Super-resolution Imaging van de bacteriële Division Machinery

Samenvatting

We beschrijven een super-resolutie beeldvorming methode om de structurele organisatie van de bacteriële FtsZ-ring, een essentieel inrichting voor celdeling sonde. Deze methode is gebaseerd op kwantitatieve analyses van fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) beelden en kan worden toegepast op andere bacteriële cytoskeleteiwitten.

Samenvatting

Bacteriële celdeling vereist de gecoördineerde verzameling van meer dan tien essentiële eiwitten op midcell ^1,2. Centraal in dit proces is de vorming van een ringvormige suprastructuur (Z-ring) van de FtsZ eiwit op perceelsgrenzen ^3,4. De Z-ring uit meerdere enkelstrengs FtsZ protofilamenten en begrijpen van de opstelling van de protofilamenten in de Z-ring inzicht in het mechanisme van Z-ringarmatuur en zijn functie als krachtgenerator ^5,6. Deze informatie is moeilijk te realiseren vanwege huidige beperkingen in conventionele fluorescentie microscopie en elektronenmicroscopie. Conventionele fluorescentiemicroscopie staat is een hoge resolutie van de Z-ring door de diffractielimiet van licht (~ 200 nm) te verschaffen. Electron cryotomographic beeldvorming heeft gedetecteerd verspreid FtsZ protofilamenten in kleine C. crescentus cellen ^7, maar is moeilijk toepasbaar op grotere cellen zoalsE. coli of B. subtilis. Hier de toepassing van een super-resolutie fluorescentie microscopie methode beschrijven, fotogeactiveerde Localization Microscopy (PALM) kwantitatief kenmerken de structurele organisatie van de E. coli Z-ring ^8.

PALM beeldvorming biedt zowel een hoge ruimtelijke resolutie (~ 35 nm) en specifieke etiketteringsvoorschriften om eenduidige identificatie van doeleiwitten mogelijk te maken. We gelabeld FtsZ de fotoactiveerbare fluorescerend eiwit mEos2, die van groene fluorescentie (excitatie = 488 nm) schakelt rode fluorescentie (excitatie = 561 nm) bij activering bij 405 nm ^9. Tijdens een PALM experiment, worden enkele FtsZ-mEos2 moleculen stochastisch geactiveerd en de bijbehorende zwaartepunt posities van de individuele moleculen worden bepaald met <20 nm precisie. Een super-resolutie afbeelding van de Z-ring wordt vervolgens gereconstrueerd door superpositie van het zwaartepunt posities van alle gedetecteerde FtsZ-mEos2 moleculen. <p class = "jove_content"> Met deze methode is dat de Z-ring een vaste breedte van ~ 100 nm heeft en bestaat uit een losse bundel FtsZ protofilamenten die met elkaar overlappen in drie dimensies. Deze gegevens fungeren als aanknopingspunten voor verder onderzoek van de celcyclus afhankelijke veranderingen van de Z-ring ¹⁰ en kan worden toegepast op andere eiwitten van belang.

Protocol

1. Monstervoorbereiding

1. Inoculeren LB media met een enkele kolonie van stam JB281 [BW25113 / pJB042 (P _Lac: FtsZ-mEos2)]. Groeien overnacht in een shaker bij 37 ° C.
2. Verdun de kweek 1:1.000 in M9 minimaal medium ⁺ [M9 zouten, 0,4% glucose, 2 mM _MgSO4, 0,1 mM _CaCl2, MEM aminozuren en vitaminen] en groeien tot mid-log fase _(OD600 = 0.2 tot +0,3) in aanwezigheid van chlooramfenicol (150 ug / ml) bij kamertemperatuur (RT).
3. Laten cultuur met 20 uM IPTG gedurende 2 uur (zie opmerking # 1).
4. Korrelkweek in microcentrifuge (8.000 rpm, 1 min) en resuspendeer in een gelijk volume M9 ^+; repeat. Na de tweede resuspensie verder groei bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
5. Fix geïnduceerde cultuur met 4% paraformaldehyde in PBS (pH = 7,4) bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten. Korrelkweek en resuspendeer in een gelijk volume PBS; repeat. Als beeldvorming levende cellen, sla fixatie, pellet cultuur, en resuspendeer met een gelijk volumevan M9 ^- [M9 zouten, 0,4% glucose, 2 mM _MgSO4, 0,1 mM _CaCl2, MEM Amino Acids]; herhalen.
6. Verdun gouden kralen 1:10 met geresuspendeerde cultuur. Breng monster aan geprepareerde beeldvorming kamer (zie stap 2.4).

