Kwantificeren Glomerulaire Doorlatendheid Fluorescent macromoleculen Met 2-Photon Microscopy in München Wistarratten

Samenvatting

Een techniek gebruik te maken van hoge resolutie intavital 2-foton microscopie om direct te visualiseren en te kwantificeren gloemrular filtratie in oppervlaktewater glomeruli. Deze methode maakt het mogelijk voor de directe bepaling van de permeabiliteit eigenschappen van macromoleculen in zowel normale en zieke staten.

Samenvatting

Nierziekten waarbij urine verlies van grote essentiële macromoleculen, zoals serumalbumine, hebben lange tijd gedacht te worden veroorzaakt door veranderingen in de permeabiliteit barrière bestaat uit podocytes, vasculaire endotheliale cellen, en een basaal membraan werken in koor. Gegevens van ons laboratorium met behulp intravitale 2-foton microscopie toonde een meer doorlaatbaar glomerulaire filtratie barrière (GFB) dan voorheen onder fysiologische omstandigheden gedacht, met het ophalen van gefilterde albumine die zich in een vroeg subset van cellen genoemd proximale tubulus cellen (PTC) ^{1,2, 3.}

Vorige technieken om renale filtratie bestuderen en de vaststelling van de kenmerken van filtratie barrière betrokken micropuncture het lumen van deze vroege buisvormige segmenten bemonstering van de vloeistofinhoud en analyse ^4. In deze onderzoeken albumine in de luminale vloeistof nagenoeg onbestaande, die nauw aansluitenwelke normaal in de urine. Echter, karakterisering van dextranpolymeren met gedefinieerde afmetingen van deze techniek bleek die van een soortgelijk formaat serumalbumine hadden hogere niveaus in het tubulaire lumen en urine; suggereert verhoogde doorlaatbaarheid ^5.

Hierin is een gedetailleerd overzicht van de gebruikte techniek om direct te visualiseren en te kwantificeren glomerulaire fluorescerende albumine permeabiliteit in vivo. Deze methode maakt het mogelijk voor de detectie van gefilterde albumine in de filtratie barrière in Bowman's ruimte (de eerste kamer van urine-filtratie), en maakt het ook mogelijk kwantificering van albumine reabsorptie door de proximale tubuli en visualisatie van de daaropvolgende albumine transcytose ^6. Het ontbreken van fluorescentie albumine later langs buisvormige segmenten op weg naar de blaas benadrukt de efficiëntie van het ophalen pathway in het oudere proximale tubulus segmenten. Bovendien, wanneer deze techniek werd toegepast op doorlatendheiddextranen met een vergelijkbare grootte aan albumine vrijwel identiek permeabiliteit gemeld ^2. Deze waarnemingen direct ondersteunen de noodzaak om de focus van veel proteïnurie nierziekten te breiden naar opgenomen veranderingen in proximale tubulus cel regeneratie.

Protocol

1. Vervoeging van Rat serum albumine te Sulfo-Rhodamine 101 sulfonylchloride (Texas Red)

1. Los 100 mg Rat Serum Albumine (RSA) in 6,667 ml van 100 mM natriumbicarbonaat pH 9,0, uiteindelijke concentratie 15 mg / ml in een 50 ml conische buis.
2. Plaats oplossing in ijs / water bekerglas en koel tot tussen 0 en 4 ° C.
3. Voeg 200 ul van hoge kwaliteit watervrij Dimethylformamide (DMF) naar een 10 mg flacon van Texas Red sulfonylchloride (TRSC); vortex op medium voor 15 sec.
4. Vortex RSA-oplossing op middellange en voeg de opgeloste TRSC.
5. Wrap 50 ml conische in folie (Parafilm kan gebruikt worden om een ​​goede afdichting te verzekeren wordt gevormd), plaats horizontaal / ice alleen en plaats op rocker om oplossing langzaam te ageren (vorming van luchtbellen te vermijden) in ijsemmer, laat reactie om verder te gaan op 0 tot 4 ° C gedurende 1 uur.
6. Maak 5 L van 0,9% zoutoplossing, en bevochtig een 50 kDa moleculair gewicht afgesneden kamer die ofwel a) dialyse-membraan met clips kunnen worden, b) diANALYSE buis als in een float-a-Lyzer, of c) slide-a-Lyzer cassette (alle geschikt voor het verwijderen ongeconjugeerde TRSC).
7. Plaats reactiemengsel in de dialyse kamer en in de container 5 L w / de 0,9% zoutoplossing, dialyseren overnacht bij 4 ° C met voorzichtig roeren met een roerstaaf.
8. Wijzig de 5 L dialyseoplossing in de ochtend en in de late namiddag tot een overnacht incubatie resulteert in vrijwel geen kleurverandering (Dit duurt gewoonlijk ~ 48 uur met minimaal 4 uitwisselingen). Bovendien bestaat met MWCO van 50 kDa zo dicht bij het MW van RSA, 66kDa, kan men nooit een heldere oplossing, dit afhankelijk van de verdeling van de poriegrootte van het membraan zijn, 60 uur en 5 uitwisselingen meer dan voldoende tijd.
9. Volume meten en verdeel het aanvankelijke gewicht van 100 mg van de volume concentratie van TR-RSA approximate geven, meestal concentraties bereik 10-13 mg / ml. De uiteindelijke kleurstof: albumine verhouding moet ~ 04:01, 1 fluorophore per 15,00 zijn0 Daltons van eiwit MW. Bewaren bij 4 ° C; NOOIT FREEZE de TR-RSA-oplossing, als gevolg fragmentatie die zich kunnen voordoen zal permeabiliteit waarden veranderen.

