Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie en differentiatie van Stroma vasculaire cellen te Beige / Brite Cellen

38.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50191

⸱

28 maart 2013

 ,  , 
1UCSF Diabetes Center and Department of Cell and Tissue Biology, University of California, San Francisco , 2Department of Biology, University of Copenhagen, Denmark, 3National Institute of Nutrition and Seafood Research, Bergen, Norway

In dit artikel

Samenvatting

Primaire witte preadipocyten geïsoleerd van wit vetweefsel in muizen kunnen worden onderscheiden in beige / brite cellen. Hier wordt gepresenteerd is een betrouwbare cellulaire modelsysteem om de moleculaire regulatie van "bruinen" van wit vet te bestuderen.

Samenvatting

Bruine vetcellen hebben de mogelijkheid om de ademhalingsketen afgekoppeld mitochondria en afgevoerd chemische energie als warmte. Ontwikkeling van UCP1-positieve bruine vetcellen in wit vetweefsel (zogenaamde beige of brite cellen) wordt sterk geïnduceerd door een verscheidenheid aan omgevingsfactoren zoals chronische blootstelling aan kou of PPARy agonisten, dus dit celtype potentieel heeft als een therapeutisch doelwit voor behandeling van obesitas. Hoewel de meeste vereeuwigd adipocyt lijnen kunnen niet herhalen het proces van "bruinen" van wit vet in cultuur, primaire adipocyten geïsoleerd van stromale vasculaire fractie in subcutane wit vetweefsel (WAT) een betrouwbare cellulaire systeem om de moleculaire controle van beige / brite cel ontwikkeling te bestuderen . Hier beschrijven we een protocol voor effectieve isolatie van primaire preadipocyten en voor het induceren van differentiatie beige / brite cellen in kweek. Het bruinen effect kan worden beoordeeld door de expressie van bruin vet-selectieve merkers zoals UCP1.

Inleiding

Obesitas is een dramatische toename van de hele wereld en wordt nu beschouwd als een van de meest ernstige bezorgdheid voor de volksgezondheid 1. Deze situatie heeft betrekking op een onbalans in energie-inname ten opzichte uitgaven en resultaten in overtollige energie opgeslagen als vet in wit vetweefsel (WAT). Vergrote WAT wordt in verband gebracht met een verhoogde body mass en gewicht, terwijl de bruine vetweefsel heeft de mogelijkheid om overtollige energie af te voeren om warmte te produceren. Vandaar BBT kan functioneren als bescherming tegen zowel kou en overgewicht 2,3. Dit wordt bereikt door ontkoppeling van het elektronentransport in mitochondria door ontkoppeling eiwit 1 (UCP1). Dit eiwit wordt beschouwd als een keurmerk voor nonshivering thermogenese in BAT 3. Verschillende studies in de afgelopen jaren is gebleken dat volwassen mensen functionele BAT vier-acht hebben en dus, manipulatie van de BBT bij de mens kan een potentiële therapeutische interventie in de strijd tegen overgewicht en de daarmee samenhangende ziekten.

jove_content "> Huidig ​​bewijs geeft aan dat twee soorten bruine adipocyten in knaagdieren" klassieke "of" bestaande "bruin vet ontstaat tijdens de prenatale fase en vormt gewijd bruine adipose depots in interscapular regio en andere perifere weefsels Anderzijds. Een "induceerbare" vorm van bruin vet (zogenaamde brite of beige cellen) ontwikkelt tijdens postnatale fase en wordt afgewisseld in wit vetweefsel. Beide soorten bruine vetcellen ook gescheiden door verschillende ontwikkelingsstadia oorsprong. Terwijl de bestaande bruine vetcellen ontstaan ​​uit myoblastsic-achtige Myf5 precursors, de induceerbare brite / beige cellen afgewisseld in WAT voortkomen uit een niet-Myf5 lineage 9,10. Bovendien regulerende pathways van dit celtype waarschijnlijk verschillen van de Myf5 afgeleide bruine adipocyten 11. de ontwikkeling van de beige cellen (bijv. "bruining" wit vet) kan worden geactiveerd in reactie op chronische blootstelling aan kou enβ3-adrenoceptor-agonisten of PPARy agonisten bij volwassenen 12-14. De beige / brite cellen waarschijnlijk een veelbelovend therapeutisch doel voor manipulatie van de totale energiebalans en kan deel kunnen uitmaken behandeling van obesitas, dus is het belangrijk om te begrijpen precieze moleculaire mechanismen en signaalwegen waarbij omgevingsfactoren controle van de ontwikkeling van beige cellen.