[1] Opmerking: De bovenstaande inductie-protocol (stappen 1.1 tot 1.3) is geoptimaliseerd voor de expressie systeem van stam JB281. Gedetailleerde inductie voorwaarden kunnen verschillen voor andere expressiesystemen of eiwitten van belang.

2. Vergadering van de Imaging Kamer

1. Een 3% (w / v) agarose oplossing M9 ^-. Smelt agarose bij 70 ° C in een bench-top warmte blok voor 40min. Store gesmolten agarose bij 50 ° C gedurende 5 uur.
2. Een schone microaqueduct dia in de bovenste helft van de beeldkamer met de elektroden naar beneden. Lijn de onderste pakking op de dia microaqueduct teneinde de perfusie kanalen omvatten.
3. Toepassing ~ 50 pi van het gesmolten agarose aan het midden van de ruitglijbaan. Onmiddellijk boven de agarosegel druppeltje met een schone, droge dekglaasje aan. Laat de gel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten stollen.
   1. Om coverslips reinigen: regelen dekglaasjes in een keramische houder en ultrasone trillingen gedurende 20 min in roterende baden aceton, ethanol en 1M KOH in glazen potten. Herhalingscyclus drie keer voor een totaal van 9 sonications, gevolgd door een sonicatie in dH ₂ O. Bewaar de gereinigde dekglaasjes in verse dH ₂ O. Voor gebruik föhnen dekglaasjes met gefilterde lucht.
4. Verwijder voorzichtig het dekglaasje en laat gel pad op de microaqueduct dia. Voeg onmiddellijk 1 ul celkweek monster (zie stap 1.6) naar de top van het gelkussen. Wacht tot 2 minuten, waardoor oplossing worden geabsorbeerd door het gelkussen. Top gel pad met een nieuwe, schone, droge dekglaasje aan. Monteer het geheel beeldkamer volgens instructies van de fabrikant.

3. Image Acquisition

1. Zet de microscoop, camera en lasers. Open Metamorph zachtesoftware (Molecular Devices).
2. Passende excitatie / emissie filters in de beeldvormende baan volgen (figuur 1).
3. Dienovereenkomstig instellen laser bevoegdheden en overname-instellingen.
   1. 488-nm laser = 15 mW (zie opmerking # 2)
   2. 561-nm laser = 75 mW
   3. 405-nm laser = 2 mW ± grijsfilter (Zie noot # 3)
4. Vergrendel beeldvorming kamer in het stadium via de complementaire fase adapter.
5. Een passende beeldvorming regio (100x100 pixel) die homogeen wordt verlicht door alle drie lasers.
6. Identificeer een monster gebied dat zowel cellen en de vaste markers (goud kralen) in de nabijheid, maar niet overlappen bevat.
7. Richten op het oppervlak van cellen het dichtst bij het dekglaasje. Een aan te schaffen helderveld beeld met 50 ms integratietijd en de focus 0,5 micrometer in het monster (figuur 3Ai).
8. Acquire ensemble groene fluorescentie beeld met excitatie van het 488-n m laser met behulp van een 50 ms integratietijd (Figuur 3Aii).
9. Acquire streaming video in rode kanaal met continue verlichting van 405-nm en 561-nm lasers. Voor vaste cellen, wordt een 50 ms frame rate gebruikt voor een totaal van 20.000 frames (~ 17 min in totaal) met de 405-nm laser vermogen opgevoerd met ~ 10% per 1.000 frames (zie noot # 4). Voor levende cellen wordt een 10 ms frame rate voor een totaal van 3000 frames (~ 30 s totaal) bij een constante 405-nm laservermogen.
10. Verplaats de focus naar het ondervlak van de cellen en verkrijgen een helderveld beeld als in stap 3.7.

[2] Opmerking: de geïntegreerde intensiteit van de groene fluorescentie van een cel is recht evenredig met het totale aantal FtsZ-mEos2 moleculen die in de cel. De 488-nm excitatie vermogen en ensemble fluorescentie verkrijging instellingen moeten worden constant gehouden voor alle cellen zodat de relatieve FtsZ-mEos2 expressieniveaus in verschillende cellen kunnen worden vergeleken.

NHOUD "> [3] Opmerking:. gefixeerde cellen worden afgebeeld met de neutrale densiteit (ND) filter (figuur 1, optische component # 5) in plaats om een langzame activering snelheid zodat elk molecuul nauwkeurig worden geïdentificeerd bereiken The ND filter wordt verwijderd bij beeldvorming levende cellen om de activering te verhogen met behoud van een lage waarschijnlijkheid van twee moleculen gelijktijdig geactiveerd in een buigingsbegrensde gebied. Hoe sneller tarief voor levende cellen beeldvorming nodig om de totale acquisitietijd verminderen, waarbij "bevriezen" van de Z-ring in tijd en beperken van het effect van zonbeschadigde de cel.

