Meten kationtransport van Na, K en H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicellen door atomaire absorptiespectrometrie: Een alternatief voor Radio-isotopen Assays

Samenvatting

We beschrijven een methode om de activiteit van K⁺-countertransporterende P-type ATPasen te kwantificeren door heterologe expressie van de enzymen in Xenopus oöcyten en het meten van Rb⁺ of Li⁺ opname in individuele cellen door middel van atomaire absorptie spectrofotometrie. De methode is een gevoelige en veilige alternatief voor radio-isotoop flux experimenten waardoor complexe kinetische studies worden vergemakkelijkt.

Samenvatting

Terwijl kationtransport door de elektrogene membraantransporter Na⁺,K⁺-ATPase gemeten kan worden door middel van elektrofysiologie, is de elektroneutraal opererende gastrische H⁺,K⁺-ATPase moeilijker te onderzoeken. Veel transportassays gebruiken radio-isotopen om een voldoende signaal-ruisverhouding te bereiken, maar de noodzakelijke veiligheidsmaatregelen leggen strenge beperkingen op met betrekking tot blootstelling voor mensen of opzet van de assay. Bovendien wordt iontransport over celmembranen kritiek beïnvloed door het membraanpotentiaal, wat niet direct gecontroleerd kan worden in celcultuur of in proteoliposomenpreparaten. Hier maken we gebruik van de uitstekende gevoeligheid van atomaire absorptiespectrometrie (AAS) voor sporenhoeveelheden van chemische elementen om Rb⁺ of Li⁺ transport door Na⁺,K⁺- of gastrische H⁺,K⁺-ATPase in enkele cellen te meten. Met behulp van Xenopus eicellen als expressiesysteem, bepalen we de hoeveelheid Rb⁺ (Li⁺) die in de cellen wordt getransporteerd door monsters van enkele-eicel homogenaten te meten in een AAS-apparaat uitgerust met een dwars verwarmde grafietatomisator (THGA) oven, die wordt geladen vanuit een autosampler. Aangezien de achtergrond van onspecifieke Rb⁺ opname in controle eicellen of tijdens toediening van ATPase-specifieke inhibitoren zeer klein is, is het mogelijk om complexe kinetische assayschema's te implementeren die een groot aantal experimentele omstandigheden tegelijkertijd omvatten, of om de transportcapaciteit en kinetiek van locatie-specifiek gemuteerde transporters met hoge precisie te vergelijken. Bovendien, aangezien kationopname op enkele cellen wordt bepaald, kunnen de fluxexperimenten worden uitgevoerd in combinatie met twee-elektrode voltage-clamping (TEVC) om nauwkeurige controle van het membraanpotentiaal en de stroom te bereiken. Dit maakte het bijv. mogelijk om de 3Na⁺/2K⁺ transport stoichiometrie van de Na⁺,K⁺-ATPase kwantitatief te bepalen en voor de eerste keer om de spanningsafhankelijkheid van kationtransport door de elektroneutraal opererende gastrische H⁺,K⁺-ATPase te onderzoeken. In principe is de assay niet beperkt tot K⁺-transporterende membraaneiwitten, maar het kan evengoed werken om de activiteit van zware of overgangsmetaaltransporters aan te pakken, of opname van chemische elementen door endocytotische processen.

Inleiding

We wilden een gevoelige, veilige en goedkope alternatief ontwikkelen voor radioactieve tracer-experimenten om de specifieke transportactiviteit van ionen-translocerende membraaneiwitten te onderzoeken om beperkingen te omzeilen met betrekking tot de toegang tot isotooplaboratoria, veiligheidsvereisten of het gebruik van kostbare radio-isotopen, die - zoals in het geval van lithium - zelfs niet beschikbaar kunnen zijn vanwege extreem korte vervaltijden. We waren vooral geïnteresseerd in het bepalen van de activiteit van de elektroneutral werkende gastrische H⁺,K⁺-ATPase, omdat het enzym geen stroom genereert en de activiteit daarom niet kan worden aangepakt door elektrofysiologische methoden. Aangezien Na⁺,K⁺- en H⁺,K⁺-ATPase Rb⁺ even efficiënt transporteert als K⁺ (en Li⁺ ook), zou de hoge gevoeligheid van de AAS-techniek voor rubidium of lithium een gevoelige detectie van transportactiviteit moeten vergemakkelijken. Atomaire absorptiespectrometers zijn gebruikelijke analytische apparaten, die wijd verspreid zijn in chemische laboratoria en toegankelijk zouden moeten zijn voor een groot aantal geïnteresseerde wetenschappers. Verder wilden we gebruik maken van het Xenopus oöcyt-expressiesysteem, dat grote enkele cellen gebruikt (ongeveer 1,0-1,5 mm diameter) die het mogelijk maken om een opmerkelijk lage cel-tot-cel-variabiliteit te bereiken met betrekking tot het eiwitexpressieniveau binnen een enkele batch. Een eenvoudige berekening demonstreert de haalbaarheid van de AAS-test: de detectielimiet (karakteristiek massa) voor rubidium met de THGA-AAS-techniek is 10 pg of 1,2·10^-13 mol (Rb: 85,47 g/mol), voor lithium 5,5 pg of 7,9·10^-13 mol (Li: 6,94 g/mol). Bij heterologe expressie van Na⁺,K⁺-ATPase in Xenopus oöcyten kunnen pompstromen van 100 nA worden bereikt (wat gelijk is aan ongeveer 6,2·1011 elementaire ladingen per seconde, of 1,03·10^-12 mol s^-1), wat resulteert in een transport van 6·10^-6 C lading binnen 1 minuut. Aangezien het transport van een netto-lading overeenkomt met de opname van twee Rb⁺ ionen (vanwege de 3Na⁺/2K⁺ stoichiometrie), komt 100 nA stroom gedurende 1 minuut overeen met een opname van 1,2·10^-10 mol Rb⁺. Dus zelfs bij een 1000-voudige verdunning (homogenisatie van een oöcyt met ongeveer 1 μl volume in 1 ml water), bevat een typische THGA-AAS-monster (20 μl) 2,4·10^-12 mol Rb⁺ (of 204 pg), wat ver boven de detectielimiet ligt. Daarom kunnen zelfs transporteurs met meer dan 100-voudig lagere transportactiviteit of plasmamembraanexpressie worden getest met de techniek door de fluxtijd van het experiment geschikt aan te passen.

