Lokale toepassing van geneesmiddelen aan nicotine acetylcholine receptor functie in de hersenen van muizen Slices Studie

Samenvatting

In dit artikel beschrijven we een bruikbare methode om ligand-gated ionkanalen functie te bestuderen in neuronen van acuut geïsoleerd hersenen plakjes. Deze methode omvat het gebruik van een geneesmiddel gevulde micropipet voor lokale toepassing van geneesmiddelen voor neuronen opgenomen met standaard patch-clamp technieken.

Samenvatting

Het gebruik van tabak leidt tot tal van gezondheidsproblemen, zoals kanker, hart-en vaatziekten, longemfyseem, en beroerte. Verslaving aan het roken van sigaretten is een wijdverspreide neuropsychiatrische aandoening die voortkomt uit de biofysische en cellulaire acties van nicotine op nicotine acetylcholine receptoren (nAChRs) in het hele centrale zenuwstelsel. Inzicht in de verschillende nAChR subtypes die bestaan ​​in hersengebieden die relevant zijn voor nicotine verslaving is een belangrijke prioriteit.

Experimenten die elektrofysiologie technieken zoals whole-cell patch clamp of twee-elektrode spanningsklem opnames in dienst zijn nuttig voor farmacologische karakterisering van nAChRs van belang. Cellen die nAChRs, zoals zoogdieren weefselkweek cellen of Xenopus laevis oöcyten, zijn fysiek geïsoleerd en zijn dus gemakkelijk bestudeerd met behulp van de instrumenten van de moderne farmacologie. Er is veel vooruitgang gemaakt met behulp van deze technieken, in het bijzonder wanneer het doel-receptor werd al bekend eennd ectopische expressie werd gemakkelijk bereikt. Vaak echter moet nAChRs in hun oorspronkelijke omgeving studeren: in neuronen in hersencoupes acuut geoogst laboratorium muizen of ratten. Bijvoorbeeld, muizen die "overgevoelig" nAChR subunits zoals α4 L9'A muizen ¹ en α6 L9 MICE ^2, zorgen voor eenduidige identificatie van neuronen basis van hun functionele expressie van een specifieke nAChR subeenheid. Hoewel whole-cell patch clamp opnamen van neuronen in de hersenen plakjes wordt routinematig gedaan door de deskundige elektrofysioloog, is het een uitdaging om lokaal toe te passen geneesmiddelen zoals acetylcholine of nicotine om de opgenomen cel binnen een brein slice. Verdunning van drugs in de superfusate (bad toepassing) is niet snel omkeerbaar, en U-buis systemen zijn niet gemakkelijk worden aangepast om te werken met de hersenen plakjes.

In dit artikel beschrijven we een methode voor het snel aanbrengen nAChR-activerende drugs aan neuronen die in volwassen mOuse hersenen plakjes. Standaard whole-cell opnamen zijn gemaakt van neuronen in plakjes, en een tweede micropipet gevuld met een medicijn plaats wordt gemanoeuvreerd positie nabij de opgenomen cel. Een injectie van perslucht of stikstof inert in de drug gevulde pipet veroorzaakt een kleine hoeveelheid geneesmiddel oplossing wordt uitgestoten uit de pipet op de gemaakte cel. Met behulp van deze methode, nAChR-gemedieerde stromen kunnen worden opgelost op de milliseconde nauwkeurig. Drug Application tijden kunnen gemakkelijk worden gevarieerd, en het medicijn gevulde pipet kan worden teruggetrokken en vervangen door een nieuwe pipet, waardoor concentratie-reactiekrommen te creëren voor een neuron. Hoewel beschreven in de context van nAChR neurobiologie zou deze techniek nuttig voor het bestuderen van vele soorten ligand-gated ionkanalen of receptoren in neuronen van hersencoupes.

Protocol

1. Bereiding van oplossingen voor Brain Slice Voorbereiding en Elektrofysiologie

1. Oplossingen voor bereiding van hersencoupes werden eerder beschreven ^{3, 4.} Voorbereiden N-methyl-D glucamine (NMDG) gebaseerde snijden en herstel oplossing van de volgende samenstelling (in mM): 93 n-methyl D-glucamine, 2,5 KCl, 1,2 NaH _{2PO 4,} 30 NaHCO _3, 20 HEPES, 25 glucose, 5 Na ⁺ ascorbaat, 2 thioureum, 3 Na ⁺ pyruvaat, 10 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 0,5 _CaCl2 • 2H ₂ O. Aan te passen aan 300 tot 310 mOsm met NMDG. Breng de pH op 7,3-7,4 met 10 N HCl.
   1. Los MgSO

Resultaten

In onze experimenten hebben we routinematig opnemen van dopamine (DA)-producerende neuronen van de ventrale tegmentale gebied (VTA) en de substantia nigra pars compacta (SNC). In voltage-clamp mode zal de druk toepassing van acetylcholine nicotine of deze cellen typisch resulteren in een snel, binnen kation stroom die piek bereikt binnen 100-200 msec (Figuur 1A-B). Verval van de stroom grotendeels bepaald door diffusie van het geneesmiddel uit de plaats van werking en of enzymen in het segment aanwezig .......

Discussie

De methode die in dit artikel is in grote lijnen bruikbaar voor het bestuderen van ligand-gated ionkanalen functie in de hersenen slice preparaat. Er zijn echter een aantal factoren die een belangrijke invloed op de kwaliteit en reproduceerbaarheid van experimentele gegevens die voortkomen uit het gebruik van deze methode. Bijvoorbeeld opgeroepen stromen erg gevoelig voor de diameter van de punt van het geneesmiddel gevulde pipet. Kleine tips zal leiden tot moeite met het uitwerpen van de drug oplossing, en grote tips m.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens Bedrijf Catalogusnummer
N-Methyl D-glucamine	Sigma	M2004
KCl	Sigma	P3911
NaH 2 PO 4	Sigma	S9638
NaHCO 3	Sigma	S6014
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G5767
Na + Ascorbaat	Sigma	A4034
Thioureum	Sigma	T8656
Na + Pyruvaat	Sigma	P2256
MgSO 4 • 7H 2 O	Sigma	230391
CaCl 2 • 2H 2 0	Sigma	223506
NaCl	Sigma	S9625
Na + Pentobarbital	Vortech Pharmaceuticals	76351315
Kalium gluconaat	Sigma	G4500
EGTA	Sigma	E3889
Mg-ATP	Sigma	A9187
GTP	Sigma	G8877
DSK-Zero 1 Vibrating snijmachine	Ted Pella, Inc
P-97 Flaming / Brown micropipet trekker	Sutter
RC-27 Opnemen kamer	Warner
TC-344b Perfusie verwarming controller	Warner	640101
SH-27B Solution verwarming	Warner	640102
Nikon FN-1	Nikon
C-7500 CCD-Video-camera	Hamamatsu
Picospritzer III	Algemeen Valve Co
MP-285 micromanipulator	Sutter
PA-100 Piëzo-elektrische vertaler	Piezosystem jena, Inc
12V40 piëzo-versterker	Piezosystem jena, Inc
Axopatch 200B	Molecular Devices Corp
Digidata 1440A	Molecular Devices Corp