Experimentele methoden voor het testen van de effecten van Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Tegen Alcohol-geïnduceerde apoptose tijdens de zwangerschap in C57BL / 6 muizen

Samenvatting

De experimentele ontwerpen voorgesteld hier richten op het bestuderen van de effecten van blootstelling aan alcohol in apoptose en de toepassing van neurotrophic peptide tijdens de zwangerschap in de foetale hersenen. Een gedetailleerde beschrijving van de kweek tot de verzameling van foetale hersenen beschreven. Technieken voor de bepaling van apoptose nader omschreven.

Samenvatting

Experimentele ontwerpen voor onderzoek naar de effecten van prenatale blootstelling aan alcohol tijdens de vroege embryonale stadia in de groei van de foetus hersenen zijn uitdagend. Dit is vooral te wijten aan de moeilijkheid van microdissectie van foetale hersenen en het snijden voor het bepalen van apoptotische cellen door prenatale blootstelling aan alcohol. De hier beschreven experimenten geven gevisualiseerd technieken muizen fokken tot de identificatie van celdood in foetaal hersenweefsel. Deze studie gebruikte C57BL / 6 muizen als diermodel voor de studie van foetaal alcohol blootstelling en de rol van trofische peptide tegen alcohol-geïnduceerde apoptose. De kweek bestaat uit een 2-uur venster matten om de exacte fase van de embryonale leeftijd. Een gevestigde foetale model alcoholblootstelling is gebruikt in deze studie om de effecten van prenatale blootstelling aan alcohol in foetale hersenen bepalen. Het gaat om de vrije toegang tot alcohol of paargevoede vloeibaar dieet als de enige bron van voedingsstoffen voor de zwangere muizen.

Voor het onderzoeken van apoptose, worden foetale hersenen eerst ingebed in gelatine met behulp van een schil-weg mal om hun snijden met een vibratome apparatuur te bevorderen. Foetale hersenen ingebed en gefixeerd in paraformaldehyde zijn gemakkelijk doorgesneden, en de vrij zwevende secties kunnen in superfrost plus dia's worden gemonteerd voor bepaling van apoptose of celdood.

TUNEL (TdT-gemedieerde dUTP Nick End Labeling; TdT: terminal deoxynucleotidyltransferase) assay werd gebruikt om celdood of apoptotische cellen te identificeren. Het is opmerkelijk dat apoptosis en celgemedieerde cytotoxiciteit wordt gekenmerkt door DNA fragmentatie. Dus de gevisualiseerde TUNEL-positieve cellen indicatief celdood of apoptotische cellen.

De experimentele ontwerpen hier vindt u informatie over het gebruik van een gevestigde vloeibaar dieet voor het bestuderen van de effecten van alcohol en de rol van de neurotrofe peptiden tijdens de zwangerschap in de foetale hersenen. Het gaat om het fokken en voederen zwangere muizen, microdissecting foetale hersenen, en het bepalen van apoptose. Samen kunnen deze visuele en tekstuele technieken een bron voor het onderzoeken van prenatale blootstelling aan schadelijke stoffen in de foetale hersenen zijn.

Inleiding

Het doel van het hier beschreven experimentele methoden is om de neuroprotectieve effecten van trofische peptiden beoordelen in een foetale blootstelling model alcohol met behulp van verschillende technieken met fokkerij, voeding, microdissecting, en het opsporen van celdood. Werken vanuit ons laboratorium heeft betrekking op een vloeibaar dieet gemengd met alcohol als een model van matig alcohol drinken, die vergelijkbaar is met een menselijke paradigma drinken in termen van de hoeveelheid alcohol kan zijn geconsumeerd ^1-5. Wij en anderen hebben drie peptide derivaten die neuroprotectieve tegen de schadelijke effecten van blootstelling foetaal alcohol geïdentificeerd. Onderzoeken naar blootstelling aan alcohol tijdens de embryonale stadia die dierlijke modellen kunnen leiden tot de identificatie van potentiële mechanismen van neuroprotectie en zorgen voor de ontwikkeling van de interventie procedures. Dit kan voldoende informatie over de neuroprotectieve effecten en verzwakking van de schadelijke effecten van blootstelling aan alcohol tijdens de zwangerschap verschaffen.

