Visualisatie van endoplasmatisch reticulum gelokaliseerd mRNA's in zoogdiercellen

Summary

Hier beschrijven we een methode om endoplasmatisch reticulum-geassocieerde mRNA in zoogdiercellen visualiseren weefselcultuurcellen. Deze techniek omvat het selectieve permeabilisatie van het plasmamembraan met digitonine verwijderen cytoplasmatische inhoud gevolgd door fluorescent In situ Hybridisatie met bulk-poly (A) mRNA of specifieke transcripten detecteren.

Abstract

In eukaryoten meeste messenger RNA (mRNA) die coderen uitgescheiden en membraan eiwitten gelokaliseerd op het oppervlak van het endoplasmatisch reticulum (ER). Echter, de visualisatie van deze mRNA's een hele uitdaging. Dit geldt vooral wanneer slechts een fractie van de mRNA ER-geassocieerde en de distributie van dit organel wordt belemmerd door ongerichte (dwz "vrij") transcripten. Om ER-geassocieerde mRNA controleren, hebben wij een methode waarbij cellen worden behandeld met een korte blootstelling aan een digitonine extractieoplossing die selectief permeabilizes het plasmamembraan is waardoor het cytoplasmatische inhoud, terwijl ze tegelijkertijd de integriteit van de ER . Wanneer deze methode wordt gekoppeld met fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), kan men duidelijk zichtbaar ER gebonden mRNA's door fluorescentiemicroscopie. Met dit protocol de mate van ER-vereniging voor bulk poly (A) transcripts of specifieke mRNAs kan worden geëvalueerden zelfs gekwantificeerd. In het proces kan men gebruik maken van deze assay de aard van mRNA-ER interacties te onderzoeken.

Introduction

In eukaryoten mRNA codeert uitgescheiden en membraaneiwitten kunnen worden gericht op de ER co-translationeel de signaalherkenning deeltje ^1,2 en kan worden gehandhaafd op het ER via de directe interacties tussen ribosomen en translocons tijdens de vertaling ^3,4. Maar of mRNA's kan worden gericht en onderhouden op de ER onafhankelijk van een van beide ribosomen of vertaling is niet duidelijk tot voor kort. Eerdere studies geprobeerd om aan te pakken of er sprake is translatie-onafhankelijke mRNA samenwerking met de ER met behulp van cellulaire fractionering technieken. Omdat agressieve chemische omstandigheden moesten ribosomen distantiëren ....

Protocol

1. Voorbereiding van Materialen voor Extraction

1. Bereiding van Cellen
   1. Seed weefselkweekcellen on zuurbehandelde coverslips ten minste een dag voor het experiment. Wij gebruiken COS-7 of U2OS, als deze twee cellijnen vertonen sterke productie van uitgescheiden eiwit en hebben een goed gedefinieerde ER. Merk op dat een hoge extractie efficiëntie, cellen niet zouden 80% confluentie op het dekglaasje op de dag van het experiment overschrijden.
   2. Als een bepaalde exogene mRNA wordt onderzocht, worden de cellen getransfecteerd een dag na enten met plasmiden die het gen van interesse met behulp van standaard transfectie protocollen. De cellen word....

Results

Het percentage mRNA dat ER-geassocieerde, COS-7-cellen die waren getransfecteerd met plasmiden die de placentaire alkalische fosfatase (ALPP) of cytochroom P450-8B1 (CYP8B1) ofwel werden geëxtraheerd met digitonine en vervolgens gefixeerd of direct bevestigd die vast (zie figuur 1, vergelijk "uitgepakte Ctrl" naar "extractie Ctrl"). De niet-nucleaire fluorescentie werd gekwantificeerd in beide monsters en de fractie van ER-geassocieerde mRNA werd berekend (F.......

Discussion

De lokalisatie van mRNAs verschillende subcellulaire locaties, door de interactie van mRNA transcripten met lokalisatie eiwitten, is een veel voorkomend verschijnsel belangrijk voor de juiste sortering van eiwitten naar hun eindbestemming, en voor de fijnafstelling van genexpressie aan de plaatselijke eisen van een subcellulaire regio ^19,20.

Met de assay hier beschreven we opnieuw de vraag of mRNA's die coderen voor secretie eiwitten kan worden gehandhaafd op de ER in de aanwe.......