Dit artikel geeft een gedetailleerde en visuele beschrijving van een methodologie voor het verzamelen en meten van biochemische inflammatoire en nociceptieve bemiddelaars op de chirurgische wond na keizersnede. Deze menselijke bioassay werd gebruikt om correlaties tussen wond en serum cytokine concentraties en drug-gemedieerde veranderingen in wond cytokines, chemokines en neuropeptiden bepalen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het verzamelen van en het meten van wondexsudaat Biochemische Mediators In chirurgische wonden
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
We beschrijven een methode waarmee we kunnen verzamelen en biochemische inflammatoire mediatoren en nociceptieve meten op de chirurgische wond. Het verzamelen van site-specifieke biochemische markers belangrijk om te begrijpen van de relatie tussen niveaus in serum en chirurgische wond vast die associaties tussen mediatorafgifte, pijn, pijnstillend gebruik en andere uitkomsten van belang, en evalueren van het effect van systemische en perifere toediening van het geneesmiddel op chirurgische wonden biochemie. Deze methodologie is toegepast op gezonde vrouwen die een electieve keizersnede met spinale anesthesie. We hebben gemeten wondexsudaat en serum mediators op dezelfde tijdsintervallen als pijnpatiënt scores en analgetica verbruik tot 48 uur na keizersnede. Met deze methode hebben we verschillende biochemische mediatoren waaronder nerve growth factor (NGF), prostaglandine E2 (PG-E2) substance P, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7 detecteren, IL-8,IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFa, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 en MIP-1β. Studies van dit menselijk wond bioassay hebben geen correlaties tussen wond en serum cytokine concentraties of de time-afgifteprofiel (J Pain 2008;. 9 (7) :650-7) 1 wij gedocumenteerd de bruikbaarheid van de techniek te identificeren. drug-gemedieerde veranderingen in de wond cytokine-inhoud (Anesth Analg 2010; 111:1452-9). 2
Inleiding
Na een chirurgische incisie, verblijvende en migrerende ontstekingscellen vrij pro-en anti-inflammatoire cytokines, prostanoïden, neuropeptiden en chemokines die belangrijk zijn voor het initiëren en onderhouden pijn. 3,4 De mogelijkheid om site-specifieke biochemische markers verzamelen is essentieel voor het bepalen tussen niveaus in serum en chirurgische wond begrijpen complexe relatie tussen mediatorafgifte en chirurgische pijn en kunnen het effect van zowel systemische als perifere toediening evalueren operatiewond biochemie. Studies gericht op systemische metingen van biochemische mediators en niet als plaats-specifieke afgifte. 5,6 Serum metingen van cytokines en chemokines hoeft niet representatief voor lokale operatiewond biochemische gebeurtenissen en slechts dan een globale systemische reactie op chirurgische letsel. Dit artikel geeft een gedetailleerde en unieke visuele beschrijving van deze methodiek dat was sparst waarnaar verwezen wordt in 2008 in de Journal of Pain. 1 Het doel van deze Jove artikel is om een unieke en visueel verbeterde beschrijving van de methoden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Studie protocol
- Verkrijgen van Institutional Review Board goedkeuring en schriftelijke informed consent.
- Selecteer een geschikte chirurgische populatie voor onderzoek uit te voeren. Deze methodologie is alleen van toepassing op keizersnede wonden, maar de meeste chirurgische wonden passend zou zijn.
- Overweeg in-en exclusiecriteria voor uw deelname aan het onderzoek. Patiënten en procedures met hoge tarieven van chirurgische wondinfectie wellicht niet geschikt.
- Standaardiseren anesthesie en postoperatieve behandeling voor alle patiënten om potentiële confounders te voorkomen.
2. Nociceptieve en inflammatoire Biochemische Middelaar Collection
- Plaats de ON-Q PainBuster met ON-Q SilverSoaker (I-Flow, Lake Forest, CA) in de onderhuidse laag vlak voor sluiting (andere weefsellagen kan worden beschouwd) gewikkeld. De ON-Q PainBuster Pain Relief System levert continu fysiologisch zout met een snelheid van 2 ml / uur. De drager kan kamINED met of tegen drugs van belang, zoals een lokaal anestheticum en niet-steroïdale anti-inflammatoire middelen.