2. Voorbereiden van de Omgekeerde Microscoop Stage for Imaging / Microscoop Instellingen

1. Plaats ~ 4-7 stukken autoclaaf tape (ongeveer ¾ "lang) perfect gestapeld op elkaar in een 50 mm schaal met een 40 mm dekglaasje bodem (dekglaasje onderste schaal). Deze moeten worden geplaatst dichter bij een van de randen, zodat de rand van de tape zal contact met de rand van de kromming van de nier, maar de doelstelling lichtpad (figuren 1A en 1B) niet blokkeren; grotere ratten zullen meer ruimte tussen de band en de rand van de schotel nodig.
2. Place 2 Repti-therm pads naast het podium naast de 50 mm schaal (figuur 1A). Plaats een warming water jasje deken over het podium.
3. Maximaliseren van de efficiëntie bij het verzamelen van beelden door het verzekeren van de objectieve turret heeft een 10x lucht or 20x (lucht of water immersie) objectief en een hogere aangedreven water immersie objectief om beelden te verzamelen voor kwantificering.
4. Tijdens de beeldvorming de meest efficiënte manier om water toe te voegen aan de doelstellingen is om ze te draaien naar de kant en voeg water met een 1 cc spuit met een lang stuk van PE-200 buizen die de top van de doelstellingen kan bereiken.
5. Stel de excitatie-intensiteit van de 10watt laser om ~ 15-20% met behulp van de grijsfilters op de software. De gallium-arsenide fosfide non-descanned fotodetectoren zijn ingesteld op 750 tot groene emissies, en 625 te verzamelen om rode uitstoot te verzamelen. Blauw-emissie (zoals de nucleaire vlek Hoechst 33342) worden verzameld met behulp van een standaard nondescanned multialkaline detector met een instelling tussen 750-800.
6. Om de correcte inning van de lage emissie-intensiteit te verzekeren binnen de Bowman's ruimte, zorg ervoor dat de ondergrenzen van de detectoren zijn zo ingesteld als niet aan deze waarden uit te sluiten. Visuele waarschuwing markers zal aangeven of de gevoeligheidinstelling te laag is en deze waarden worden gegeven een intensiteit waarde van nul.
7. Laad een 1 cc spuit met ~ 5-8 mg van de tl-albumine oplossing verdund met 0,9% steriele zoutoplossing om het totale volume op 1 cc.