[4] Opmerking: Het aantal verkregen frames geoptimaliseerd voor ons systeem en zijn afhankelijk van de specifieke celstructuur, etikettering dichtheid activeringscijfer en of uitputting van de gehele pool van fluoroforen is belangrijk voor de analyse. In levende cellen, is het belangrijk om een ​​voldoende aantal gelokaliseerde verkrijgen als korte periode van time mogelijk aan de vervaging van het beeld door beweging van de celstructuur voorkomen.

4. PALM Afbeelding Bouw

1. Bepaal zwaartepunt positie van elke gedetecteerde plek.
   1. Laad de afbeelding stapel in Matlab (MathWorks, Inc).
   2. Snijd de afbeelding stapel om een ​​gebied rond een cel die alle de vaste kralen uitsluit.
   3. Selecteer een intensiteitdrempel voor spot detectie die boven het achtergrondniveau, maar minder dan de gemiddelde intensiteit spot. We vertegenwoordigen de variatie in achtergrondniveau gedurende een experiment door berekening van het lopende gemiddelde van de maximale intensiteit met een 150 framevenster. De intensiteitdrempel voor elk frame wordt dan geïnterpoleerd uit de lopende gemiddelde waarden.
   4. Trek de drempel van elk frame. Toekomstige spots worden geïdentificeerd als drie aangrenzende pixels met intensiteit boven de drempel.
   5. Plaats de fluorescentie-intensiteit van elke potentiële plek voor een tweedimensionale Gaussian functie [Equation # 1] met een niet-lineaire kleinste kwadraten-algoritme (Figuur 2). De lokalisatie nauwkeurigheid van elke spot wordt berekend volgens het aantal gedetecteerde fotonen [Equation # 2]. Een slecht-fit spot met een lokalisatie nauwkeurigheid groter dan 20 nm (gefixeerde cellen) of 45 nm (levende cellen) wordt verwijderd (zie Note # 5). Elke vlek met een intensiteit groter dan twee maal de gemiddelde intensiteit, mogelijk als gevolg van overlappende emitters, ook weggegooid.
   6. Voor gefixeerde cellen verwijderen herhaalde waarnemingen van hetzelfde molecuul door zonder enige vlek waarvan zwaartepunt positie binnen 45 nm van andere plek die voorafgegaan door 6 frames of minder. Voor levende cellen zijn alle spots behouden.
2. Kalibreer monster drift met referentiemerkteken beweging.
   1. Snijd een 10x10 pixel regio rond een referentiemerkteken.
   2. Trek de drempel bepaald in 4.1.3 van elk frame.
   3. Plaats de intensiteit profiel in elkeframe via kleinste kwadraten fitting algoritme uitgaande van een tweedimensionale Gauss vorm.
   4. Bereken verplaatsing tussen zwaartepunt posities ten opzichte van frame 1.
3. Corrigeer het zwaartepunt positie van elke unieke molecuul geïdentificeerd in 4.1 met de juiste sample drift berekend in 4.2. Vergelijk de helderveld beelden verkregen in 3.7 en 3.10. Als cellen worden waargenomen ten opzichte van het referentiemerkteken markers, worden de gegevens weggegooid.
4. Lijn alle gecorrigeerde zwaartepunt posities op een enkel beeld bestaat uit 15x15 pixels nm. Teken de unieke molecule als eenheid-gebied tweedimensionale Gaussische profiel gecentreerd op de centroïde positie met een standaarddeviatie gelijk aan de lokalisatie precisie [Equation # 2]. Dit resulteert in een waarschijnlijkheidsdichtheid kaart, waarbij een pixel intensiteit evenredig is het waarschijnlijk dat een molecuul dat pixel (figuur 3Aiv).
5. Vergelijken PALM beelden naar ensemble beelden.
   1. Replot het centroid posities in 4.4, maar op een vliegtuig met 150x150 pixels nm en een standaarddeviatie gelijk aan 250 nm. Dit genereert een PALM beeld dat een buigingsbegrensd beeldveld dat kan worden gebruikt om te vergelijken met de buigingsbegrensde, ensemble beeld verkregen in 3.8 (figuur 3Aiii) nabootst.
   2. Om te bevestigen dat de gedetecteerde moleculen representatief zijn voor de hele bevolking, vergelijk de gereconstrueerde ensemble (Figuur 3Aiii, stap 4.5.1) met de experimentele ensemble fluorescentie beeld (Figuur 3Aii, stap 3,8) om te bevestigen dat de beide beelden structuren met een soortgelijke vorm geven , oriëntatie en relatieve intensiteit.

