Tactiele Conditioning En Movement Analyse Van antennaal bemonsteringsstrategieën In Honey Bees (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Samir Mujagić; Simon Michael Würth; Sven Hellbach; Volker Dürr

doi:10.3791/50179

Methodenartikel

Tactiele Conditioning En Movement Analyse Van antennaal bemonsteringsstrategieën In Honey Bees (

10.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50179

⸱

12 december 2012

Samir Mujagić¹ , Simon Michael Würth¹ , Sven Hellbach¹ , Volker Dürr¹

¹Biological Cybernetics, CITEC - Cognitive Interaction Technology - Center of Excellence, Bielefeld University

In dit artikel

Samenvatting

In dit protocol laten we zien hoe de conditie van de bijen aangewend om tactiele stimuli en de invoering van een 2D motion capture techniek voor het analyseren van de kinematica van gedetailleerde antennaal sampling patroon.

Samenvatting

Honingbijen (Apis mellifera L.) zijn eusociale insecten en bekend om hun complexe verdeling van arbeid en associatief leren capaciteit ^{1, 2.} De werkbijen brengen de eerste helft van hun leven in de donkere bijenkorf, waar ze het verzorgen van de larven of de bouw van de reguliere zeshoekige kammen voor voedsel (zoals stuifmeel of nectar) en broed ^3. De antennes zijn buitengewone multisensorische voelsprieten en spelen een centrale rol in de verschillende tactiele gemedieerde taken ^4, met inbegrip van bijenkorf gebouw ⁵ en patroonherkenning ^6. Later in het leven, elke afzonderlijke bijen laat de korf om te foerageren naar voedsel. Dan een bij moet leren om winstgevend voedselbronnen discrimineren, hun plaats te onthouden, en het communiceren met haar nestgenoten ^7. Bijen maken gebruik van verschillende bloemen signalen zoals kleuren of geuren ^{7, 8,} maar ook tactiele signalen van het blaadje oppervlak ⁹ tot en met multisensorische herinneringen aan de voedselbron vormen. Onder laboratorium conditions, kunnen de bijen worden getraind in een appetitieve leren paradigma om tactiele object functies, zoals randen of groeven met hun antennes ^{10, 11, 12, 13} discrimineren. Deze leerparadigma hangt nauw samen met de klassieke conditionering van de olfactorische proboscis extensie reactie (PER) in benut bijen ^14. Het voordeel van de voelbare leren in het laboratorium mogelijke combinaties gedragsexperimenten op leren met verschillende fysiologische metingen, inclusief analyse van de antennelid bewegingspatroon.

Protocol

1. Voorbereiding van de bijen

Nectar of Pollen verzamelaars zitten gevangen in het veld hetzij van een sucrose feeder of rechtstreeks van de korf ingang terwijl het terugkeren van een foerageer reis. Elke afzonderlijke bijen wordt opgevangen in een glazen injectieflacon die is afgesloten met een schuim plug en onmiddellijk in het laboratorium voor verdere behandeling.
In het laboratorium worden de vastgelegde bijen kort gekoeld in de koelkast bij 4 ° C totdat ze tonen eerste tekenen van immobiliteit.
Elke afzonderlijke geïmmobiliseerd bij wordt gemonteerd in een metalen buis met plakband tussen hoofd en thorax en de buik. Zorg moet worden genomen dat de proboscis en antennes zijn vrij beweegbaar.
Verf de samengestelde ogen en ocelli van de vaste bijen met witte verf (bijvoorbeeld oplosmiddelvrije Tipp-Ex) de visie af te sluiten.
Voeg een klein druppeltje gesmolten was achter het hoofd van de bij om het te repareren om de band tussen de kop en de thorax om hoofdbewegingen te voorkomen tijdens opnames.
Markeer elke afzonderlijke bij met een nummer op de band voor een betere identificatie en plaats de buis met de vaste bijen in een vochtige atmosfeer om uitdroging te voorkomen.
Voer elk afzonderlijk bij gedurende 5 sec met druppels van een 30% sucrose oplossing gepresenteerd met een spuit en laat alle bijen terug gedurende 30 minuten vóór het begin van de tactiele conditionering protocol.