3. Blootstellen van de nier in een München Wistar Rat voor intravitale 2-Photon Imaging

1. Begin met een pre-verdoofde rat met Pentabarbitol (50 mg / ml oplossing, μl/100 120 g lichaamsgewicht), Inactin (130 mg / ml oplossing, μ/100 120 g lichaamsgewicht) of isofluorane (5% inductie, 1,5 tot 2.5% onderhoud), een inwonende veneuze lijn (ofwel halsader of femorale veneuze), en de linker flank geschoren van net onder de ribbenkast tot net boven de linker dij.
2. Plaats de rat plat op haar rechterzijde, zodat de linker, geschoren kant naar boven, zorg ervoor dat het is plat op de tafel, met zijn houding langwerpig en niet gehurkt, met voorpoten tegen elkaar en achter poten raken elkaar (Figuur 2A).
3. Heel voorzichtig palperen om de nieren te bepalen waar het natuurlijk legt binnen de retroperitoneum en trek een rechte lijn parallel aan het lichaam (van ribbenkast naar dij) met een Sharpie (Figuur 2A) voelen.
4. Pak de huid met een paar getande tang, en neem de huid langs de getekende lijn met behulp van een paar hemostats om het weefsel te verpletteren en bloedingen te voorkomen. Knip langs de incisie met een paar chirurgische schaar. Breken de buitenste huid en de spieren lagen voorafgaand aan het snijden zal drastisch verminderen en typisch elimineren bloeden.
5. Herhaal deze procedure voor de buitenste spierlaag, die dun.
6. Voor de incisie in de binnenste spierlaag, die het peritoneum blootstelt, opnieuw palperen de nier te schatten formaat. Knijp een incisie lijn kleiner is dan de nieren, het verzekeren van de incisie is iets meer dan de nier. Het beste is om deze incisie te klein te maken en maken het groter indien nodig. Als deze te groot is, zal hechten vereist.Dit laatste incisie is cruciaal; te ver dan in elke richting zal beïnvloeden stabiliteit op het podium en induceren ofwel bewegende voorwerpen uit de ademhaling (best case scenario) of zullen de renale pedikel en negatieve verminderen nierperfusie (worst case scenario) rekken.
7. Zoek de nieren (zie figuur 2B) en de grip omringende vet met forceps, werkt aan de onderzijde pool van de nier in een hand over hand mode.
8. Zodra de onderste pool van de nier wordt bereikt, trek de nier door de incisie, terwijl heel zachtjes knijpen onder de nieren te exterioriseren. Als de incisie te klein is, verpletteren de spierlaag en snijd het te verbreden, herhaal dan de procedure om nier exterioriseren.

4. Het plaatsen van de Munich Wistar Rat in het werkgebied voor Imaging

1. Plaats de nier naar de rand van het dekglaasje schaal met de nieren lichtjes gedraaid naar de dorsale (achterzijde) van de rat zodat de ventrale zijde van de nier is contact maken met het dekglaasje onderste schaal (figuur 1A). Voeg een voorverwarmde, steriele 09.% Zoutoplossing aan het gerecht.
2. Kijk door de 10x of 20x objectief en controleer beweging. Als er beweging wordt gedetecteerd, rollen de rat op iets, zodat de thorax is verder weg van het dekglaasje onderste schaal, zorg ervoor dat de nieren wordt zo dicht mogelijk bij de rand van de schotel zonder strekken de renale pedicle (Figuur 1B).

5. Afbeeldingen ophalen om Renal Doorlatendheid albumine kwantificeren

1. Het berekenen van de glomerulaire permeabiliteit (Glomeruluar zeefcoëfficiënt; SGR) van elke macromolekuul vereist het nemen van referentie achtergrond beelden van individuele glomeruli voorafgaand aan infusie van de fluorescente molecuul. Als uw microscoop is uitgerust met een gemotoriseerde podium staat is het markeren van locaties, te vinden en het centrum individuele glomeruli met de onderste aangedreven objectieve en markeer elke locatie. Een dubbele pas Fluorescein / Rhodamine epifluorescente filter is ideaal voor deze procedure, hoewel beide emissiefilter zal werken (fase-contrast-of andere niet-fluorescentie lichtbronnen zal niet werken). Glomeruli verschijnt als lege cirkelvormige structuren omgeven door proximale tubuli met een inherente geel-oranje autoflourescence wanneer bekeken door de dual-pass filter.
2. Als uw microscoop niet over een gemotoriseerde podium, scan de nier in een raster patroon met het lage vermogen objectief en maak een rudimentaire kaart van waar de individuele glomeruli liggen; vertrouwen op natuurlijke bezienswaardigheden zoals grote oppervlakkige bloedvaten zich boven de nierkapsel of vet vlekken.
3. Schakel het torentje aan de hogere macht water immersie objectief en neem 3D data sets van elk glomeruli te zorgen dat de capillaire lussen en Bowman's ruimte zijn duidelijk zichtbaar. Met behulp van een pseudokleur palet (iets anders dan B / W) zal helpen om deze structuren te visualiseren.
4. Focussen in op een oppervlakkig bloedvat langzaam doordringen in tHij fluorescerende albumine maken zeker de tijd wordt gegeven om voor systemische distributie. Voor moleculen met lage GSC is het essentieel om de sterktewaarden in het plasma maximaliseren maar niet tot een niveau dat de fotodetectoren verzadigd zal in de microscoop bereiken. Dit verhoogt detecteerbaarheid gefilterd moleculen. Opmerking: er is meestal een 5-7 sec tijdsverloop tussen het moment dat de fluorescerende albumine wordt ingevoerd om de tijd die op het scherm verschijnt (het verwerven van volledige beelden op ~ 1 frame / seconde).
5. Laat ongeveer 10 minuten om eventuele kleine moleculair gewicht fragmenten te wissen voordat het verwerven van 3D-volumes op 1 micrometer intervallen te worden gebruikt bij de berekening van albumine SGR. Typisch, de Simonsen's stam van München Wistarratten heeft veel minder oppervlak glomeruli, dus alles wat kan worden gevisualiseerd worden afgebeeld en gekwantificeerd. De Frömter stam heeft een veel groter aantal dus beperken we het aantal gekwantificeerde tot ~ 10.
6. Aan het einde van de studie de rat gedood door een overdosis van de anesthetic in de studie. Een dubbele pneumothoracotamy wordt uitgevoerd om euthanasie te verzekeren.

