C. elegans Chemotaxis Assay

Samenvatting

Werkwijze voor het kwantitatief beoordelen van de chemotactische respons van Caenorhabditis elegans Is beschreven. Een chemotactische index (CI) werd gebruikt als een manier om de respons van wormen om bepaalde doelen nauwkeurig te evalueren, en dienen als een platform van vergelijking tussen stammen en verbindingen van belang.

Samenvatting

Veel organismen gebruiken chemotaxis te zoeken naar voedsel bronnen, vermijd schadelijke stoffen, en vind mates. Caenorhabditis elegans heeft indrukwekkende chemotaxis gedrag.

Het idee achter het testen van de respons van de wormen een geurstof is om ze in een gebied en let op de beweging opgewekt in reactie op een geurstof. Zelfs met de vele beschikbare testen, optimaliseren worm startlocatie ten opzichte van zowel de controle-en test-gebieden, terwijl het minimaliseren van de interactie van wormen met elkaar, met behoud van een significante omvang steekproef blijft een work in progress ^1-10. De hier beschreven methode is bedoeld om deze problemen aan te pakken door een wijziging van de test is ontwikkeld door Bargmann et al.. ^1. Een petrischaal verdeeld in vier kwadranten, worden twee tegengestelde kwadranten gemerkt "Test" en twee aangeduid als "Controle". Verdoving wordt geplaatst in alle test-en controle sites. De wormen worden geplaatst in het midden van de plaat met een circle gemarkeerd rond de oorsprong te waarborgen dat niet-beweeglijke wormen zullen worden genegeerd. Met behulp van een vier-kwadrant systeem in plaats van een 2 of twee 1 elimineert bias in de beweging van de wormen, omdat ze op gelijke afstand van test-en controlemonsters, ongeacht welke kant van de oorsprong zij begonnen. Dit omzeilt het probleem van de wormen worden gedwongen om te reizen via een cluster van andere wormen om te reageren op een geurstof, die wormen kunnen vertragen of hen dwingen om een ​​meer omslachtige route te nemen, waardoor een onjuiste interpretatie van de beoogde pad. Deze methode toont ook praktische voordelen van het hebben van een grotere steekproef en waardoor de onderzoeker aan de test zonder toezicht draaien en scoren de wormen zodra de toegewezen tijd is verstreken.

Inleiding

Ward eerst de chemotaxis assay ontwikkeld in 1973 ^5, en sindsdien is het verreikende toepassingen heeft gehad. Neurobiology is een veld dat heeft geprofiteerd van met verschillende chemotaxis assays. Olfactorische aanpassing, een eenvoudige vorm van leren en geheugen, is aangetoond in C. elegans gebruikt chemotaxis assays ^6. Zij zijn ook gebruikt om aan te tonen dat C. elegans kan ontwikkelen ethanol tolerantie-een resultaat dat niet alleen toont de gedrags plasticiteit van de wormen, maar toont ook dat de wormen zeer nuttig zijn in de studie van alcoholafhankelijkheid in mensen ^3. Assays ook ontwikkeld om het vermogen van C. tonen elegans op korte en lange termijn geheugen opslaan door te laten zien dat verenigingen zijn gemaakt door de wormen tussen chemoattractanten en levensmiddelen (OP50) ^7. Bovendien, gezien de uitgebreide informatie die momenteel beschikbaar is over de C. elegans genoom, de chemotaxis gedrag van C. elegans is vele malen veranderd door het induceren van mutaties ^1,8. Dit zorgt voor vele interessante technische mogelijkheden, zoals de ontwikkeling van C. elegans als een bioremediation tool. Aldus, aangezien de initiële ontwikkeling van de chemotaxis assay in 1973, het is vaak gewijzigd en gebruikt om geheimen in verschillende disciplines helderen.

Bepaalde tests die gericht zijn op de specifieke route van de wormen in de richting van een doelwit te ontdekken. De prototypische assay dergelijke ontwikkeld door Ward ^5. Drie wormen op gesmolten agar gedurende 15 minuten geplaatst. Hun bewegingen werden getraceerd door de afdruk ze vertrokken als zij reisden van de omtrek van de plaat tot een gradiënt van een lokstof in het midden van de plaat. Alle wormen op de plaat werden aangehouden met chloroform aan het einde van elke proef. Een afstammeling van deze methode geplaatst een worm in het midden van de plaat met de lokstof en het bedieningsorgaan eent gelijke en tegengestelde afstanden van de oorsprong ^2.

