Milieuvriendelijke gecontroleerde Microtensile Testen van mechanisch-adaptieve nanocomposieten voor Ex vivo Karakterisering

Summary

Werkwijze besproken waarbij de In vivo Mechanisch gedrag van stimuli-responsieve materialen als functie van de tijd. Monsters worden getest Ex vivo Gebruik van een microtensile tester met milieucontroles te simuleren de fysiologische omgeving. Dit werk bevordert verder het begrip van de In vivo Gedrag van ons materiaal.

Abstract

Implanteerbare microdevices worden steeds aanzienlijke aandacht voor verschillende biomedische toepassingen ^1-4. Dergelijke apparaten zijn gemaakt van een waaier van materialen, elk met zijn eigen voordelen en tekortkomingen ^5,6. Meest opvallend vanwege de afmetingen microschaal inrichting wordt een hoge modulus vereist implantatie in levend weefsel te vergemakkelijken. Omgekeerd moet de stijfheid van de inrichting aan de omringende weefsel geïnduceerde straindistributie ^7-9 minimaliseren. Daarom hebben we onlangs een nieuwe klasse van bio-geïnspireerd materialen voldoen aan deze eisen door te reageren op prikkels uit de omgeving met een verandering in mechanische eigenschappen ^10-14 ontwikkeld. Specifiek onze poly (vinylacetaat)-based nanocomposiet (PVAc-NC) toont een verlaging van de stijfheid bij blootstelling aan water en bij verhoogde temperatuur (bijvoorbeeld lichaamstemperatuur). Helaas, weinig methoden bestaan ​​om de stijfheid van de materialen in vivo ^15, en mech kwantificerennische testen buiten de fysiologische omgeving vereist vaak grote monsters ongeschikt voor implantatie. Verder kan stimuli-responsieve materialen snel terugkeren naar hun oorspronkelijke stijfheid na explantatie. Daarom hebben we een methode waarbij de mechanische eigenschappen van geïmplanteerde microsamples meetbaar ex vivo ontwikkeld met gesimuleerde fysiologische omstandigheden gehandhaafd met vocht en temperatuur ^13,16,17.

Hiertoe werd een aangepaste microtensile tester ontworpen om microschaal monsters tegemoet ^13,17 met sterk uiteenlopende elasticiteitsmoduli (bereik van 10 MPa tot 5 GPa). Als onze belangen zijn bij de toepassing van PVAc-NC als een biologisch-aanpasbaar neurale sonde substraat, een instrument waarmee de mechanische karakterisatie van monsters bij de microschaal noodzakelijk was. Deze tool is aangepast aan vochtigheid en temperatuur, welk monster geminimaliseerd drogen en koelen ¹⁷ verschaffen. Dientengevolge, de monteural kenmerken van de geëxplanteerde steekproef nauw overeen met die van het monster vlak voor explantatie.

Het algemene doel van deze methode is om kwantitatief vast in vivo mechanische eigenschappen, in het bijzonder de Young's modulus, van stimuli-responsieve, mechanisch-adaptieve polymeer gebaseerde materialen. Dit wordt bereikt door eerst de omgevingsomstandigheden die een wijziging in voorbeeld mechanische eigenschappen na explantatie minimaliseert zonder bij te dragen aan een vermindering van stijfheid onafhankelijk van die welke uit de implantatie. Monsters worden vervolgens bereid voor implantatie, behandeling, en testen (Figuur 1A). Elk monster wordt geïmplanteerd in de cerebrale cortex van ratten, die hier wordt voorgesteld als een geëxplanteerd hersenen van de rat, en voor een bepaalde duur (Figuur 1B). Op dit punt wordt het monster geëxplanteerd en onmiddellijk geladen in de microtensile tester, en daarna onderworpen aan trekproeven (figuur1C). Latere data-analyse geeft inzicht in het gedrag van die innovatieve materialen in de omgeving van de cerebrale cortex.