[5] Opmerking: De minimaal vereiste nauwkeurigheid lokalisatie werd empirisch bepaald voor elke beeldvormingswerkwijze getrokken waarbij de precisie van alle moleculen van een gegeven monster en selecteren van een geschikt cutoff.

5. PALM Beeldanalyse

1. Het meten van Z-Ring Width en diameter.
   1. Draai de PALM beeld om verticaal oriënteren van de lengteas van de cel (Figuur 4A).
   2. Snijd de cellulaire gebied dat de Z-ring.
   3. Bereken de cumulatieve intensiteit door het projecteren van een intensiteit profiel langs lang de cel as.
   4. Monteer de intensiteit profiel naar een Gaussische verdeling. De ring breedte wordt gedefinieerd als de volle breedte half maximum (FWHM) van de gemonteerde Gaussische verdeling (figuur 4B).
   5. Project de cumulatieve intensiteit profiel van 5.1.2 langs korte van de cel-as. De ring diameter wordt gedefinieerd als de volledige lengte van het intensiteitsprofiel (Figuur 4C).
2. Plotten FtsZ Dichtheid (zie noot # 6).
   1. Replot het zwaartepunt posities zoals in (4.4), maar zonder de Gaussian profiel zodat elke unieke molecule wordt een waarde van 1 gegeven en aan een enkele pixel op de centroïde positie. Op deze manier de intensiteit van elkepixel is het totale aantal moleculen ontdekt dat pixel. De Density PALM afbeelding kan ook worden gevisualiseerd als een contour plot (Figuur 5E).
3. Het bepalen van Ruimtelijke resolutie.
   1. Theoretisch haalbare ruimtelijke resolutie: een vertegenwoordiger PSF voor het gehele monster met de gemiddelde precisie bepaald lokalisatie van alle ontdekte moleculen en bereken de FWHM (vergelijking # 3).
   2. Experimenteel ruimtelijke resolutie verkregen: bereken het gemiddelde verplaatsing tussen herhaalde waarnemingen van hetzelfde molecuul.

[6] Opmerking: Wij gebruikten totale interne reflectie PALM (TIR-PALM figuur 1 en 5) om de activering en excitatie een dunne laag (~ 200 nm) boven de cel / glas-interface beperken. zodat alleen FtsZ moleculen geassocieerd met de membraan die het dichtst bij het dekglaasje worden gedetecteerd.

Resultaten

In figuur 3Aiv een tweedimensionale superresolutie weergave van de Z-ring gegenereerd uit de PALM imaging hierboven beschreven werkwijze. Hieronder vatten we kwalitatieve en kwantitatieve informatie die kan worden verkregen van hen.

Kwalitatief we vast dat de Z-ring is een onregelmatige structuur die verscheidene configuraties (een band of spiraalvormige boog) die niet te onderscheiden in conventionele fluorescentiebeelden (vergelijk Figuur 3A-Dii en

Discussie

PALM beelden bevatten informatie over molecule telt en posities binnen een cel, waardoor gedetailleerde analyse van de verdeling en plaatsing van doeleiwit moleculen die moeilijk te bereiken met andere middelen. Hieronder geven we een overzicht van voorzorgsmaatregelen die moeten worden genomen om accurate kwantitatieve informatie halen met behoud van de biologische relevantie van PALM beelden. We verkennen ook de informatie die het best kan worden verkregen met behulp van live vs vaste cellen. Tot slot raden we mogelij...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van de Reagens / Materiaal	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
50 x MEM Amino Acids	Sigma	M5550
100 x MEM vitamines	Sigma	M6895
IPTG	Mediatech	46-102 RF-
16% Paraformaldehyde	Electron Micrsocopy Wetenschappen	15710-S
SeaPlaque GTG Agarose	Lonzo	50111
50 nm Goud Kralen	Microspheres-nanosferen	790113-010
FCS2 Imaging Kamer	Bioptechs
Stage-adapter	ASI	I-3017
Omgekeerde microscoop	Olympus	IX71
1,45 NA, 60x Doelstelling	Olympus
IXON EMCCD Camera	Andor Technology	DU897E
488-nm Sapphire Laser	Samenhangend
561-nm Sapphire Laser	Samenhangend
405-nm CUBE Laser	Samenhangend