Pierce-Shimomura et al.. een test ontwikkeld om de precieze aard van de beweging die deze chemotaxis ⁹ waarnemen. Individuele wormen werden in 9 cm Petrischalen hetzij met een uniforme concentratie van de lokstof of radiaal gevormde gradiënt, culminerend in de bron van de attractant. Een computer-softwareprogramma dat de worm opgenomen werd gebruikt om het waargenomen gedrag opnemen. Een video camera aan een microscoop werkt in samenhang met het stadium van de petrischaal automatisch de assay rende te zorgen voor de worm bleef het gezichtsveld. Hieruit werd meer gedetailleerde informatie ontdekt over de oorzaak van pirouettes weergegeven C. elegans.

Andere assays, meer vergelijkbaar met de hier beschreven, testten de reactie van een grote populatie van wormen testverbindingen. Tweekwadrantentechnologie chemotaxis assays zijn geweestgebruikt om de rollen te ontdekken dat verschillende neuronen, receptoren en signaaltransductie moleculen afgespeeld als C. elegans werd blootgesteld aan verschillende verbindingen ^1. 20-50 gewassen wormen in het midden van de plaat gebracht met een attractant een controle aan polaire uiteinden samen met de verdoving, natriumazide _(NaN3). Na 60 min werd een chemotactische index waarden van -1,0 tot +1,0 gegenereerd op basis van het verschil tussen het aantal wormen werden aangebracht op de lokstof of control. Een soortgelijke chemotactische index werd gebruikt in de assay die in dit artikel, zal de genoemde assay geen niet-beweeglijke wormen strikt evalueren. Deze test werd vervolgens verder toegevoerd aan het testen van de effecten van neuronale ablatie op chemotaxis.

Een andere variant van de bovengenoemde test werd uitgevoerd waarbij 100-200 wormen werden geplaatst in het midden van een plaat met vier kwadranten ^3. Aangrenzende kwadranten ofwel bevatte de test ofbeheersen stof. Zoals in eerdere assays werden de wormen geïmmobiliseerd door de werking van natriumazide alvorens gescoord. Een soortgelijke werkwijze wordt beschreven als een vorm van evaluatie van de respons van C. elegans verschillende verbindingen. Echter, de onderstaande methode heeft het extra voordeel van slechts evalueren wormen die een drempel afstand tussen mobiele van immobiele wormen zijn verstreken.

Andere testen hebben soortgelijke richtlijnen voor het negeren van immobiele wormen opgenomen. Frøkjær-Jensen et al.. ontwikkelde een veelzijdige assay die kan worden gebruikt om zowel vluchtige en wateroplosbare testverbindingen ^10. Een petrischaal werd verdeeld in vier kwadranten. De bovenste en onderste kwadranten geen oplosmiddelen bevatten. De linker kwadrant bevatte water, en de rechter bevatte de lokstof. Bij het testen van vluchtige geurstoffen, is de analyt geplaatst op het deksel van de schaal op de juiste kwadrant, terwijl water oplosbare verbindingen direct aan de aga geplaatstr.

De methoden die momenteel bestaan ​​voor het evalueren van de chemotactische respons van C. elegans worden voortdurend verfijnd om hun gebruiksgemak, efficiëntie en nauwkeurigheid te optimaliseren. Dus, terwijl de hier beschreven assay heeft de mogelijkheid van het beoordelen van de grootste aantal wormen (maximum throughput:. 250 worms / uur per plaat, iets groter dan de doorzet aangetoond door Lee et al. ^3), de echte kracht van deze methode is de beknopte resultaat van vele kenmerken van eerdere tests (Tabel 1).

Protocol

1. Voorbereiding / wassen van de Worms

1. Synchroniseer wormen tot jong-volwassene ^11.
2. Pipetteer 2 ml van de S Basale op een 5 cm Chemotaxis plaat van geënsceneerde wormen die net het gazon van OP50 E. hebben gewist coli. Tilt de plaat als nodig is om te zorgen voor de wormen worden gewassen uit het plaatoppervlak in de buffer.
3. Pipetteer 1 ml van de worm-S Basal oplossing in een microcentrifugebuis.
4. Centrifugeer gedurende 10 sec met een PicoFuge bij 6.600 rpm.
5. Zuig het S Basal, waardoor de pellet van wormen ongestoord.
6. Voeg 1 ml S Basal oplossing voor de microcentrifugebuis, keert een paar keer om de wormen te wassen.
7. Herhaal stappen 1,4-1,6 nog drie keer.
8. Centrifugeer gedurende 10 sec vijfde maal, ditmaal afzuigen het supernatant tot een eindvolume van ca.. 100 pl.
9. Pipetteer 2 pi van de wormen op een NGM plaat te verzekeren dat er tussen de 50 en 250 wormen in elk 2 pl monster. Aanpassende concentratie van wormen in de S Basal indien nodig door resuspenderen de wormen in een kleiner of groter volume Basal S.
10. Gebruik de wormen in de test onmiddellijk na het wassen van de wormen tot 1 uur.