Protocol

1. Monstervoorbereiding

1. Bereid PVAc-NC film dikte in het traject van 25-100 urn met een oplossing casting en compressietechniek ^10-12.
2. Zich film een ​​silicium wafer door verhitting op een hete plaat gedurende twee minuten bij 70 ° C (boven de glasovergangstemperatuur) om grondig contact tussen de film en de wafer promoten. Deze stap zorgt ervoor dat de bereide film blijft vlak en vast aan de Si wafer, die noodzakelijk zijn voor vlakke micromachining processen is.
3. Patroon van de film in het proefmonster geometrieën met behulp van laser-micromachining (VLS 3.50, VersaLASER). Stel de CO ₂ direct-write laser micromachining parameters tot 1,0% vermogen (0,5 W), 4,0% snelheid (56 mm / s), en 1000 pulsen per inch ^13,16.
4. Patroon monsters die zullen worden gebruikt om de milieu-omstandigheden ("setup samples") vast te stellen in dogbone-vormige structuren met laterale pad afmetingen 1.5 x 1.5 mm ^2, en laterale bundel dimensions 300 x 3000 pm ^2, met een dikte die overeenstemt met die van de gehele film (figuur 2).
5. Patroon de monsters voor ex vivo experimenten ("implant sample") in bundels 300 urn x 6 mm, met een dikte die overeenstemt met die van de film.
6. Laat de monsters voorzichtig uit de wafer met een scheermesje en pincet.
7. Voor de omgang met monsters, voorbereiden op maat gefreesd acryl houders ontworpen om te dienen als onderdeel van de grip systeem in de microtensile tester. Lasergeëtste markeringen tonen de middellijn van de houder en 1,5 mm van het einde. Plaats een kleine hoeveelheid gel cyanoacrylaat gebaseerde lijm op de hartlijn van de acryl houder en precies houdt een mm lengte van het implantaat 1,5 monster aan de houder en overlappen de gemarkeerde middellijn (figuur 3). Elk implantaat monster vereist een acryl houder. Wees voorzichtig om ervoor te zorgen dat de lijm gel blijft alleen langs de mm lengte van PVAc-NC 1.5 wordt vastgehouden aan de ACRylic houder. Anders kan de lijm gel interfereren met de mechanische eigenschappen van het monster.
8. Verwijder vocht uit alle monsters door ze in een exsiccator gedurende tenminste 24 uur.
9. Meet de lengte, breedte en dikte afmetingen van de monsters met behulp van een optische microscoop.

2. Vast te stellen aan de omgeving

1. Laad een droge setup monster in de microtensile tester (zie figuur 4), eerste klemmen tussen de mobiele grepen, dan tussen de vaste grepen.
2. Monteer een air brush met water gevulde reservoir in een vaste positie met het mondstuk gericht naar de microtensile monster. Sluit de lucht borstel om een luchtcompressor via plastic buizen. Met de air brush nozzle volledig gesloten, zet de luchtcompressor.
3. Begin cyclische microtensile testprocedure, afwisselend rek (positieve stam) en stuik (negatieve spanning) toegepast op de tHij monster, steeds binnen de lineaire elastische gebied van het spannings-rek plot. Voor PVAc-NC, wordt de aangebrachte spanning beperkt tot minder dan 2%. In de aangepaste microtensile tester gebruikt in deze experimenten werd de reksnelheid geregeld terwijl de vereiste kracht om die stam te bereiken gemeten. Als alternatief zou een andere opzet omvatten het regelen van de uitgeoefende kracht tijdens het meten van de gevormde stam.
4. Geleidelijk verhogen van de doorstroming van de lucht borstel mondstuk, en toezicht houden op de helling van de spanning-rek plot als functie van de hoeveelheid stroom uit de air brush. De maximale stroom die niet leidt tot een significante (> 10%) verlaging van Young's modulus gedurende 60 seconden is het niveau dat zal worden gebruikt voor de ex vivo experimenten. Op dit punt, de vochtigheid die niet nat droge monster (en zo bijdragen tot een vermindering van Young's modulus) en zal ook het minimaliseren monster drogen na blootstelling aan biologische vloeistoffen in vivo zijn esta geweestdumping is vastgesteld.
5. Meet de temperatuur in de buurt van het monster. Een ideale setup zou omvatten een thermokoppel met digitale uitlezing, en worden uitgevoerd terwijl de airbrush werkt. Stel de intensiteit en afstand van de stralende warmtebron zodanig dat de monstertemperatuur wordt gehouden tot 37 ° C, om fysiologische omstandigheden passen.