Om de moleculaire controle van de bruining van wit vet begrijpen zijn in vitro experimenten best geschikt als differentiatie van preadipocyten plaatsvindt eerder asynchroon en het is moeilijk om de cellen te detecteren in situ 15. Hoewel studies op adipocyte ontwikkeling is tot nu toe voornamelijk uitgevoerd op cellijnen zoals 3T3-L1, 3T3-F442A of HIB1, deze cellijnen blijken het moleculaire profiel van beige cellen missen. Anderzijds, primaire adipocyten geïsoleerd uit subcutane WAT het meest waarschijnlijk het proces herhalens van bruinkleuring van wit vet in een cel autonome manier. Hier bieden wij een protocol voor een effectieve isolatie van het stromale-vasculaire fractie uit vetweefsel en voor het induceren van de bruinkleuring van wit vet in reactie op PPAR-agonisten. Rosiglitazon is aangetoond dat een bijzonder effectieve mediator van bruin in deze cellen. Zoals hiervoor 16 kan dit cellulaire systeem gebruikt worden om een betrouwbare cellulaire systeem om de ontwikkeling van beige / brite cellen te bestuderen dienen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereid Spijsvertering Medium

Maak 5 ml per 5 muizen per weefsel (ongeveer 1 ml / 1 g vetweefsel).

  1. Weeg bij de spijsvertering enzymen:
    - Collaginase D: 1,5 u / ml (1108874103, 1 g, Roche, 70334223)
    - Dispase II: 2,4 u / ml (04942078001, 0980 mg / lyo, Roche, 11466200)
  2. Voeg 25 ml PBS toe en meng goed om op te lossen
  3. Voeg CaCl2 vlak voor vertering van het weefsel op een eindconcentratie van 10 mM

2. Ontleden vetweefsel van muizen

  1. Dissection moeten zorgvuldig worden uitgevoerd, en onmiddellijk na de muizen (6-8 weken oud) worden opgeofferd. Werk steriele met ethanol gespoten op de muis vacht voordat u deze opent. Direct Plaats het weefsel in schone PBS, aparte interscapular BAT en subcutane inguinale WAT.
  2. Voor interscapular BAT: de muis geplaatst met de rug ogen gezien, opengesneden langs de rug en tot aan de nek. De bruinevetweefsel kan worden gevonden onder de huid tussen de schouders (interscapular). BBT kan worden gezien als twee kwabben, vlindervormige. Een dun laagje wit vet voor de BBT moet zorgvuldig worden verwijderd.
  3. Voor subcutane WAT (lies WAT): verwijder de huid. Lies WAT is direct te vinden onder de huid aan beide zijden, vanaf bijna op de rug en gaan samen, binnenkant van de dijen en naar beneden in de richting van de testikel.

3. Knippen en Digest vetweefsel

  1. Snel alle vervuiling, zoals haar, skeletspieren en bindweefsel uit het weefsel secties.
  2. Drogen snel tissue op papier te dissectie medium niet verdunnen met PBS en leg hem op een droge plaat.
  3. Voeg spijsvertering medium (toegevoegd CaCl 2 voorafgaand aan de spijsvertering) en gehakt het weefsel in kleine stukjes. Meng goed door en neer te pipetteren met een 5 ml pipet. Breng het gehakt weefsels in 50 ml buizen met de rest van de digestie medium Meng nog door en neer te pipetteren.
  4. Digest in 37 ° C onder constant roeren bij 150 rpm voor 40-50 min. Controleer elke 10-15 minuten om te controleren of de spijsvertering verloopt goed en tot meer dan-vergisting te voorkomen.

