Lokale toepassing van geneesmiddelen aan nicotine acetylcholine receptor functie in de hersenen van muizen Slices Studie

Staci E. Engle; Hilary J. Broderick; Ryan M. Drenan

doi:10.3791/50034

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Lokale toepassing van geneesmiddelen aan nicotine acetylcholine receptor functie in de hersenen van muizen Slices Studie

19.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50034

⸱

29 oktober 2012

Staci E. Engle¹ , Hilary J. Broderick¹ , Ryan M. Drenan¹

¹Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University

In dit artikel

Samenvatting

In dit artikel beschrijven we een bruikbare methode om ligand-gated ionkanalen functie te bestuderen in neuronen van acuut geïsoleerd hersenen plakjes. Deze methode omvat het gebruik van een geneesmiddel gevulde micropipet voor lokale toepassing van geneesmiddelen voor neuronen opgenomen met standaard patch-clamp technieken.

Samenvatting

Het gebruik van tabak leidt tot tal van gezondheidsproblemen, zoals kanker, hart-en vaatziekten, longemfyseem, en beroerte. Verslaving aan het roken van sigaretten is een wijdverspreide neuropsychiatrische aandoening die voortkomt uit de biofysische en cellulaire acties van nicotine op nicotine acetylcholine receptoren (nAChRs) in het hele centrale zenuwstelsel. Inzicht in de verschillende nAChR subtypes die bestaan in hersengebieden die relevant zijn voor nicotine verslaving is een belangrijke prioriteit.

Experimenten die elektrofysiologie technieken zoals whole-cell patch clamp of twee-elektrode spanningsklem opnames in dienst zijn nuttig voor farmacologische karakterisering van nAChRs van belang. Cellen die nAChRs, zoals zoogdieren weefselkweek cellen of Xenopus laevis oöcyten, zijn fysiek geïsoleerd en zijn dus gemakkelijk bestudeerd met behulp van de instrumenten van de moderne farmacologie. Er is veel vooruitgang gemaakt met behulp van deze technieken, in het bijzonder wanneer het doel-receptor werd al bekend eennd ectopische expressie werd gemakkelijk bereikt. Vaak echter moet nAChRs in hun oorspronkelijke omgeving studeren: in neuronen in hersencoupes acuut geoogst laboratorium muizen of ratten. Bijvoorbeeld, muizen die "overgevoelig" nAChR subunits zoals α4 L9'A muizen ¹ en α6 L9 MICE ^2, zorgen voor eenduidige identificatie van neuronen basis van hun functionele expressie van een specifieke nAChR subeenheid. Hoewel whole-cell patch clamp opnamen van neuronen in de hersenen plakjes wordt routinematig gedaan door de deskundige elektrofysioloog, is het een uitdaging om lokaal toe te passen geneesmiddelen zoals acetylcholine of nicotine om de opgenomen cel binnen een brein slice. Verdunning van drugs in de superfusate (bad toepassing) is niet snel omkeerbaar, en U-buis systemen zijn niet gemakkelijk worden aangepast om te werken met de hersenen plakjes.

In dit artikel beschrijven we een methode voor het snel aanbrengen nAChR-activerende drugs aan neuronen die in volwassen mOuse hersenen plakjes. Standaard whole-cell opnamen zijn gemaakt van neuronen in plakjes, en een tweede micropipet gevuld met een medicijn plaats wordt gemanoeuvreerd positie nabij de opgenomen cel. Een injectie van perslucht of stikstof inert in de drug gevulde pipet veroorzaakt een kleine hoeveelheid geneesmiddel oplossing wordt uitgestoten uit de pipet op de gemaakte cel. Met behulp van deze methode, nAChR-gemedieerde stromen kunnen worden opgelost op de milliseconde nauwkeurig. Drug Application tijden kunnen gemakkelijk worden gevarieerd, en het medicijn gevulde pipet kan worden teruggetrokken en vervangen door een nieuwe pipet, waardoor concentratie-reactiekrommen te creëren voor een neuron. Hoewel beschreven in de context van nAChR neurobiologie zou deze techniek nuttig voor het bestuderen van vele soorten ligand-gated ionkanalen of receptoren in neuronen van hersencoupes.