3. Vergelijk Environmental Control aan Non-Environmental Control

1. Dompel opstart monsters gedurende ten minste 30 minuten in met fosfaat gebufferde zoutoplossing. Na deze tijd wordt het monster volledig verzadigd en is gereduceerd tot zijn minimum Young's modulus bij een gegeven temperatuur.
2. Snel een monster laden in de microtensile tester en beginnen cyclische microtensile testen, met de air brush uit, terwijl het monster droogt. Dit zal bepalen hoe snel het monster droogt onder niet-gecontroleerde omstandigheden.
3. Laad een tweede PBS-verzadigde setup monster in de microtensile tester, en beginnen cyclische microtensile testenmet de air brush op. Deze bepaalt hoe snel het monster droogt onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden.

4. Probe Implantatie en Explantatie

1. Hechten implantaat monster op een micromanipulator klem en positie loodrecht op de corticale weefsel.
2. Voorafgaand aan het inbrengen, houden weefsel voldoende vochtig met een zoutoplossing om de homogeniteit van weefselmechanica garanderen.
3. Verlaag het polymeer monster in de cortex met behulp van de micromanipulator handbediening. Vertrekken monster in corticale weefsel totdat het doel implantaat tijd, in het algemeen tussen 1 en 30 minuten. Om weefsel uitdroogt voor tijdstippen dan 5 min, lichtjes deppen het weefsel om de 5 min met behulp van een zoutoplossing gedrenkte wattenstaafje.
4. Terwijl de sonde wordt geïmplanteerd in de cortex, de voorbereiding van de microtensile tester voor het laden van de momenteel geïmplanteerd monster door het instellen van de aandrijfstang naar de nul-verplaatsingspositie van 3,0 mm van de stationaire monster klem. Stel bovendien de air brush nozzleom de stroom instelling en de stralende warmtebron om de juiste intensiteit te bepalen in stap 2.4.
5. Aan het einde van de gespecificeerde implantaat tijd, verhogen van de sonde uit de cortex met behulp van de micromanipulator handbediening. Onmiddellijk en voorzichtig testitem van de micromanipulator klem laden in de microtensile tester, zoals in meer detail beschreven in stap 5.2.

5. Microtensile Testen van Implant Monsters

1. Om na explantatie opslaat, moet de tester microtensile volledig klaar om het implantaat monster vóór implantatie accepteren, zoals beschreven in stap 4.4.
2. Onmiddellijk na explantatie, laadt het monster tussen de twee sets microtensile tester klemmen. Omdat de steekproef is gemonteerd op een acryl houder ontworpen om te dienen als de bovenste helft van een klem, plaatst het implantaat monster montage op de mobiele grip, monster naar beneden. Het is belangrijk dat het monster wordt aangebracht dat stam applied alleen langs de lengte van de probe te voorkomen dat er torsie op het monster tijdens de test. Als zodanig moet het monster worden aangebracht op het midden van elke klem, en de klemmen moet vlak liggen ten opzichte van elkaar.
3. Stel het monster zodanig dat de afstand tussen de klemmen is 3,0 mm, en het uiteinde van de sonde wordt in de vaste klem. Deze lengte 3,0 mm tussen klemmen is de lengte tussen het monster en worden gebruikt in latere berekeningen om de druk op het monster.
4. Onmiddellijk na het beveiligen van het monster tussen twee klemmen en binnen 2 min explantatie van neuraal weefsel, activeert de motor in de trekrichting van de langwerpige monster met een constante snelheid (10 um / sec hier gebruikt), terwijl gelijktijdig meten en registreren van de rek van het monster (met een verplaatsing indicator, Mitutoyu 543-561) en bijbehorende kracht (met een load cell, Transducer Techniques MDB-2.5) nodig om het monster stam.
5. Stop het microtensile proef op mechanisch falen van het monster, of wanneer het einde van de aandrijfstang meetbereik. Exporteer de verzamelde gegevens, en het uitvoeren van data-analyse.
6. Herhaal microtensile testen voor elk monster en / of elke reeks zijn uitgevoerd (inbrengtijd).