- Voorzien van een standaard driewegkraan in dit systeem om aspiratie van wondvocht kan op bepaalde tijdstippen. De continue infusie catheter voorkomt stolling en verbetert de betrouwbaarheid van het systeem om exsudaat monsters. Als aspiratie van exsudaat is moeilijk (ongeveer 5% van de gevallen), kunt u overwegen te duwen zachtjes boven de wond, het veranderen van het onderwerp positie (bijvoorbeeld, zitten de patiënt omhoog of liggend ze plat), met behulp van een 0,5-1 ml normale fysiologische zoutoplossing spoelen of intrekking van de katheter 1-2 cm.
- Op tijdstippen bepaald door het protocol (bijvoorbeeld, 1, 4, 6, 24, en 48 uur na de keizersnede), zuigen en trekken 1 ml wondvocht. Breng het exsudaat in een polyethyleen cup met 30 ul proteinase inhibitor. We hebben gebruikt Compleet Proteinase Inhibitor (Roche Bioscience, Palo Alto, CA) voor onze doeleinden.
- Op dezelfde tijdsintervallen door de studie protocol, verzamel 10 ml bloed. We hebben gebruik gemaakt van een bloedafname buis met lithium heparine; aan onze instelling is dit een groen-bedekte glazen buis. Een extra 300 ul proteinase inhibitor in de bloedmonsters.
- Binnen 1 uur van het verzamelen, zet monsters op ijs en gecentrifugeerd bij 3000 rpm gedurende 10 minuten.
- Verwijder serum en wond bovenstaande vloeistof en doe dit in een standaard microcentrifugebuis en bewaar bij -20 ° C.
3. Assay Analyse
- Zodra alle studie exsudaat en serummonsters worden verzameld en opgeslagen, ontdooien en analyse van deze monsters tegelijk.
- We hebben gemeten cytokines en chemokines met een multiplex immunoassay. De multiplex immuno-assay techniek laat ons toe assay vele analyten van kleine (50 pl) volumemonsters. De multiplex produceren resultaten vergelijkbaar met deze van ELISA. We hebben de 17-plex Bio-PlexTM systeem (BioRad, Hercules, CA) voor de analyse. Deze test kan meten tumor necrosis factor α (TNFa), interferon α (INFα), interleukine 1β (IL-1β), interleukine 2 (IL-2), interleukine-4 (IL-4), interleukine 5 (IL-5 ), interleukine 6 (IL-6), interleukine 7 (IL-7), interleukine 8 (IL-8), interleukine (IL-10), interleukine 12 (IL-12), interleukine 13 (IL-13), interleukine 17 (IL-17), granulocyt kolonie stimulerende factor (G-CSF), granulocyt-macrofaag kolonie stimulerende factor (GM-CSF), monocyt chemoattractant eiwit 1 (MCP-1) en macrofaag ontstekingsproteïne 1 (MIP-1β). Nerve growth factor werd gemeten met NGF DY256 antilichaam toe te voegen aan de 17-plex plaat met de Bio-Plex amine koppeling kit.
- Om een goede analyse van de kwaliteit te garanderen, moeten elke meting worden uitgevoerd in tweevoud. Standaardcurven voor elk analyt zijn gegenereerd met verwijzing analyten door de fabrikant (bij concentraties van 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3.200 pg / ml pluseen nul standaard voor de fysiologische zoutoplossing). Standaard curven worden opgenomen in elke run en concentraties in het monster worden berekend met Bio-Plex Manager-software.
