Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de Endotheliale Kalende haarvaten met Atomic Force Microscopy

Graham Marsh; Richard E. Waugh

doi:10.3791/50163

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de Endotheliale Kalende haarvaten met Atomic Force Microscopy

13K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50163

⸱

21 februari 2013

Graham Marsh¹ , Richard E. Waugh¹

¹Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

In dit artikel

Samenvatting

De mechanische eigenschappen van endotheliale glycocalyx gemeten door inkeping met micron bollen op AFM uitkragingen. Endotheelcellen werden gekweekt in een aangepaste kamer onder fysiologische voorwaarden stroom glycocalyx expressie te induceren. De gegevens werden geanalyseerd met een dunne film model de glycocalyx dikte en modulus te bepalen.

Samenvatting

Ons begrip van de interactie van leukocyten en de vaatwand tijdens leukocyt capture wordt beperkt door een onvolledig begrip van de mechanische eigenschappen van het endotheeloppervlak laag. Het is bekend dat adhesiemoleculen op leukocyten zijn niet gelijkmatig ten opzichte oppervlaktopografie ³ verdeeld, dat topografie beperkt lijmverbinding formatie met andere oppervlakken ^9, en fysiologische contactkrachten (≈ 5,0 tot 10,0 per microvillus pN) kan de microvilli comprimeren als slechts een derde van hun lengte rusten, de toegankelijkheid van moleculen aan het tegenoverliggende oppervlak ^{3, 7.} We beschouwen het endotheel als een twee-lagen structuur, de betrekkelijk stijve cellichaam, plus de glycocalyx, een zachte beschermende suiker coating op het luminale oppervlak ^6. Het is aangetoond dat de glycocalyx kan fungeren als een barrière om de hechting van leukocyten verminderen aan het endotheliale oppervlak ^4.In dit rapport hebben we beginnen met de vervormbaarheid van endotheliale oppervlakken aan te pakken om te begrijpen hoe de endotheliale mechanische stijfheid kunnen bindingsvorming beïnvloeden. Endotheliale cellen gekweekt in statische cultuur spreken zich niet uit robuust glycocalyx, maar cellen gekweekt onder fysiologische stromingscondities beginnen een benadering van de glycocalyx waargenomen in vivo ^2. De modulus van de endotheelcellen lichaam is gemeten met behulp van atomic force microscopie (AFM) om ongeveer 5 tot 20 kPa ^5. De dikte en structuur van de glycocalyx werden bestudeerd met elektronenmicroscopie ⁸ en de modulus van de glycocalyx is benaderd door indirecte methoden, maar voor zover wij weten, zijn er geen gepubliceerde verslagen van een directe meting van de glycocalyx modulus in levende cellen . In deze studie presenteren we inkeping proeven met een nieuwe AFM probe op cellen die zijn gekweekt in omstandigheden hun glycocalyx expressie maximaliseren make directe metingen van de modulus en de dikte van de endotheliale glycocalyx.

Protocol

1. Methoden

1,1 Cell Flow Kamer

Een stromingskamer, getoond in figuur 1, is geconstrueerd dat cellen kunnen worden gekweekt onder een afschuifsnelheid van 1,0 Pa (10 dyn / cm ²⁾ en vervolgens direct overgebracht naar een Asylum MFP3D AFM (Santa Barbara, CA).

De stromingskamer werd voorbereid voor de proef door eerst reinigen van de glaasjes in Piranha-oplossing (3:1 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂₎ gedurende 15 min en vervolgens wassen met gedestilleerd water. Zij werden vervolgens gebakken tot droog en bedekt met aminopropyltriethoxysilaan (APT....