Protocol

1. Bereiding van oplossingen voor Brain Slice Voorbereiding en Elektrofysiologie

Oplossingen voor bereiding van hersencoupes werden eerder beschreven ^{3, 4.} Voorbereiden N-methyl-D glucamine (NMDG) gebaseerde snijden en herstel oplossing van de volgende samenstelling (in mM): 93 n-methyl D-glucamine, 2,5 KCl, 1,2 NaH _{2PO 4,} 30 NaHCO _3, 20 HEPES, 25 glucose, 5 Na ⁺ ascorbaat, 2 thioureum, 3 Na ⁺ pyruvaat, 10 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 0,5 _CaCl2 • 2H ₂ O. Aan te passen aan 300 tot 310 mOsm met NMDG. Breng de pH op 7,3-7,4 met 10 N HCl.
1. Los MgSO ₄ • 7H ₂ O en CaCl ₂ • 2H ₂ O in Millipore water tot 2 M voorraadoplossingen van elk merk.
2. Afgewogen andere componenten in de aangegeven volgorde en aan een maatkolf gedeeltelijk gevuld met Millipore water onder roeren op te lossen. Zodra alles is toegevoegd, vulmaatkolf met Millipore water.
3. Meet de pH en pas met 10 N HCl.
4. Meet de osmolariteit en stel met NMDG indien nodig.
Bereid HEPES dat kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) met de volgende samenstelling (in mM): 92 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH _{2PO 4,} 30 NaHCO _3, 20 HEPES, 25 glucose, 5 Na ⁺ ascorbaat, 2 thioureum, 3 Na ⁺ pyruvaat, 2 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 2 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Aan te passen aan 300 tot 310 mOsm met sucrose. Breng de pH op 7,3-7,4 met 1 N HCl of NaOH.
1. Afgewogen componenten in de aangegeven volgorde en aan een maatkolf gedeeltelijk gevuld met Millipore water onder roeren op te lossen. Zodra alles is toegevoegd, vul maatkolf met Millipore water.
2. Meet de pH en stel met NaOH of HCl, indien nodig.
3. Meet de osmolariteit en stel met sucrose indien nodig.
Standaardformulieren aCSF opname oplossing van de volgende samenstelling (in mM): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH _{2PO 4,} 24 _NaHCO3, 12,5 glucose, 2 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 2 _CaCl2 • 2H ₂ O. Aan te passen aan 300 tot 310 mOsm met sucrose. Breng de pH op 7,3-7,4 met 1 N HCl of NaOH.

2. Voorbereiding van Acute Brain Slices

Brain slicen en terugwinning uitgevoerd zoals eerder beschreven ^{3, 4.} Bubble twee kristallen schalen gevuld met NMDG recovery-oplossing met 95% zuurstof / 5% CO _2-gas (carbogen), een schotel op het ijs, de andere op 33 ° C.
Bubble een kristal schaal gevuld met HEPES houden aCSF met carbogen bij kamertemperatuur.
Verdoven volwassen muizen (2 tot 12 maanden) met Na ⁺ pentobarbital (200 mg / kg, ip). Ga verder met procedure bij het dier heeft geen reactie op een teen-snuifje.
Indien nodig, knip een staart weefselmonster voor later genotypIng van het dier.
Open de borstholte, bloot te leggen het hart, en klem de aorta descendens. Verscheuren het rechter atrium.
Transcardiaal perfuseren dier met 5-10 ml van 0-4 ° C NMDG-recovery oplossing.
Onthoofden dier, de hersenen verwijderd en plaats het in 4 ° C NMDG-recovery oplossing gedurende 1 min.
Op een ijs-gekoeld metalen plaat, trim de hersenen in de gewenste richting (coronaal, parasagittal, horizontaal, enz.) om het gebied in de omgeving zijn.
Bevestig de hersenen blok met superlijm aan de droge fase oppervlak van een trillende snijmachine (DSK-Zero 1, Dosaka), dompel de hersenen blok in 4 ° C NMDG-recovery-oplossing, en continu zeepbel van de oplossing met carbogen.
Snijd plakjes van de hersenen gebied van belang. Plakdikte is 200-400 urn, afhankelijk van de specifieke hersengebied plaats, dierlijke leeftijd en experiment uit te voeren.
Onmiddellijk na het snijden, incubeer gewenste plakjes in carbogenated, 33 ° C NMDG-herstel Solutiop precies 12 minuten, vervolgens over te dragen aan carbogenated, kamertemperatuur HEPES houdt oplossing voor een eerste periode van 60 minuten. Na deze 60 min incubatie, kunnen segmenten gebruikt worden voor opname. Plakjes worden gehandhaafd HEPES oplossing die gedurende de dag tot ze worden gebruikt voor opname.

