Het volgende protocol biedt technieken voor het inkapselen van pancreatische β-cellen in stap-groei PEG-peptide hydrogels gevormd door thiol-een foto-click reacties. Dit materiaal platform niet alleen een cytocompatible micro voor cel inkapseling, maar maakt ook de gebruiker gecontroleerde snelle herstel van celstructuren gevormd binnen de hydrogels.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie en terugwinning van β-cel sferoïden Van Step-groei PEG-peptide Hydrogelen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hydrogelen hydrofiele verknoopte polymeren die een driedimensionale micro met weefsel-achtige elasticiteit en hoge permeabiliteit voor het kweken van therapeutisch relevante cellen of weefsels te verschaffen. Hydrogelen bereid uit poly (ethyleenglycol) (PEG) derivaten worden steeds meer gebruikt voor een verscheidenheid van tissue engineering toepassingen, mede dankzij hun afstembare en cytocompatible eigenschappen. In dit protocol, gebruikten we thiol-stap-groei photopolymerizations aan PEG-peptide hydrogels fabriceren voor het inkapselen pancreas MIN6 b-cellen. De gels werden gevormd door 4-arm PEG-norborneen (PEG4NB) macromeer en een chymotrypsine-gevoelige peptide crosslinker (CGGYC). De hydrofiele en aangroeiloze aard van PEG biedt cytocompatible micromilieu voor celoverleving en proliferatie in 3D, terwijl het gebruik van chymotrypsine-gevoelige peptidesequentie (C GGY ↓ C, pijl enzym klievingsplaats, terwijl klem cysteeine residuen werden toegevoegd voor thiol-crosslinking) maakt snel herstel van celpreparaten vormt binnen de hydrogel. De volgende protocol uitgewerkt technieken: (1) inkapseling van MIN6 β-cellen in thiol-hydrogels, (2) Kwalitatieve en kwantitatieve cellevensvatbaarheidsassays bepalen celoverleving en proliferatie (3) Herstel van cel Steroiden met chymotrypsine-gemedieerde gel erosie, en (4) Structurele en functionele analyse van de gerecupereerde sferoïden.
Inleiding
Hydrogelen hydrofiele verknoopte polymeren uitzonderlijk potentieel steigers materialen voor reparatie en regenererende weefsels. 1-3 De hoge watergehalte van hydrogels maakt eenvoudige diffusie van zuurstof en uitwisseling van voedingsstoffen en cellulaire metabole producten, die cruciaal zijn voor handhaving van cellevensvatbaarheid. Bovendien hydrogelen uitstekende dragers voor gecontroleerde afgifte en cel productietijd wegens hun hoge tunability. Twee synthetische hydrogels zoals die bereid uit poly (ethyleenglycol) (PEG) worden steeds meer gebruikt in tissue engineering toepassingen, voornamelijk vanwege hun cytocompatibility, weefsel- zoa....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
A. macromeer en Peptide Synthesis
- Synthetiseren 4-arm PEG-norborneen (PEG4NB) en foto-initiator Lithium arylphosphanate (LAP) met behulp van vastgestelde protocollen. 18,19
- Synthetiseren bis-cysteine bevattende chymotrypsine-gevoelige peptide CGGY ↓ C (pijl geeft chymotrypsine splitsingsplaats) onder toepassing van standaard vaste fase peptide synthese in een magnetron peptide synthesizer (CEM Discover SPS).
- Bereken de hoeveelheid hars (Rink-amide MBHA hars) nodig gebaseerd op de vervanging verhouding van de hars en de synthese schaal. Zwellen de hars in dimethylformamide (DMF) in een reactievat (RV) gedurende....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuren 1-4 tonen representatieve resultaten voor inkapseling, overleving, proliferatie, vorming sferoïdaal en sferoïde herstel van thiol-hydrogels. Figuur 1 toont schematisch de reactie van (1) stap-groei thiol-fotopolymerisatie met PEG4NB en CGGYC en ( 2) chymotrypsine gemedieerde gel erosie die een erosie mechanisme volgt. figuren 2 en 3 aanwezig levensvatbaarheid resultaten met Live / Dead kleuring en AlamarBlue assay. We merken op dat cellen .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De beschreven protocol bevat details over eenvoudige inkapseling van cellen in thiol-hydrogelen gevormd door stap-groei fotopolymerisatie. Terwijl een stoichiometrische verhouding van 1:1 van norborneen met thiol functionele groepen werd in dit protocol kan de verhouding worden aangepast afhankelijk van de experimenten. Naast een juiste formulering is belangrijk om homogeniteit in de pre-polymeeroplossing. Met name het gebruik zacht pipetteren opdat cellen zijn goed verdeeld in de pre-polymeeroplossing om klonteren voor.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit project werd gefinancierd door NIH (R21EB013717) en IUPUI OVCR (RSFG). De auteur dankt mevrouw Han Shih voor haar technische bijstand.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| 4-arm PEG (20 kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-aminozuren | Anaspec | ||
| Live / Dead levensvatbaarheid van de cellen kit | Invitrogen | L3224 | Inclusief Calceïne AM en ethidiumhomodimeer-1 |
| AlamarBlue reagens | Abd Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagens | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Zonder Ca +2 en Mg +2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | ZonderCa +2 en Mg +2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotica-Antimycoticum | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsine-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsine-free α-chymotrypsine | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Muis Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml wegwerpspuit | BD Biosciences |
Referenties
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