6. Berekenen van GSC voor TL albumine van 3D volumes

1. Met behulp Metamorph beeldverwerking software te laden de 3D data sets voor elke glomeruli, zowel de achtergrond set en set genomen na infusie van de tl-albumine.
2. In het volume met de tl-albumine zoek een oppervlakkige capillaire lus met voldoende ruimte lege ruimte tussen de gedefinieerde marges en de rand van het kapsel van Bowman.
3. Op de achtergrond volume lokaliseren dezelfde focal plane waarin alle visuele aanwijzingen van de albumine afbeelding bevattende moet bevatten. Selecteer een regio binnen de capillaire lus van rente en noteer de gemiddelde intensiteit lezen. Vervolgens selecteert u een regio binnen de Bowman ruimte en noteer de gemiddelde intensiteit lezen. Deze worden gebruikt als achtergrondwaarden.
4. Voor kwantificering, selecteert de vergelijkbare regio binnen de Bowman ruimte in de albumine containing afbeelding. Doe dit voor minstens twee andere regio's om een ​​gemiddelde waarde voor de gemiddelde intensiteit van binnen Bowman's ruimte innemen.
5. Selecteer de capillaire lus met de helderste plasma-intensiteit en trek een streek eromheen. Vervolgens met behulp van de drempel functie, markeert de heldere waarden binnen het circulerende plasma, het vermijden van de donkere strepen die circuleren RBC's. Let op de gemiddelde intensiteit waarden van de geselecteerde plasma ruimte. Het is belangrijk om bij voorkeur selecteren de heldere gebieden van het plasma omdat factoren in het bloed zal alleen dienen oorzaak en onderschatting van plasma fluorescentieniveaus.
6. Met behulp van een Microsoft Excel spreadsheet voert u de waarden bij het SGR waar berekenen:

Resultaten

Figuur 3 toont een voorbeeld van een afbeelding uit een oppervlak van een glomerulus München Wistar Frömter rat en de maatregelen om de permeabiliteit van fluorescente albumine te bepalen. De SGR waarde voor albumine van 0,0111 afgeleid voor deze persoon glomerulus vallen binnen het bereik gezien bij deze stam van München Wistarratten toen in de gevoede toestand ^3. De stabiliteit gezien in dergelijke beelden door de zorgvuldige planning en uitvoering van instructies getoond in figuren...

Discussie

De stappen benadrukt hier vertegenwoordigen wat we voelen zijn degenen die zal produceren consistente en nauwkeurige permeabiliteitswaarden omdat ze omzeilen de volgende valkuilen:

1. Verstrooiing: Het gebruik van een rood emitterende fluoroforen zorgen voor een efficiëntere inning van het licht omdat fotonen langere golflengte minder geneigd zijn te verstrooien. Met behulp van hetzij groen of blauw emitterende fluoroforen zullen grotere variatie in de GSC's vanwege de verhoogde variabiliteit in intensitei...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters voor detectoren: Blauw 430/100, Groen 525/50, Rood 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Afstelbare excitatiegolflengten: ~750-1150 nm
Gallium arsenide fosfide fotodetectoren	Hamamatsu Corp		Opmerking: Beschikbaar in voor- of zijmontage.
Metamorph Beeldverwerkingssoftware	Molecular Dynamics		Opmerking: Versie 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 versie
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (recht)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Verwarmingspad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Onder Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07