Mogelijke preventie van de effecten van prenatale alcohol kan de behandeling van zwangere muizen met peptiden die zijn getoond te zijn betrokken bij neuroprotectie in vitro en in vivo ^{6,7 1,2,4,8,9} betrekken. Onder deze peptiden, is SALLRSIPA, bekend als ADNF-9 of SAL, afgeleid van de activiteit-afhankelijke neurotrophic factor (ADNF) ^7,10. Ander peptide met de sequentie NAPVSIPQ peptide, genoemd NAP, afgeleid van de activiteit-afhankelijke neuroprotectief eiwit (ADNP) ^6,11, toonde een krachtige beschermende werking tegen oxidatieve stress in verband met blootstelling aan alcohol ^12,13. Bovendien hebben we recent geïdentificeerde een nieuw peptide gesynthetiseerd, colivelin dat blijkt een belangrijke neuroprotectieve rol in de foetale alcoholblootstelling model ^2. Colivelin is samengesteld uit ADNF-9 en AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). Het belang van het gebruik van deze peptiden is dat ze de mogelijkheid omsteek de hersen-bloed barrière om de effecten van alcohol-geïnduceerde apoptose en de hersenen tekorten groei te voorkomen.

De experimentele methoden C57BL / 6 muizen voor het testen van de neuroprotectieve effecten tegen alcohol-geïnduceerde apoptose. Wij hebben een 2-uur-venster in plaats van 's nachts fokken om nauwkeurig inschatten van de embryonale dag 0 (E0), als het kan onthuld worden door detectie van een zaadcel plug en vaginaal uitstrijkje ^1-5 aangenomen. We hebben gebruik gemaakt van een vloeibaar dieet met voeding buizen, omdat dit wordt beschouwd als gratis toegang in plaats van levering van alcohol door middel van sondevoeding route, die spanning kunnen veroorzaken aan zwangere muizen. Anderzijds kan microdissectie een uitdaging vanwege de zachtheid van het foetaal hersenweefsel, die zouden kunnen optreden bij het ontleden foetale hersens vroege embryonale stadia. Hier laten we zien gevisualiseerd technieken om te gaan met alle uitdagingen met betrekking microdissection. Aangezien de foetale hersenen snijden ook kan lastig zijn, hebben we aangenomeneen techniek die inhoudt dat het verankeren van de foetale hersenen in gelatine met behulp van peel-away inbedding mallen. We zijn succesvol geweest bij het terugdringen van de foetale hersenen in vrij zwevende secties 50 micrometer dik. Dit stelt ons in staat om wijzigingen van eiwitgehalte onderzoeken in foetale hersenen secties, waaronder de identificatie van celdood.

Protocol

1. Dieren Fokkerij en Trofische Peptide behandeling

1. Breed C57BL/mice door het plaatsen van de vrouwelijke muizen (~ 6 weken oud, gemiddeld gewicht 20 gram) in mannelijke huis kooien voor 2 uur.
2. Controleer voor een zaadcel stekker en / of vaginaal uitstrijkje onmiddellijk daarna.
3. Indien positief, wijzen dit tijdstip als embryonale dag 0 (E0).
4. Op E7, gewicht-match drachtige vrouwtjes om de controle en behandeling groepen (3 groepen) worden toegewezen zoals recent beschreven ^4: 1) Alcohol (ethanol) vloeibaar dieet groep (ALC); 2) paarsgewijs gevoerde controlegroep (PF); 3) Peptide behandelgroep, die intraperitoneale (ip) injectie van ADNF-9 peptide moeten krijgen naast de blootstelling aan alcohol vloeibaar dieet (ALC/ADNF-9). De details van de voorbereiding van de ALC en PF diëten en de procedure van het ip-injecties kan worden gevonden in onze recente werk ^4.
5. Meet dagelijks alcohol vloeibaar dieet dat kan worden geleverd als gratis toegang als de enige bron van voedingsstoffen. PF vloeibaar dieet individueel t juko een ALC dam kan dagelijks worden gemeten als goed.
6. Het volume van de vloeibare voeding verbruikt tijdens de voorafgaande 24 uur kan worden opgenomen uit 30-ml afgestudeerd schroefdop buizen en vers bereide voeding moet dagelijks worden verstrekt vanaf E7 tot E13.

2. Dissectie van Foetussen en Microdissectie van Foetale Brains

1. Offeren zwangere muizen op E13 door diep euthanizing de muizen met een CO ₂ procedure gevolgd door een cervicale dislocatie.
2. Reinig de abdominale plaats van incisie met 70% ethanol.
3. Maak een abdominale incisie met steriele schaar en pincet.
4. Zodra de buik open is, ontleden uit de baarmoeder door vast te houden met een pincet en het gebruik van de andere tang om de mesometrium weg van de baarmoeder scheurt. Zorg ervoor dat u deze procedure langzaam te doen om te voorkomen dat aanprikken van de embryo's.
5. Verwijder het embryo uit de baarmoeder en breng ze in een celkweek schotel (60 mm x 15 mm) met Hanks 'Balanced Salt oplossing (HBSS) in ijskoud water.
6. Ontleden foetale hersenen van de gehele embryo's onder stereomicroscoop voor microdissection.
7. Met behulp van ultra-fijne tang voor microdissection, trek de huid van de embryo's in het bovenste gedeelte van het hoofd tot de schedel bloot te leggen.
8. Zodra de schedel bloot en duidelijk zichtbaar onder de stereomicroscoop microdissectie, trek het schedel vanaf het achterste deel van de hersenen in het ruggenmerg en de hersenstam gebieden.
9. Zorg ervoor dat u afpellen van de schedel stuk voor stuk van posterior naar anterior delen van het hoofd.
10. Zodra foetale hersenen visueel worden blootgesteld, doorgaan met het extraheren van hen.
11. Ontleden de foetale hersenen van de basis van de primordium bulbus olfactorius aan de basis van de metencephalon.
12. Postfix alle ontleed foetale hersenen in 4% paraformaldehyde voor 2-3 dagen. U kunt ook invriezen andere foetale hersenen van elke dam als je ze testen voor Western blot of enzymatische assays.

