Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de Endotheliale Kalende haarvaten met Atomic Force Microscopy

Samenvatting

De mechanische eigenschappen van endotheliale glycocalyx gemeten door inkeping met micron bollen op AFM uitkragingen. Endotheelcellen werden gekweekt in een aangepaste kamer onder fysiologische voorwaarden stroom glycocalyx expressie te induceren. De gegevens werden geanalyseerd met een dunne film model de glycocalyx dikte en modulus te bepalen.

Samenvatting

Ons begrip van de interactie van leukocyten en de vaatwand tijdens leukocyt capture wordt beperkt door een onvolledig begrip van de mechanische eigenschappen van het endotheeloppervlak laag. Het is bekend dat adhesiemoleculen op leukocyten zijn niet gelijkmatig ten opzichte oppervlaktopografie ³ verdeeld, dat topografie beperkt lijmverbinding formatie met andere oppervlakken ^9, en fysiologische contactkrachten (≈ 5,0 tot 10,0 per microvillus pN) kan de microvilli comprimeren als slechts een derde van hun lengte rusten, de toegankelijkheid van moleculen aan het tegenoverliggende oppervlak ^{3, 7.} We beschouwen het endotheel als een twee-lagen structuur, de betrekkelijk stijve cellichaam, plus de glycocalyx, een zachte beschermende suiker coating op het luminale oppervlak ^6. Het is aangetoond dat de glycocalyx kan fungeren als een barrière om de hechting van leukocyten verminderen aan het endotheliale oppervlak ^4.In dit rapport hebben we beginnen met de vervormbaarheid van endotheliale oppervlakken aan te pakken om te begrijpen hoe de endotheliale mechanische stijfheid kunnen bindingsvorming beïnvloeden. Endotheliale cellen gekweekt in statische cultuur spreken zich niet uit robuust glycocalyx, maar cellen gekweekt onder fysiologische stromingscondities beginnen een benadering van de glycocalyx waargenomen in vivo ^2. De modulus van de endotheelcellen lichaam is gemeten met behulp van atomic force microscopie (AFM) om ongeveer 5 tot 20 kPa ^5. De dikte en structuur van de glycocalyx werden bestudeerd met elektronenmicroscopie ⁸ en de modulus van de glycocalyx is benaderd door indirecte methoden, maar voor zover wij weten, zijn er geen gepubliceerde verslagen van een directe meting van de glycocalyx modulus in levende cellen . In deze studie presenteren we inkeping proeven met een nieuwe AFM probe op cellen die zijn gekweekt in omstandigheden hun glycocalyx expressie maximaliseren make directe metingen van de modulus en de dikte van de endotheliale glycocalyx.

Protocol

1. Methoden

1,1 Cell Flow Kamer

Een stromingskamer, getoond in figuur 1, is geconstrueerd dat cellen kunnen worden gekweekt onder een afschuifsnelheid van 1,0 Pa (10 dyn / cm ²⁾ en vervolgens direct overgebracht naar een Asylum MFP3D AFM (Santa Barbara, CA).

1. De stromingskamer werd voorbereid voor de proef door eerst reinigen van de glaasjes in Piranha-oplossing (3:1 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂₎ gedurende 15 min en vervolgens wassen met gedestilleerd water. Zij werden vervolgens gebakken tot droog en bedekt met aminopropyltriethoxysilaan (APTES) in een vacuüm afzettingskamer.
2. Een siliconen pakking werd gesneden met behulp van een Silhouette SD snijgereedschap. Dit liet ons toe om de stroom fijn kamerafmetingen voor het regelen van het debiet en shear stress tijdens celgroei. Typisch werd een kanaal uitgesneden 6,4 mm breed en 19 mm lang uit een plaat van 0,4 mm silicone. Het debiet nodig is om generate een afschuifspanning van 1,0 Pa (10 dyn / cm ²⁾ wordt berekend uitgaande van laminaire stroming in een rechthoekig kanaal met de vergelijking:

waarbij Q het debiet τ de schuifspanning μ is de viscositeit van het medium, hier aangenomen om 1,0 mPa (0,01 dyn * sec / cm ^2), h de hoogte en de breedte w van de stromingskamer .