2. Tactile Conditioning

Conditioning voor iedere enkele bij moet worden getest op de proboscis verlenging response (PER) van een 30% sucrose stimulus toegepast op de antennes. Daarbij wordt de tip van de proboscis moet oversteken een denkbeeldige lijn tussen de geopende kaken. Gooi alle bijen die niet reageren met een PER van de sucrose stimulus.
Voor tactiele conditioning gebruik maken van een koperen kubus (bijv. 3 x 5 mm) met een glad of een gegraveerd patroon, bijvoorbeeld horizontaal of verticaal groeven die een rooster met 150 pm golflengte, als de geconditioneerde stimulus (CS). Fof de ongeconditioneerde stimulus (US) gebruik maken van een 30% sucrose-oplossing (huishoudelijke suiker, verdund in water).
De koperen cube (CS) werd in een houder op een micromanipulator (bijvoorbeeld Märzhäuser MM33) Exacte positionering te verzekeren tijdens de conditionering procedure. De VS aan de bijen met een spuit met een 30% sucrose oplossing.
De conditionering procedure bestaat uit vijf paringen van de tactiele stimulus (CS) en sucrose-oplossing (VS) met een inter-trial interval (ITI) van 5 minuten. Plaats een bee voor de micromanipulator met gemonteerde tactiele stimulus (CS). Plaats de CS langzaam, zodat het oppervlak van de tactiele stimulus evenwijdig aan het hoofd van de bij (Figuur 1 A en B). De afstand tussen het dier en de tactiele object moet in het bereik van de antennelid werkgebied van de geteste bij, namelijk de bij moeten kunnen de tactiele stimulus scannen in een comfortabele positie wet beide antennes. In het voorbeeld in figuur 1 de afstand was 3 mm. Laat de bijen scannen tactiele stimulus (CS) gedurende 5 sec. Na de eerste 3 sec, presenteren een druppel van 30% sucrose (US) oplossing met een spuit onder proboscis. Gebruik de punt van de spuit voorzichtig verhogen van de proboscis. Sucrose stimulatie onder de proboscis zal uitlokken het onvoorwaardelijke PER ^15. Laat de bijen naar de sucrose beloning likken. Gebruik een stopwatch met een alarmsignaal naar de exacte tijdsintervallen te houden tijdens het conditioneren.
Het geconditioneerde PER wordt gebruikt als maat voor de leersucces van een bij. Na de eerste beloond koppelingen, bijen beginnen te reageren op CS presentatie door uitbreiding van hun slurf, die aangeeft dat zij de komende beloning verwachten. Een volledig uitgebreide proboscis op elk moment waargenomen tijdens de 3 sec tijdvenster van tactiele stimulus presentatie en voordat sucrose presentatie wordt gescoord als een positieve reactie. Geen reactie wordt geteld negatief. De occurrence van de PER moet worden opgemerkt door de experimentator. Het percentage van de bijen die de PER tijdens CS presentatie is uitgezet voor elk proces.

3. Kinematische Recordings

Antennaal bewegingen van een enkele ingezet bij worden opgenomen met een digitale videocamera met een geschikte macrolens (bijv. Basler A602f-2 uitgerust met TechSpec VZM 200, bediend bij 50 fps via een fire wire aansluiting). De camera is gepositioneerd boven het dier in een top-down view (Figuur 1 A). In figuur 1 is de ruimtelijke resolutie van de opnamen is 0,02 mm / pixel.
Kalibreer de camera door het opnemen van enkele foto's van een 10 x 10 mm dambord met een rand lengte van 1 mm van verschillende oriëntaties onder de camera doelstelling. De kalibratie kan worden gedaan met de camera calibratie tool box Matlab ^16.
Plaats een enkele vaste bee onder de camera lens. Presenteer de tactiele stimulus, bevestigd aan een micromanipulator, Aan het dier. Ga op dezelfde wijze als beschreven voor tactiele conditionering, en noteer de antennaal beweging, terwijl de bijen is het scannen van het object. Het is belangrijk dat de volledige antennelid werkgebied en de tactiele stimulus zichtbaar zijn. De keuzes van de stimulus patronen getest en proef nummers zijn afhankelijk van de experimentele opzet.

4. Data-analyse

De berekening van de beeldachtergrond gebeurt in Matlab. Eerst was de mediane waarde in de tijd grijswaarden moet worden berekend voor elke pixel. Statische objecten, zoals de vaste kop van de bij en de tactiele stimulus, vormt de achtergrond. Bewegende objecten, zoals de twee antennes, zal geen deel uitmaken van de achtergrond.
Elk frame van de opgenomen video heeft opeenvolgend geladen en het verschil tussen het huidige frame en de beeldachtergrond te worden berekend. Het resultaat van deze aftrekking benadrukt die delen van het beeld die beweegt van frame tot frame. Ideally, de antennes van de bij de enige gebieden van niet-nul waarden (Figuur 1C).
Voor verdere verwerking worden de twee grootste gebieden met nul pixel geacht de antennes zijn. Voor beide antennes een binair masker moet worden gegenereerd die voor elke pixel een waarde 1, indien de pixel behoort tot de antenne en de waarde 0 anders. Dit masker dient als basis voor het lokaliseren van de antennelid tips later. Een eerste masker voor het gehele beeld te krijgen van de grijswaarde van elk beeldpunt van het verschilbeeld wordt vergeleken met een vooraf gedefinieerde drempelwaarde. Aangezien wij zorgen voor geluidsoverlast later deze drempel wordt gekozen om heel laag. De voorlopige masker dan nog draagt twee soorten fouten: Ten eerste, als gevolg van beeldruis kleine regio's zijn nog steeds deel uit van het masker. Anderzijds kan gebieden die behoren tot de antenne niet noodzakelijkerwijs volledig worden aangesloten. Deze komt meestal als de achtergrond ongeveer dezelfde luminescentie als antenne. Om deze artefacten te elimineren, standaardbeeldverwerking morfologische operatie worden toegepast, dat wil zeggen een combinatie van beeld erosie en dilatatie, met een beroep op de standaard Matlab functies imerode en imdilate respectievelijk (zie ¹⁷ pp 158 tot 205 voor meer uitleg). Na de denoising proces de antennes hypothesen zijn nog steeds binnen een en dezelfde masker. Vandaar dat, als een volgende stap de binaire masker is geclusterd voor disjuncte gebieden met behulp van de standaard Matlab functie bwlabel (zie ¹⁷ pp 40 tot 48 voor meer informatie op de afbeelding segmentatie-algoritme).
Het aantal pixels per cluster wordt geteld en de twee grootste clusters geselecteerd. Het zwaartepunt wordt berekend onderscheid te maken tussen de linker en rechter antenne (Figuur 1D).
De antennelid tip voor elke antenne kan worden gedefinieerd als de pixel in een cluster met de hoogste waarde in de proximale naar distale richting (zie figuur 1D).