- Substance P en prostaglandine E2 werden gemeten met behulp van zeer gevoelige ELISA kits. We hebben gebruikt Assay Designs, Inc (Ann Arbor, Michigan) voor deze analyse. Analyses uitvoeren in tweevoud volgens specificatie van de fabrikant.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met deze methode hebben we kunnen alle biochemische mediators hierboven beschreven, met uitzondering van IL-5 in wondexsudaat en plasma gedetecteerd. 1,2 Enkelen cytokines werden niet gedetecteerd in plasma (IL-4, IL-17, TNFa, INFγ , GM-CSF). 1 Het tijdsverloop van de gemeten cytokines en chemokines in de gerapporteerde studies consistent waren, het bereiken van een plateau in de eerste uren dat werd volgehouden voor de 24 uur observatieperiode .. 1,2 Echter, NGF gestaag toegenomen in de...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze methodologie hierboven beschreven is gebleken is gevoelig genoeg om biochemische inflammatoire mediatoren en nociceptieve detecteren wondvocht. Bemonstering op verschillende tijdstippen heeft ook ons toegestaan om veranderingen van deze mediatoren in de tijd. 1,2 Wij zijn niet op de hoogte van andere menselijke operatiewond test die serieel kan meten het afgifteprofiel van inflammatoire en nociceptieve mediatoren in chirurgische wond exsudaat te observeren. Resultaten van onze methodiek wondexsudaat co...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dr Carvalho's werk werd ondersteund door een onderzoekssubsidie van het Office of Research on Women's Health en National Institute of Child Health and Human Development van de National Institutes of Health (5K12 HD043452). Dr Angst levert (On-Q PainBuster Post-Op Pain Relief System) en fondsen (voor de biochemische assays) ontvangen van I-Flow (Lake Forest, Californië).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Referenties
- Carvalho, B., Clark, D. J., Angst, M. S. Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. J. Pain. 9, 650-657 (2008).
- Carvalho, B., Clark, D. J., Yeomans, D. C., Angst, M. S. Continuous subcutaneous instillation of bupivacaine compared to saline reduces interleukin 10 and increases substance P in surgical wounds after cesarean delivery. Anesth. Analg. 111, 1452-1459 (2010).
- Verri, W. A., Cunha, T. M., Parada, C. A., Poole, S., Cunha, F. Q., Ferreira, S. H. Hypernociceptive role of cytokines and chemokines: targets for analgesic drug development. Pharmacol. Ther. 112, 116-138 (2006).
- Watkins, L. R., Maier, S. F. Immune regulation of central nervous system functions: from sickness responses to pathological pain. J. Intern. Med. 257, 139-155 (2005).
- Beilin, B., Bessler, H., Mayburd, E., Smirnov, G., Dekel, A., Yardeni, I., Shavit, Y. Effects of preemptive analgesia on pain and cytokine production in the postoperative period. Anesthesiology. 98, 151-155 (2003).
- Wu, C. T., Jao, S. W., Borel, C. O., Yeh, C. C., Li, C. Y., Lu, C. H., Wong, C. S. The effect of epidural clonidine on perioperative cytokine response, postoperative pain, and bowel function in patients undergoing colorectal surgery. Anesth. Analg. 99, 502-509 (2004).
- Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2006).
- Kristiansson, M., Soop, M., Sundqvist, K. G., Soop, A., Suontaka, A. M., Blomback, M. Local vs. systemic immune and haemostatic response to hip arthroplasty. Eur. J. Anaesthesiol. 15, 260-270 (1998).
- Liu, S. S., Richman, J. M., Thirlby, R. C., Wu, C. L. Efficacy of continuous wound catheters delivering local anesthetic for postoperative analgesia: a quantitative and qualitative systematic review of randomized controlled trials. J. Am. Coll. Surg. 203, 914-932 (2006).
- Eriksson, A. S., Sinclair, R., Cassuto, J., Thomsen, P. Influence of lidocaine on leukocyte function in the surgical wound. Anesthesiology. 77, 74-78 (1992).
- Clark, J. D., Shi, X., Li, X., Qiao, Y., Liang, D., Angst, M. S., Yeomans, D. C. Morphine reduces local cytokine expression and neutrophil infiltration after incision. Mol. Pain. 3, 28(2007).
- Webb, S. T., Ghosh, S. Intra-articular bupivacaine: potentially chondrotoxic. Br. J. Anaesth. 102, 439-441 (2009).
- Scott, N. B. Wound infiltration for surgery. Anaesthesia. 65, Suppl . 1. 67(2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