3. Het bovenste deel van de stromingskamer is uitgelijnd met de pakking in de celkweekschaal en met een magnetische ring. De assemblage werd gevuld met isopropyl alcohol (IPA) voor sterilisatie.
4. Het volledige-stroomsysteem werd geassembleerd. De stroompoorten in de celkweekschaal aangesloten op driewegkleppen. De kleppen werden verbonden met 30 ml spuit te openens. IPA werd doorgespoeld, dat vervolgens werd met 30 ml medium McCoy's gewassen met 4% foetaal kalfsserum (FCS). Het systeem werd gevuld met 20 ml van de Vec Technologies celgroei medium. Deksels werden op de toppen van de injectiespuiten. De vangst reservoir spuit dop had een naald op zijn plaats om terug te gaan medium om de feed reservoir. Steriele 0,2 pm filters werden aan de luchtinlaten in de omslagen om verontreiniging van het systeem. De stroom kamer was dan klaar voor cel zaaien.

1,2 Cultuur van de Cel

1. Humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC's) en groeimedium werden gekocht bij Vec Technologies (Rensselaer, NY) en tot confluentie gekweekt in een T25 fles.
2. Het groeimedium werd uit de kolf verwijderd en de monolaag van cellen model met 2 ml van 2,5% trypsine. Zodra de cellen in oplossing werd het trypsinisatie geblust door toevoeging van 10 ml celkweekmedium aan de kolf.
3. The celsuspensie werd gedurende 5 min en het supernatant werd verwijderd. De cellen werden geresuspendeerd in 1 ml celkweekmedium (met serum) voor injectie in de stromingskamer.
4. De celsuspensie (0,5 ml, ~ 50.000 cellen) werd geladen in een spuit en geïnjecteerd in de stromingskamer via een driewegklep.
5. De cellen werden bezinken en het glazen substraat hechten gedurende 2 uur vóór stroming werd gestart. De cellen werden gekweekt onder stroming in een incubator bij 37 ° C gedurende 1 tot 5 dagen tot confluent.

1,3 Cantilever Voorbereiding en Cell Inspringen

1. Puntloze AFM cantilevers (nanowereld, Zwitserland) werden gereinigd salpeterzuur gedurende 5 min en gefunctionaliseerd met aminopropyltriethoxysilaan (APTES) in een kamer voor dampafzetting.
2. Een oplossing van 5 mg / ml gew NHS-sulfo-LC-biotine in gebufferde zoutoplossing Hank's (HBSS) bereid. De cantilevers werden ondergedompeld in de oplossing gedurende 15 min te conjugate het silaan met N-hydroxysuccinimide (NHS) chemie.
3. Een oplossing van biotine-vrij medium werd door het incuberen van 20 ml Vec Technologies celkweekmedium (waaronder serum) met 200 ul streptavadin kralen gedurende 12 uur. De bolletjes werden uit het medium met een magneet en het medium werd gefiltreerd door een 0,22 urn steriel filter.
4. De stromingskamer werd uit de celkweekschaal en de cellen werden gewassen in 37 ° C biotine-vrij medium.
5. Een voorraadoplossing van 1 pl van 2,4 urn parels gecoat met streptavidine in 1 ml van biotine vrij medium werd bereid, en 100 pl van de stock toegevoegd aan de celkweekschaal.
6. Streptavidine kralen werden opgepikt met de cantilever door de aanvoer van de tip over het glasoppervlak naast een kraal, terugtrekken, het positioneren van de top van de cantilever over de kraal, en vervolgens op de cantilever naar beneden op de kraal en rust gedurende enkele seconden.
7. De gevoeligheid van de cantilever was maatregeld door inspringen op een gebied van kale glas en met de helling van de curve de punt afbuiging als functie van spanning ingesteld.
8. De veerconstante van de cantilever werd berekend uit een thermische calibratie in de MFP3D software.
9. De gekalibreerde cantilever werd vervolgens gebruikt om streepje de monsters, zoals getoond in figuur 2. Deze 2,4 urn korrels hebben een groter contactoppervlak met het celoppervlak zodat de mechanische eigenschappen van de zacht glycocalyx laag kan worden gedetecteerd. De cantilever is geplaatst boven een cel nabij de celkern en zachte aanpak van de punt op de cel werd gebruikt om de cantilever hoogte ongeveer 3 urn boven het celoppervlak vastgesteld. De software werd gedurende 20 herhaalde indrukkingen met een snelheid van 1 um / sec tot maximaal kracht van 7 nN. Ongeveer 6 seconden verstreken tussen opeenvolgende contacten. Het is mogelijk om verschillende percentages van inspringing om te testen voor tijdsafhankelijke eigenschappen van de glycocalyx, hoewel deze eerste experimenten slechts een inkeping percentage (1 um / sec) gebruikt.

