Primaire witte preadipocyten geïsoleerd van wit vetweefsel in muizen kunnen worden onderscheiden in beige / brite cellen. Hier wordt gepresenteerd is een betrouwbare cellulaire modelsysteem om de moleculaire regulatie van "bruinen" van wit vet te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie en differentiatie van Stroma vasculaire cellen te Beige / Brite Cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bruine vetcellen hebben de mogelijkheid om de ademhalingsketen afgekoppeld mitochondria en afgevoerd chemische energie als warmte. Ontwikkeling van UCP1-positieve bruine vetcellen in wit vetweefsel (zogenaamde beige of brite cellen) wordt sterk geïnduceerd door een verscheidenheid aan omgevingsfactoren zoals chronische blootstelling aan kou of PPARy agonisten, dus dit celtype potentieel heeft als een therapeutisch doelwit voor behandeling van obesitas. Hoewel de meeste vereeuwigd adipocyt lijnen kunnen niet herhalen het proces van "bruinen" van wit vet in cultuur, primaire adipocyten geïsoleerd van stromale vasculaire fractie in subcutane wit vetweefsel (WAT) een betrouwbare cellulaire systeem om de moleculaire controle van beige / brite cel ontwikkeling te bestuderen . Hier beschrijven we een protocol voor effectieve isolatie van primaire preadipocyten en voor het induceren van differentiatie beige / brite cellen in kweek. Het bruinen effect kan worden beoordeeld door de expressie van bruin vet-selectieve merkers zoals UCP1.
Inleiding
Obesitas is een dramatische toename van de hele wereld en wordt nu beschouwd als een van de meest ernstige bezorgdheid voor de volksgezondheid 1. Deze situatie heeft betrekking op een onbalans in energie-inname ten opzichte uitgaven en resultaten in overtollige energie opgeslagen als vet in wit vetweefsel (WAT). Vergrote WAT wordt in verband gebracht met een verhoogde body mass en gewicht, terwijl de bruine vetweefsel heeft de mogelijkheid om overtollige energie af te voeren om warmte te produceren. Vandaar BBT kan functioneren als bescherming tegen zowel kou en overgewicht 2,3. Dit wordt bereikt door ontkoppeling van het elektronentranspo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereid Spijsvertering Medium
Maak 5 ml per 5 muizen per weefsel (ongeveer 1 ml / 1 g vetweefsel).
- Weeg bij de spijsvertering enzymen:
- Collaginase D: 1,5 u / ml (1108874103, 1 g, Roche, 70334223)
- Dispase II: 2,4 u / ml (04942078001, 0980 mg / lyo, Roche, 11466200) - Voeg 25 ml PBS toe en meng goed om op te lossen
- Voeg CaCl2 vlak voor vertering van het weefsel op een eindconcentratie van 10 mM
2. Ontleden vetweefsel van muizen
- Dissection moeten zorgvuldig worden uitgevoerd, en onmiddellijk na de muizen (6-8 weken oud) worden opgeofferd....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Browning primaire adipocyten kan worden benaderd door het meten van mRNA expressie van UCP1 en bruin vet-specifieke of selectieve genen door qRT-PCR. Weergegeven in Figuur 1 genexpressiegegevens in lies WAT afgeleide primaire adipocyten. De cellen werden geïnduceerd om te differentiëren in aanwezigheid van twee verschillende doseringen rosiglitazon bij 50 nM en 500 nM. Een subset van cellen werd behandeld met forskoline bij 10 uM gedurende 4 uur voorafgaande aan oogst. Dit zal tot cyclisch AMP .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier wordt een betrouwbare cellulaire systeem om de ontwikkeling van beige / brite cellen in primaire gekweekte adipocyten in muizen. Vergeleken met verschillende beschikbare geïmmortaliseerde cellijnen, dit systeem waarschijnlijk grotere relevantie voor het bruinen van witte vet in vivo bieden.
Hoewel in de studie van deze primaire adipocyten biedt een aantal voordelen, bestaan er ook een aantal beperkingen en problemen die van belang zijn om te overwegen. Eerst is dit systeem st.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Wij danken Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda, en Lauren Ruiz voor discussie, technische hulp en redactionele hulp op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (DK087853), van het Programma voor Doorbraak biomedisch onderzoek en van Asubio Pharm Inc Skula werd ondersteund door een SHARE PhD beurzen van de Universiteit van Kopenhagen en het EU-FP7 project Diabat (GEZONDHEID-F2 -2,011 tot 278,373) naar Lise Madsen en Karsten Kristiansen. We erkennen ook het DERC centrum subsidie (NIH P30 DK063720).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagens | |||
| Collaginase D | Roche | 11088874103 | |
| Dispase II | Roche | 04942078001 | |
| CaCl2 | |||
| DMEM medium | Visser | 10017-CV | Met 2,5 g / l glucose en L-glutamine zonder natriumpyruvaat |
| Insuline | |||
| T3 (3,3 ',5-trijood-L-thyronine) | Sigma | T-2877 | |
| Indometacine | Sigma | I-7378 | |
| Dexamethason | Sigma | D-1756 | |
| IBMX | Sigma | I-5879 | |
| Rosiglitazon | Sigma | R-2408 | |
| Uitrusting | |||
| Collageen beklede schaaltjes | BD | 354450 | 10 cm platen |
| 70 urn filter | BD Falcon | 352350 | Cel zeef, 70 pm nylon 1/ea |
Referenties
- Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects. American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).
- Rothwell, N. J., Stock, M. J. Combined effects....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