6. Data Analysis

1. De ruwe data rek de ingenieursnotatie stam door het afstand rek van de oorspronkelijke meetlengte, zoals beschreven in Vergelijking 1, waarbij ε wordt de aangebrachte spanning, t de tijd toegepast op het implantaat monster, d de verplaatsing gemeten door de micrometer indicator en L ₀ is de aanvankelijke lengte van het monster:
   (1)
2. De ruwe kracht gegevens aan de techniek spanning op het monster om te zetten door het verdelen van de kracht (in Newton), door de transverse doorsnede, zoals in Vergelijking 2:
   (2)
   waarin σ de spanning op het monster, F de kracht gemeten door de load cell (in Newton), w ₀ is de oorspronkelijke dikte van het monster, en t ₀ is de initiële dikte van het monster.
3. Zet de spanning (σ [t]) tegen stam (ε [t]) curve voor elk monster met een computerprogramma, zoals Microsoft Excel.
4. Isoleer de lineaire elastische gedeelte van het perceel en het gebruik van software-gebaseerde curve fitting gereedschap om de beste pasvorm lijn om dit gedeelte te vinden. De helling van de best passende lijn komt overeen met de Young's modulus van het monster. Het geïsoleerde gedeelte van de curve moet ten minste 10 spannings-/rekdiagrammen punten, en moet worden genomen van het deel van het perceel waarin de helling het grootst.
5. Voor cyclische testen wordt de Young's modulus moeten worden voor elke cyclus. Dit kan worden geautomatiseerd of handmatig uitgevoerd.
6. Voor de cyclische test, plot van de Young's modulus van elke cyclus versus tijd. Dit geeft aan hoe de gemeten modulus tijd verandert, wat wijst op hoe snel een setup monster nat of droog.
7. Voor monsters implantaat elk monster en de tijd van het implantaat komt overeen met een cyclus van het cyclisch testen. Meet de Young's modulus volgens de hierboven beschreven voor elk monster implantatie procedure.
8. Plot de Young's modulus versus implantaat tijd. Op dit punt kunnen vergelijkingen worden gemaakt benchtop onderzoeken, enz.

Results

De mechanische eigenschappen van bijna alle polymere materialen, waaronder onze PVAc-NC, afhankelijk bij blootstelling aan omgevingsomstandigheden. Het meest opvallend is, deze omvatten de blootstelling aan hitte en vocht. Wanneer een materiaal wordt weekgemaakt door vochtopname of ondergaat een thermische overgang, wordt een vermindering van Young's modulus. Bij het ​​bereiden van de vocht-en temperatuur-gecontroleerde omgeving voor ex vivo monster mechanische karakterisatie, is het belangrijk dat er minim...

Discussion

De vooruitgang van de biomedische implanteerbare micro-elektromechanische systemen (bioMEMS) voor interactie met biologische systemen is het motiveren van de ontwikkeling van nieuwe materialen met hoog-op maat gemaakte eigenschappen. Sommige van deze materialen zijn ontworpen om een ​​verandering in materiaaleigenschappen vertonen in reactie op een stimulus in de fysiologische omgeving. Een recent ontwikkelde klasse van materialen aan de aanwezigheid van waterstofbruggen vormende vloeistoffen (bijv. water) en v...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon wafer	University Wafer		Mechanical grade
Extruded acrylic sheet	Professional Plastics	SACR 062EF	Dikte 0.062"
Razor blade	McMaster-Carr	3962A3
Tweezers	McMaster-Carr	8384A47	#5 tip
Super Glue Gel	Loctite	130380
Air Brush	Snap-on Industrial	BF175TA
Air Compressor	Paasche	B002YKN8YO	D500
Thermocouple	Omega	HH12A
Hot plate	Cimarec	SP131325Q
CO2 direct-write laser	VersaLaser	3.5
Dessicator	Fisher Scientific	08-595
Lamp			op maat gebouwd
Microtensile tester			op maat gebouwd