Opmerking: Correcte spijsvertering medium en tijd zijn belangrijk. Het weefsel moet goed worden verteerd, maar teveel spijsvertering kan schade aan de cellen.

4. Filter celsuspensie

  1. Stop digestie door toevoeging van 5 ml compleet medium (DMEM/F12 met 10% FPS en P / S). De cellen moeten bijna volledig homogeen. Meng goed door pipetteren.
  2. Centrifugeer bij 700 xg gedurende 10 minuten.
  3. SVF kan nu worden gezien als een bruinachtige pellet op de bodem van de buis. Zuig het olieachtige rijpe adipocyten laag boven en de meeste van de vloeistoflaag - houdt de pellet en oplossen in 10 ml compleet medium. Meng goed.
  4. Plaats een cel zeef (50-70 micrometer diameter) over een nieuwe 50 ml buis en filter de celsuspensie.

5. Plaat Cellen

  1. Breng celsuspensie een 15 ml en centrifugeer bij 700 xg gedurende 10 minuten.
  2. Aspireren medium en resuspendeer pellet in 10 ml compleet medium. Pipet en meng goed.
  3. Schatten hoeveel platen nodig. Dit kan variëren en is afhankelijk van de pelletgrootte. Een algemene regel is 2 van 10 cm platen uit 5 muizen voor inguinale WAT en een 10 cm plaat voor BBT.
  4. Plaat cellen op collageen gecoate gerechten (R & D) in volledig medium
  5. 1-2 uur na plating de cellen, aspiraat medium, twee keer wassen met PBS en voeg vers medium. Deze stap is belangrijk omdat dit verwijderen van rode bloedcellen, immuuncellen en andere verontreinigingen.

6. Onderscheid Cellen

  1. Maak onderhoud en inductie mediums.

Onderhoudsmedium

Compleet medium met toegevoegd:

ent "> Insuline, eindconc. 5 ug / ml (5 mg / ml stock, *** 100 ul azijnzuur in 10 ml H 2 O tot aangezuurd water pH 2,5 te bereiden. lossen insuline in het aangezuurde water. winkelvoorraden op -20 ° C)

3,3 ',5-trijood-L-thyronine (T3), eindconc. 1 nM (10 pM voorraad *** T3 opgelost in 1N NaOH en medium tot 10 uM bouillon toe. Sigma cat # T-2877)

Bewaar bij 4 ° C, goed voor een week

Inductiemedium

Onderhoudsmedium bevattende volgende verbindingen:

Indomethacine, eindconc. 125 uM (0,125 M voorraad in ethanol, Sigma cat # I-7378). Indomethacin moet verwarmd worden tot 60 ° C worden opgelost.

Dexamethason, eindconc. 2 ug / ml (2 mg / ml in ethanol sok, Sigma cat # D-1756)
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), eindconc. 0,5 mM (0,25 M stock in DMSO, Sigma cat # I-5879)
Rosiglitazon, eindconc. 0,5 uM(10 mM voorraad in DMSO, Sigma cat # R-2408)

Opmerking: Zorg verse inductie medium elke keer.

  1. Grow primaire adipocyten tot 95-97% confluentie in compleet medium (samenvloeiende maar niet te vol)
  2. Wijzig regelmatig compleet medium met inductie medium (dag 0)
  3. Na 48 uur (dag 2), te wijzigen middellange tot onderhoud medium met rosiglitazon (0,5 uM)
  4. Na nog 48 uur (dag 4), veranderen vers onderhoudsmedium met rosiglitazon (1 uM) gedurende 2-3 dagen extra. 6-7 dagen na toevoeging van de inductie medium worden de cellen volledig gedifferentieerde cellen rijpen om vet en zijn gevuld met oliedruppeltjes. Druppels verschijnt ongeveer 3-4 dagen na de inductie.