3. Patch Clamp Opnemen vanaf Neuronen in Brain Slices

Trek een standaard patch micropipet met een programmeerbare Flaming-Brown trekker (Sutter P-97 of gelijkwaardig verticale trekker). Pipetten die optimaal zijn voor giga-ohm seal vorming gewoonlijk een weerstand van 4-6 MQ
Overdracht een schijfje naar de opname kamer (RC-27L; Warner Instruments) op het podium van een rechtopstaande microscoop (Nikon FN-1). Continu superfuse (1,5 - 2,0 ml / min) het segment met carbogenated, standaardoptekenmodus aCSF verwarmd en op 32 ° C. Als alternatief kunnen segmenten worden op kamertemperatuur gehouden.
Zoek en het centrum van de hersenen gebied van belang met behulp vaneen 10X lucht doelstelling (Nikon Plan Fluor 10X, NA 0,3; WD: 16 mm).
Visualiseer individuele neuronen met behulp van een 40x nabij-infrarood (IR) water immersie objectief (Nikon APO 40XW; NA: 0,80; WD: 3,5 mm) aangesloten op de IR-differentieel interferentie contrast (DIC) optiek en een high-speed nabij-infrarood Charged Coupled Device (CCD) videocamera (Hamamatsu C-7500). Onder IR-DIC observatie, gezonde neuronen vertonen een gladde, lichtgrijze plasmamembraan.
Vul een micropipet met een geschikte intracellulaire opnameoplossing. Voor de meeste toepassingen gebruiken we de volgende oplossing (in mM): 135 kalium gluconaat, 5 EGTA, 0,5 _CaCl2, 2 _MgCl2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, GTP en 0,1 (pH ingesteld op 7,25 met Tris base, osmolariteit aangepast tot 290 mOsm met sucrose). Opzetten van een whole-cell opname van een gevisualiseerd neuron.

