslagen pellet van stap 2,9 tot opnieuw verteren brokken die overblijven na stap 2.8.
11. Voeg een gelijk volume van DMEM/10% FBS dissociatie buffer te neutraliseren.
12. Recombineren schorsing vanaf stap 2,11 met opgeslagen celsuspensie vanaf stap 2.9. Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g.
13. Hersuspendeer pellet in stamcellen medium in een volume van 16 ml per paar testes (zie tabel 3).

3. Plating van testiculaire celsuspensie

1. Plaat 2 ml celsuspensie per putje in een 6-wells plaat met voedingscellen mitotisch geïnactiveerd met mitomycine-C en in een celkweek incubator bij 37 ° C in _5% CO2.
2. Na 48 uur, aspiraat medium, voeg 2 ml vers medium en terug te keren naar incubator.
3. Na 48 uur voeg 0,5 ml vers stamcellen medium aan elk putje en de incubator.
4. Na 48 uur later voeden cellen drie keer per week daarna als volgt tot grote discreet kolonies (> 50 cellen) lijken (binnen 7 tot 21 dagen). Voor de eerste en tweede voeden elke week (bijv. maandag en woensdag) te verwijderen ~ 50% van de middelgrote en terug 50% toe te voegen door het volume van vers medium. Voor derde voeding (bijv. vrijdag), zuigen alle middelgrote en te vervangen door 2 ml vers medium. Deze benadering is gebaseerd op de gedachte dat het vermijden van compleet medium veranderingen concentratieschommelingen van paracriene signalen die worden uitgescheiden in het kweekmedium ⁹ minimaliseert.

4. Colony Picking voor First Passage

1. Verwijderen medium uit putjes die kolonies worden gepasseerd door vers medium stamcellen.
2. Identificeer kolonies met een 10x objectief. Met de microscoop lichte de-gericht, zal SSC kolonies aan de rand van de put verschijnen als heldere homogene massa's, uit vele 11-12 urn diameter cellen waarin het moeilijk of onmogelijk om de individuele cel grenzen onderscheiden, omdat de cellen verschijnen samengesmolten (Figuur 1A). Niet-SSC kolonies lijken donkerder, meer gedetailleerde of minder homogeen, met waarneembare grenzen (Figuur 1A, inzet).
3. Met een 200 pi pipetpunt met pipetteman ingesteld op 50 ul eerst up medium uit de put en verdrijven de tip bevochtigen. Dan voorzichtig verschuiven de kolonie met de punt voor snel trekken 50 ul medium om de kolonie verdrijven door zuiging in de tip (Figuur 1B).
4. Verdrijf het medium dat de kolonie in een putje van een 48-wells plaat met geïnactiveerde feeder cellen met 100 pl stamcellen medium (Figuur 1C).
5. Herhaal stap4.3 en maximaal 8 kolonies met dezelfde goed zonder meer dan 500 ul per putje.
6. Herhaal de stappen 4,3 tot 4,5 om extra putten van de 48 wells-plaat te bereiden met doorgang een SSC kolonies.
7. Wells klaar te splitsen in 7-14 dagen of na grote massa tot 500 cellen ontstaan ​​(Figuur 1D).

5. Latere Uitbreiding en passage van de SSC's door Trituratie

1. Cellen bij passage men moet worden voortgekweekt op vers na feeders tot 14 dagen bij een split verhouding van 1:2 voor de eerste 3 passages en 1:04-01:06 (elke 7 dagen) daarna als volgt. Voorzichtig vermalen kolonies uit een semi-confluente well (bv. ~ 300.000 SSC / putje 6-well plaat) met een 1 ml pipet door wasmedium over de cellen. Kolonies zichtbaar los. Te veel kracht de vloeistofstroom zal ongewenste feeder cellen te loskomen.
2. Verzamel getritureerd cellen in een conische buis en gecentrifugeerd bij 300 g gedurende5 min. Opmerking: Een behandeling met trypsine stap kan hier veilig worden toegevoegd indien gewenst door de onderzoeker.
3. Zuig supernatant en in zoet stamcel medium opnieuw te suspenderen door het grondig en neer te pipetteren om kolonies te verstoren.
4. Plaat SSC's op vers bereid feeder cellen geïnactiveerd met mitomycine-C, zoals beschreven in hoofdstuk 1.
5. Voeden cellen drie keer per week als volgt. Voor de eerste en tweede voeding (bijv. maandag en woensdag) voeg 50% van het volume van vers medium. Voor derde voeding (bijv. vrijdag), zuigen alle middelgrote en te vervangen door 2 ml vers medium. Platen zullen confluent in 7-10 dagen. Culturen moet bestaan ​​uit> 98% kiemcellen (di <1% contaminerende somatische cellen) na 5-7 passages op basis van immunokleuring (bijv. met gebruik van muriene kiemcel marker GCNA) van geslachtscellen onderscheiden van somatische cellen ^10. Opmerking: Deze methoden zijn ontwikkeld in overeenstemming met de voorschriften en vereisten die door de instelling te stellenAl Animal Care en gebruik Comite op Weill Cornell Medical College.