Opmerking: Verander medium om de 2-3 dagen totdat de cellen volledig gedifferentieerd.

Cellen kunnen nu worden geoogst en mRNA expressie van UCP1 en Other bruin adipocyt-specifieke genen kan worden gemeten met qRT-PCR. Western blot worden gebruikt om eiwitten te detecteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Browning primaire adipocyten kan worden benaderd door het meten van mRNA expressie van UCP1 en bruin vet-specifieke of selectieve genen door qRT-PCR. Weergegeven in Figuur 1 genexpressiegegevens in lies WAT afgeleide primaire adipocyten. De cellen werden geïnduceerd om te differentiëren in aanwezigheid van twee verschillende doseringen rosiglitazon bij 50 nM en 500 nM. Een subset van cellen werd behandeld met forskoline bij 10 uM gedurende 4 uur voorafgaande aan oogst. Dit zal tot cyclisch AMP ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier wordt een betrouwbare cellulaire systeem om de ontwikkeling van beige / brite cellen in primaire gekweekte adipocyten in muizen. Vergeleken met verschillende beschikbare geïmmortaliseerde cellijnen, dit systeem waarschijnlijk grotere relevantie voor het bruinen van witte vet in vivo bieden.

Hoewel in de studie van deze primaire adipocyten biedt een aantal voordelen, bestaan ​​er ook een aantal beperkingen en problemen die van belang zijn om te overwegen. Eerst is dit systeem st...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Wij danken Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda, en Lauren Ruiz voor discussie, technische hulp en redactionele hulp op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (DK087853), van het Programma voor Doorbraak biomedisch onderzoek en van Asubio Pharm Inc Skula werd ondersteund door een SHARE PhD beurzen van de Universiteit van Kopenhagen en het EU-FP7 project Diabat (GEZONDHEID-F2 -2,011 tot 278,373) naar Lise Madsen en Karsten Kristiansen. We erkennen ook het DERC centrum subsidie ​​(NIH P30 DK063720).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagens
Collaginase D Roche 11088874103
Dispase II Roche 04942078001
CaCl2
DMEM medium Visser 10017-CV Met 2,5 g / l glucose en L-glutamine zonder natriumpyruvaat
Insuline
T3 (3,3 ',5-trijood-L-thyronine) Sigma T-2877
Indometacine Sigma I-7378
Dexamethason Sigma D-1756
IBMX Sigma I-5879
Rosiglitazon Sigma R-2408
Uitrusting
Collageen beklede schaaltjes BD 354450 10 cm platen
70 urn filter BD Falcon 352350 Cel zeef, 70 pm nylon 1/ea

Referenties

  1. Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects. American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).
  2. Rothwell, N. J., Stock, M. J. Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat. The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A(1979).
  3. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  4. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).
  5. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).
  6. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).
  7. Zingaretti, M. C., et al. The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).
  8. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
  9. Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454, 961-967 (2008).
  10. Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).
  11. Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat. Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).
  12. Klingenspor, M. Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis. Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).
  13. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).
  14. Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).
  15. Hansen, J. B., Kristiansen, K. Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation. The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).
  16. Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).
  17. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).
  18. Cinti, S. Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).
  19. Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).
  20. Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).
  21. Rong, J. X., et al. Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone. Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).
  22. Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).
  23. Sell, H., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).
  24. Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice. Diabetes. 49, 759-767 (2000).
  25. Vernochet, C., et al. C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists. Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).
  26. Tai, T. A., et al. Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).
  27. Sugii, S., et al. PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Stromale Vasculaire FractieAdipocytenisolatieWeefseldigestieCeluitplatingDifferentiatie-inductieUCP1-expressieQ-RT-PCR-analyseWestern BlotRO-glitazonbehandeling
Isolatie en differentiatie van Stroma vasculaire cellen te Beige / Brite Cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.