nt "> NB: De procedures voor het dier toepassingen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Toledo, die in overeenstemming zijn met de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite op de National Institutes of Health en de Gids voor de zorg en gebruik van proefdieren.

3. Inbedding Foetale Brains in Gelatine voor Snijden

1. Bereid 10% van gelatine leerjaar A.
2. Vul een peel-away inbedding schimmel halverwege en wacht tot de gelatine stolt.
3. Controlesystemen en prenataal behandelde foetale hersenen naast elkaar bovenop de gestolde gelatine. Dit is om vaste condities van immunodetectie van celdood houden tussen zowel de controle-en experimentele groepen.
4. Voeg vloeibare gelatine op de top van de foetale hersenen om een ​​compleet mal te maken (zorg ervoor dat de gelatine niet te heet).
5. Koel de bereide gelatine schimmel die foetale hersenen houdt gedurende 15 minuten.
6. Afschillende inbedding mal plastic en vervolgens over de pre-made gelatinehoudende foetale hersenen in 4% paraformaldehyde voor twee dagen.
7. Plaats en deel gefixeerd foetale hersenen in gelatine met behulp vibratome snijden machine (Leica VT 1000S) bij 50 micrometer dik voor coronale coupes. Deze dikte wordt getest in onze studies omdat het een betere anatomische kenmerken. Bovendien dikten van 25 urn en groter kunnen ook getest met deze techniek waarbij ingesloten foetale hersenen in 10% gelatine. Merk op dat coronale secties werden gesneden met behulp vibratome in de basale ganglia eminence niveau op de voorhersenen
8. Verzamel de foetale hersenen secties in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing.
9. Monteer de foetale hersenen secties in Superfrost Plus dia's in het water.
10. Droog de gemonteerde secties voor 15 minuten.
11. Plaats de dia's (gemonteerd met de foetale hersenen secties) in PBS voor de volgende dag het testen van TUNEL reactie.

4. TUNEL Reaction voor Debescherming van de Cell Death of Apoptosis

(TUNEL: TdT-gemedieerde dUTP Nick Einde Labeling; TdT: terminal deoxynucleotidyltransferase). Deze test is bedoeld om celdood te bepalen.

1. Behandel foetale hersenen secties, in Superfrost Plus objectglaasjes met Proteinase K (20 ug / ml) gedurende 5 min bij 37 ° C (300 pl proteinase K gemengd in 20 ml PBS). Dia's worden geassembleerd in 5-Plend geopend maile).
2. Spoel foetale hersenen secties (gemonteerd in dia's) met PBS drie keer voor 5 min onder Orbital shaker.
3. Incubeer de secties met 3% H ₂ O ₂ in methanol gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (3 ml 30% H ₂ O ₂ in 27 ml 100% methanol) (dia mag niet in een shaker).
4. Spoel secties met PBS drie keer voor 5 min in orbitaalschudder.
5. Incubeer secties in permeabilisatie-oplossing (0,1% Triton X-100 in 0,1% natriumcitraat) gedurende 2 minuten op ijs (4 ° C) (100 pl Triton + 0,1 g natriumcitraat + 99,9 ml gedestilleerdd water).
6. Spoel secties in PBS twee keer gedurende 5 min in orbitaalschudder.
7. Droge omgeving secties in de dia.
8. Teken barrière op Superfrost Plus dia's met behulp van PAP Pen. Hiermee moet voorkomen lekken van de oplossing die wordt gebruikt om de secties voor de detectie van TUNEL-positieve cellen te behandelen.
9. Incubeer de secties met TUNEL reactiemengsel (50 pi van fles 1 en 450 pl van fles 2) gedurende 1 uur bij 37 ° C, wordt de knop gebruikt door incubatie in oplossing uit de fles 2.
10. Spoelen met PBS drie keer 5 min onder Orbit shaker.
11. Droge gebied rond weefsel.
12. Incubeer secties met converter-POD gedurende 30 min bij 37 ° C.
13. Spoel de secties driemaal gedurende 5 minuten met Tris-HCl (pH 7,5, 0,05 M).
14. Incubeer de secties gedurende 7 min in 0,05% 3'-3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) en 0,003% H ₂ O ₂ (25 ml Tris HCI, pH 7,5, 0,05 M + 25 gl 3% H ₂ 0 ₂ + 500 pl DAB) Onder Oribtal schudder bij 4 ° C (in ijs) en in het donker (zorg ervoor om deze procedure te doen in nieuwe 5-Plend geopend mailer).
15. Spoel de secties met PBS drie keer 5 min onder Orbital shaker.
16. Houd de dia secties in PBS voor niet meer dan 24 uur in PBS, dan verwerken ze voor Nissl kleuring zoals beschreven in de volgende paragraaf protocol.