Resultaten

Het uiterlijk van passage nul wild type, een volwassene SSC kolonies na 7 dagen figuur 1. Driedimensionale kolonies bestaan ​​uit een laag van platte cellen aan de stroomvoorziening of ondergeschikte extracellulaire matrix afgezet door de feeders met meerdere lagen SSCs groeien geplaatst. Terwijl gezonde SSCs zijn licht en uniform refractiele 11-12 urn diameter, de celranden zijn moeilijk te onderscheiden en de grootte van de kolonies kunnen zeer variabel, zowel binnen de put en tussen wells bereid uit ...

Discussie

Deze methode voor het afleiden van volwassen SSC's met volwassen testis afgeleide feeder-cellen is robuust en is erin geslaagd om als gemeenschappelijke genetische achtergronden (bv. FVB, C57Bl6 en gemengde 129SV/C57Bl/6) en verschillende mutante stammen werden gebruikt ^2,3,7,14. In feite is de micro die door het cultuurstelsel voldoende is om een deel van de genetische belemmeringen handhaven volwassen SSC in vivo (bijvoorbeeld bij plzf ^{- / -} dieren) overwinnen ^7. ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van de Reagens / Materiaal	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
DMEM	Corning	10 tot 013	Verdunningsmiddel voor dissociatie buffer
Trypsine / EDTA	Mediatech	25-051-CI
Stamcellen basismedium (StemPro-34)	Life Technologies	10639-011	Vereist suppletie als per Shinohara et al.. (2003) *
Stamcel medium supplementen	divers	zie tabel 3	Vereist suppletie als per Shinohara et al.. (2003) *
JK1 cellen	Cell Biolabs, Inc	CBA-315	Kan vervangen met volwassen testiculaire stromale cellen per Seandel et al.. (2007)
mitomycine-C (LET OP)	Sigma-Aldrich	M4287	Vergiftig; Handle with care.
Gelatine	Sigma-Aldrich	G1890	0,4% oplossing in water
EVOS xl digitale omgekeerde microscoop	Geavanceerde Microscopie Groep	-
			Tabel 1. Specifieke reagentia en apparatuur. * Zie tabel 3
DMEM	Corning	10 tot 013	Verdunningsmiddel voor dissociatie buffer
trypsine (1:250)	Life Technologies	27250-018	Dissociatie buffer: Final 0,05% gew / vol
collagenase type I, 235 U / ml	Worthington	CLS1 235	Dissociatie buffer: Final 0,03% gew / vol
DNAse I	Sigma-Aldrich	DN25	Dissociatie buffer: Final 80 U / ml
runderserumalbumine	ICP Bio	ABRE-100g	Dissociatie buffer: Final 0,5% gew / vol
			Tabel 2. Dissociatie buffer
StemPro-34 SFM	Life Technologies	10639-011
StemPro-34 voedingssupplement	Life Technologies	10639-011
Extra toeslagen **
Niet-essentiële aminozuren	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM vitamine oplossing	Life Technologies	11120-052	1X
L-glutamine	Mediatech	25-005	2 mM
runderserumalbumine	ICP Bio	ABRE	0,50%
Antibiotica-Antimycoticum Solution	Mediatech	30-004-CI	1X
D (+) glucose	Sigma-Aldrich	G8769	6 mg / ml
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	30 ng / ml
progesteron	Calbiochem	5341	60 ng / ml
foetaal runderserum	veranderlijk	n / a	1%
runderen holo-transferrine	Sigma-Aldrich	T1283	100 ug / ml
insuline	Tweeling Bio-Products	700-112P	25 ug / ml
menselijke GDNF	Life Technologieën	PHC7041	10 ng / ml
menselijke bFGF	Life Technologies	PHG0023	10 ng / ml
muis EGF	Life Technologies	PHG0313	20 ng / ml
putrescine	Onderzoek Organics	0778P	60 uM
natriumseleniet	Sigma-Aldrich	S5261	30 nM
pyruvinezuur	Alfa Aesar	A13875	30 ug / ml
DL-melkzuur	JT Baker	0196-04	1 ug / ml
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023	50 uM
ascorbinezuur	Sigma-Aldrich	A4544	100 uM
D-biotine	Sigma-Aldrich	B4639	10 ug / ml
			Tabel 3. Stamcel medium
			* Opmerking: Voeg hieronder supplementen voordat u medium. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C. Het medium is stabiel gedurende ten minste 2 weken.
			Wij hebben gebruik ** verschillende fabrikanten, formuleringen en / of nummers in deze reagentia zonder enige duidelijke nadelige effecten. In het algemeen moet celkweek gehalte reagentia worden gebruikt.