2. Voorbereiden van de Test Platen

1. Markeren van de onderkant van een 5 cm bord, verdeel het gerecht in 4 gelijke kwadranten. Chemotaxis agar of NGM worden gebruikt. Een minimum van 3 proeven vereist per genetische stam getest.
2. Markeer een cirkel met een straal van 0,5 cm rondom de herkomst (figuur 1).
3. Markeer een punt in elk kwadrant met ofwel een "T" voor "Test" of "C" voor "Control" zodat de sites op gelijke afstand van de oorsprong en elkaar. De punten moeten minstens 2 cm van de oorsprong. Markeer de linksboven en rechtsonder kwadranten als test-kwadranten en rechtsboven en linksonder kwadranten als controles (figuur 1).

3. Rijdt de Assay

1. Meng de testoplossing door het combineren van gelijke volumes van de proefverbinding en 0,5 M azide (een anestheticum voor de wormen arresteren bij het bereiken van een kwadrant). Meng de controlevloeistof door het combineren van het gebruikte oplosmiddel voor de testverbinding met 0,5 M azide verdunnen.
2. Pipetteer 2 pi van de worm-oplossing (bereid in 1.8) van de pellet op de oorsprong (waar de twee lijnen elkaar kruisen).
3. Onmiddellijk daarna pipet 2 pl van de testoplossing op de twee "T" sites. Ook pipet dezelfde hoeveelheid controleoplossing op de twee "C" sites.
4. Zodra de worm en geurstof druppels zijn opgegaan in de agar, vervang de deksels en omkeren van de platen.
5. Na 60 min, plaatst de wormen in een 4 ° C incubator. Verwijder slechts een plaat uit de incubator wanneer het kan worden geteld. Het verlaten van wormen bij kamertemperatuur kan hen in staat stellen om opnieuw te mobiliseren.
6. Noteer het aantal wormen in elk kwadrant dat de binnenste circ volledig gekruistle.
7. Herhaal de stappen 3,2-3,6 met behulp van de controle-oplossing in zowel de test-en controle kwadranten. Dit zal dienen als controle bord. Drie van dergelijke platen moet worden gemaakt en uitgevoerd om te dienen als een geschikte controle.

4. Het interpreteren van de scores / Bepaling van de Chemotaxis Index

1. Bereken de chemotaxis index met behulp van Vergelijking 1. Dit zal een chemotactische index tussen -1,0 en +1,0 opleveren.

(1)

Chemotaxis index = (# Wormen in beide Test Quadrants - # Wormen in beide Controle Quadrants) / (Totale # gescoorde Worms)

Een 1,0 score duidt op maximale aantrekkingskracht naar het doel en vertegenwoordigt 100% van de wormen die aankomen in de kwadranten met de chemische doelwit. Een index van -1.0 is het bewijs van de maximale afstoting. Soortgelijke testwerkwijzen reeds gebruikt ³ (Tabel 1).

2. Vermeld de gemiddelden Chemotaxis Index (CI) en de standaardafwijking van de gemiddelde (SEM). Kunnen T-toets van Student vergelijken van de gegevens van de test en controle platen.

Resultaten

Het vergelijken van wild-type (N2) C. elegans aan de ODR-10 (KY10) mutant.

We gebruikten diacetyl, een bekende C. elegans chemoattractant te wildtype wormen vergelijken met die van een mutant de receptor diacetyl ^1,12 mist. Voor wildtype (N2) wormen de chemotactische index was 0,100 ± 0,066 tot ethanol en 0,839 ± 0,031-0,5% diacetyl. Zoals verwacht, diacetyl lokt een aanzienlijke chemoattractive reactie van wildtype wormen (P <0.003). In tegenst...

Discussie

Chemotaxis, hoewel bestuurd door een complexe set van neuronale en cellulaire mechanismen gewoon objectief bepaald middels chemotaxis assays kunnen worden. Om de beste resultaten van de testen te verkrijgen, moeten bepaalde kritische stappen worden genomen. Ten eerste, de enscenering van de wormen is essentieel in waardoor consistente experimentele resultaten. Wormen in verschillende levensfasen zich anders gedragen ^13; dus gemengde stadium wormen kan skew experimentele resultaten. Ten tweede, het waarborgen ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K fosfaatbuffer, pH 6,0; dH2O tot 1 liter.] Autoclave
PicoFuge	Stratagene	400552
Microscopen	Leica
Dissectie	Leica
P1000 Pipet	Gilson
P10 Pipet	Gilson
0,5 M Natriumazid
Chemotaxis Agar [1,6% BBL-agar (Benton-Dickinson) of 2% Difco-agar. Autoclave. Voeg 5 mM kaliumfosfaat toe, pH 6,0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
Ethanol/Gedestilleerd Water
Testverbindingen (bijv. 0,5% diacetyl)
Agar	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0,25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531