2. Inspringen Theorie

Inkeping in een elastisch half-ruimte met een bol met straal R kan worden beschreven met Hertz theorie waar de kracht van inspringing, F wordt gegeven door de vergelijking:

Waarbij δ is de inkeping diepte en E * is de verminderde modulus van het materiaal onder test (figuur 3). Bij een oneindig stijve indenter botst een uniforme elastische halfruimte wordt E * gegeven door de vergelijking:

3/50163eq3.jpg "/>
waarbij E de elasticiteitsmodulus en ν de Poisson verhouding van het materiaal. Recent werk met polymeerfilms geïnspireerd de ontwikkeling van een tweelaagse model voor het bepalen van de modulus en de dikte van dunne films ^1. Wij passen dit model celbiologie door behandeling van de glycocalyx een uniforme dunne zachte film op het oppervlak van het cellichaam. Met dit model verminderde de modulus van het systeem wordt:

Wanneer _GC E de modulus van de glycocalyx, E _cel de modulus van het cellichaam, P, Q en n constanten zijn die empirisch zijn bepaald uit het polymeer past en z wordt gegeven door de vergelijking:

Waarbij t de dikte van de glycocalyx laag. Een schema van deze parameters is weergegeven in figuur 3. Het model is aangetoond dat een nauwkeurige manier om de modulus en de dikte van een dunne film op stijver substraat ¹ zijn. Deze vergelijking kan worden gebruikt om de curves verkregen indrukking in cellen passen bij de modulus en de dikte van de endotheliale glycocalyx bepalen, zoals getoond in figuur 4.

Resultaten

In een typisch experiment werden 20 kracht-vs-afstand curves verkregen uit een bepaald gebied van de cel, meestal in de perinucleaire regio dichtbij, maar niet op de kern (binnen ~ 2 pm). De krommen werden aangepast om eventuele drift monster gedurende de duur van de meting en vervolgens gemiddeld om cantilever ruis, zoals getoond in figuur 4. De curven werden geanalyseerd en passen de twee lagen model dat is ontwikkeld voor het bepalen van de modulus en de dikte van dunne polymeerfilms ^1. Ui...

Discussie

We gebruikten waarden berekend uit de tweelagige model en Hertz theorie de interactie van leukocyten in het bloed aan de endotheel wand model. We hebben berekend dat een microvillus de leukocyten met een diameter van 50 nm minder dan 10 pN belasting zou ongeveer 150 nm streepje, in de glycocalyx, slechts een fractie van de totale dikte. Dit betekent dat de glycocalyx, met eigenschappen zoals gemeten in dit experiment, is een belangrijke belemmering voor cel-cel interactie en kan een grote sterische hindering die de cell...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van de Reagens / Materiaal	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
McCoy's Medium	Gibco	16600-082
Foetaal kalfsserum	Hyclone	SH30070
Endotheelcelgroei Medium	Vec Technologies	MCDB-131
Gepoolde Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Vec Technologies	PHUVEC/T-25
Zwavelzuur	JT Baker	9681-02
Waterstofperoxide	VWR	BDH3742-1
(3-aminopropyl) triethoxysilaan	Aldrich	440140-100ML
Isopropylalcohol	VWR	BDH8999-4
Trypsine	Cellgro	25-054-C1
Gebufferde zoutoplossing Hank's oplossing	Gibco	14175-095
sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335
Streptavadin kralen	Dynabeads	112.06D
MFP-3D AFM	Asiel Research
Tipless uitkragingen	Nanowereld	PIJL-TL1-50
Silhouette SD	Quickutz	Silhouet-SD
Silicone Rubber	Stockwell elastomeren	SE50-RS
30 ml spuiten	Benton Dickinson	309650
18 gauge naalden	Benton Dickinson	305196
Extensiesets	Hospira	4429-48
4-weg kleppen	Teleflex	W21372
Man / Vrouw Port Petten	Smith's Medical	MX491B
Peristaltische Pomp	Watson-Marlow	401U / D
Peristaltische Tubing	Watson-Marlow	903.0016.016
steriele filters	Pall Life Science	4652