4. Lokale toepassing van geneesmiddelen te Neuronen in Slices

Trek een standaard patch clamp micropipet zoals hierboven beschreven. Gebruikeen pipet trekker zoals een Sutter P-97 dat twee identieke "zuster" tips uit hetzelfde stuk glas produceert is voordelig als multiple drug oplossingen worden gebruikt op dezelfde cel. Tipformaten dat een weerstand van ~ 5 MQ zouden hebben indien zij werden gevuld met het intracellulaire oplossing hierboven beschreven optimaal.
Backfill de micropipet met een oplossing van verdund geneesmiddel in carbogenated, standaardoptekenmodus aCSF. Naar beneden Richt de tip, en flick de drug gevulde micropipet om eventuele luchtbellen gevangen in de kolom van de oplossing te verwijderen.
Monteer het geneesmiddel gevulde micropipet in een pipethouder verbonden met een buis op een geschikte spanning uitwerpsysteem, zoals een Picospritzer III (General Valve Co.) De pipet houder wordt gemonteerd op een micromanipulator met dezelfde resolutie als manipulators gebruikt voor patch clamp-opname (bijvoorbeeld Sutter MP-285). Bovendien moet de manipulator mogelijk een diagonale beweging in en uit het segment. Manhandmatig uitwerpen druk 3 tot 4 keer in de micropipet om te bouwen voldoende druk achter de kolom van vloeistof.
Met behulp van de micromanipulator controles, laat het medicijn pipet in de plak, terwijl het visualiseren van de tip onder IR-DIC optiek. Idealiter zou een visueel herkennen en midden een neuron worden geregistreerd uit, gevolgd door plaatsing van het geneesmiddel pipet bij de cel voorafgaand aan het verlagen van de opname micropipet in de plak. Positioneren van de drug pipet kan beweging van weefsel in de nabijheid van de opgenomen cel die de opname kunnen verstoren als het geneesmiddel pipet wordt gebracht nadat een gigaohm afdichting.
IR met video, plaats het geneesmiddel micropipet op het bovenoppervlak van het weefsel slice. Voeren en een druk uitwerpen monitor 1) nabij de tip voor beweging van vuil over het uitwerpen, en 2) de micropipet tip op tekenen de punt verstopt of geblokkeerd. Als de tip verstopt is / verstopt, trek de pipette en vervang deze door een nieuwe.
Diagonaal benaderen opgenomen cel van de top van het segment zodanig dat wanneer de laatste plaats, de punt van het geneesmiddel gevulde pipet 1) in hetzelfde brandpuntvlak (of iets onder) de geregistreerde cel en de punt van de registratie-elektrode en 2) 10 tot 40 urn van de cel opgenomen. Als de drug gevulde pipet boven de cel opgenomen, kan de kracht van de druk uitwerpen verstoren gigaohm afdichting.
Noteer de gewenste cellulaire respons terwijl u de cel in spanning klem modus of stroomtang modus. We routinematig vastleggen acetylcholine en / of nicotine-opgewekt cellulaire stromen terwijl neuronen in spanningsklem modus. Hoewel druk uitwerpen kunnen handmatig worden geactiveerd wanneer een Picospritzer III, meer reproduceerbare resultaten verdient het aanbeveling de druk activeren uitwerpen met het meetsysteem (Axon Digidata 1440 en pClamp 10.3) met een digitale TTL pulse.

5. Controllingde Drug gevulde Micropipet met een piëzo-elektrische Vertaler

Indien mogelijk dient het geneesmiddel gevulde pipethouder een eendimensionale piëzo vertaler (bijv. Piezojena PA-100 of Burleigh PZM-150) die in staat is het aanvaarden van een analoge ingangsspanning (weer van het acquisitiesysteem), die dan gemonteerd op de hoge-precisie micromanipulator (Sutter MP-285). Een piëzo-elektrisch vertaler is nuttig omdat de beweging van het geneesmiddel gevulde pipet in en uit het segment, zoals de timing en de snelheid van binnenkomst / uitgang, gemakkelijker worden gecontroleerd en gereproduceerd van experiment tot experiment. Bij het bestuderen nAChRs, de effecten van nicotine ongevoelig lekkage van het geneesmiddel gevulde pipet, moeten zij ooit voorkomen, worden geminimaliseerd wanneer de pipet wordt alleen verplaatst nabij de cel met een piëzo vertaler moment van uitwerpen druk.
Met behulp van de handmatig bestuurde potentiometer op de piëzo-elektrische spanning regelversterker, kiest u het voltagezijn maximale waarde.
Met de micromanipulator Plaats de drug gevulde pipet in het segment waar de pipet wordt de inhoud werpen op de gemaakte cel en trekken de pipet door handmatig reduceren van de spanning op nul piëzo spanning regelversterker.
Met een analoog uitgangssignaal van de opname acquisitiesysteem Verplaats de drug gevulde pipet in de plak gedurende 250 msec vanaf 300 msec voordat de druk uitstoten TTL pulse optreedt. Trek de pipet gedurende 250 msec, beginnend 50 msec na de TTL signaal eindigt.