Opmerking: DAB is een kankerverwekkende stof. Gebruik handschoenen en reinig alle gerechten gebruikt met het bleekmiddel eenmaal klaar met alle experimenten.

5. Nissl kleuring voor Voorbereiding van de foetale hersenen secties voor Microscopische waarneming

1. Nissl kleuringsprocedure moet worden gedaan in een biologische veiligheid kap.
2. Spoel de dia secties met gedemineraliseerd water gedurende 2 minuten.
3. Incubeer de secties in 70% ethanol gedurende 2 minuten.
4. Incubeer de secties in 95% ethanol gedurende 6 minuten.
5. Incubeer de secties in 70% ethanol gedurende 2 minuten.
6. Spoel de secties in gedeïoniseerd water gedurende 2 minuten.
7. Incubeer de secties in Cresyl Violet Stain gedurende 3 minuten.
8. Spoel de secties in gedemineraliseerd water gedurende 2 minuten.
9. Incubeer de secties in 70% ethanol gedurende 2 minuten.
10. Incubeer de secties in 95% ethanol + 3 ml ijsazijn gedurende 3 minuten.
11. Incubeer de secties in 95% ethanol gedurende 2 minuten.
12. Incubeer de secties in 100% ethanol gedurende 2 minuten driemaal.
13. Incubeer de secties in xyleen gedurende 10 minuten drie keer.
14. Dia's die de foetale hersenen secties kan worden gemonteerd met behulp van Permount en dekglas glasplaatjes.
15. Laat de gemonteerde dia's nachts voorafgaand aan microscopische observatie en analyse.
16. Microscopische observatie en microfiches kunnen worden uitgevoerd onder Leica microscoop rechtop.

Resultaten

De experimentele methoden hier beschreven tonen aan dat een 2-uur-venster fokken is van essentieel belang om in te schatten nauwkeurige zwangerschapsduur podium. We hebben de dissectie van de embryo's gedemonstreerd op de leeftijd van E13. We hebben ook aangetoond microdissection van foetale hersenen bij E13. De procedure meerdere fasen (ac), zoals beschreven in figuur 1. Foetale hersenen worden ontleed uit de basis van de primordium bulbus olfactorius aan de basis van de metencephalon (figu...

Discussie

De en-technieken die in deze studie tonen de effecten van prenatale blootstelling aan alcohol in foetale hersenen en de rol van trofische peptiden in de preventie van deze effecten. Deze kunnen informatie over hoe u andere drugs van misbruik of andere giftige chemicaliën in de foetale hersenen tijdens de verschillende stadia zwangerschap bestuderen bieden.

Met betrekking tot het paradigma kweken, in sommige gevallen de detectie van het sperma stekker mogelijk niet waarneembaar. Op dit moment...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Superfrost Plus Slides	VWR	48311-703
PAP PEN	Research Products Int. Corp.	195506
5-Plend Open Mailer	Heathrow Scientific, LLC	HS 15983G
Peel away embedding molds	Electron Microscopy Sciences	70182
In situ cell death detection kit, POD	Roche Diagnostics, Inc	11684817910
Hanks' Balanced Salt Solution	Invitrogen	14170-120
Gelatin Type A	FisherScientific	G8-500
Stereomicroscope	W. NUHSBAUM, Inc	Leica M60, KL 200 LED
Micro-Vibratome	Leica, Inc	Leica VT 1000S
Moria Ultra Fine Forceps	Fine Science Tools	11370-40	2 paar
Graduate 30 ml feeding tubes	Dyets, Inc	900012
Vitamin Mix	Bio-Serv. Inc.	F8031
Mineral Mix	Bio-Serv. Inc.	F8598
Maltose Dextrin	Bio-Serv. Inc.	3650
Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons	111000190-SS05	Pharmco-AAPER
Upright microscope	W. NUHSBAUM, Inc	LEICA DM 4000