Aangezien de pompsnelheid gevoelig afhankelijk is van de temperatuur (typische activeringsenergieën voor Na⁺,K⁺-ATPase liggen in het bereik van 90 kJ/mol tot 130 kJ/mol^1-3, wat resulteert in een ongeveer 30% toename van de omzetsnelheid bij een verandering van 20 °C naar 22 °C), is het verplicht om de fluxmetingen uit te voeren onder nauwkeurige temperatuurcontrole (airconditioning) met goed geëquilibreerde bufferoplossingen. Verder moeten oöcyten zorgvuldig worden geselecteerd met betrekking tot homogene grootte voor de expressie van een ionetransporteur. Met deze voorzorgsmaatregelen is het mogelijk om routinematig experimentele standaardfouten van minder dan 10 procent te bereiken met ongeveer 10 cellen per experimentele conditie. Met behulp van deze techniek waren we in staat om bijv. de schijnbare Rb⁺ affiniteiten van kationentransport^4-6, de invloed van extra- en intracellulair pH⁷ en het effect van mutaties van residuen betrokken bij kationcoördinatie tijdens transport^4,8 te bepalen. Een voordeel van de techniek is dat ionefluxen ook kunnen worden bepaald in combinatie met twee-elektrode spanningsklem van de oöcyten, wat aan de ene kant nauwkeurige controle van het membraanpotentiaal tijdens transport verzekert en aan de andere kant het mogelijk maakt om ioneflux te correleren met membraanstroom. Zo was het mogelijk om de 3Na⁺/2K⁺ stoichiometrie van de Na⁺,K⁺-ATPase (zie voorbeeldresultaten hieronder) te verifiëren en de spanningsafhankelijkheid van kationentransport van de gastrische H⁺/K⁺-ATPase⁷ te bepalen.

Protocol

1. cDNA-constructen en eiwitexpressie in Xenopus-oocyten

Het cDNA van het membraaneiwit van belang moet worden gekloond in een vector die geschikt is voor expressie in Xenopus laevis oocyten, zoals pTLN⁹ of pcDNA3.1X¹⁰. Dergelijke geoptimaliseerde vectoren bevatten de 5'- en 3'-niet-vertaalde regio's (UTR) van het β-globinegen van Xenopus laevis die de multiple cloning site (MCS) flankeren, een RNA-polymerasepromotersequentie (pTLN: SP6, pcDNA3.1X: T7) gelegen vóór de 5' UTR, een poly-A-sequentie in de 3'-richting van de MCS om de stabiliteit van het cRNA in cellen te waarborgen, en verder stroomafwaarts nog een reeks restrictie-endonucleasesites die slechts één keer knippen voor linearisatie van het plasmide, zodat dit kan dienen als template voor in vitro cRNA-transcriptie.

Om de activiteit van de overgeëxpresseerde humane Na⁺/K⁺-ATPase (α₂-subeenheid+β₁-subeenheid) te onderscheiden van de endogene Na⁺/K⁺-ATPase van de oocyten, werden de mutaties Q116R en N127D geïntroduceerd om een ouabaïne-resistent eiwit te verkrijgen met een IC50 in het millimoire bereik¹¹. In het geval van H⁺/K⁺-ATPase werden fluxmetingen uitgevoerd met gebruik van de H⁺/K⁺-ATPase α-subeenheid mutant S806C, aangezien Rb⁺ fluxen correleerden met kinetische gegevens uit voltage-clamp fluorometrie (VCF) experimenten. De VCF-techniek (https://www.jove.com/video/2627/ examining-the-conformational-dynamics-of-membrane-proteins-in-situ-with-site-directed-fluo rescence-labeling)¹² is gebaseerd op de site-specifieke binding van een fluorofoor aan een strategisch geïntroduceerd cysteine-residu, wat conformationele veranderingen van het enzym rapporteert.

2. Linearisatie en zuivering van het DNA-sjabloon

1. Voor de linearisatie van het DNA-template wordt 3 μg plasmide-DNA in een reactievolume van 50 μl gedigesteerd met 5 μl 10x-geconcentreerde buffer, passend bij het restrictie-enzym, en 10 U restrictie-enzym gedurende 1 hr bij 37 °C.
2. Zuiver het gelineariseerde DNA met de High-Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science). Voeg eerst 350 μl bindingsbuffer (bevat guanidiniumisothiocyanaat) toe aan het digestiebuisje. Na deze zuiveringsstap is het gelineariseerde DNA-template 'RNA-grade', omdat guanidiniumisothiocyanaat een efficiënt proteïnedenaturans is en in het bijzonder RNAse vernietigt, wat een veelvoorkomende contaminant is in moleculair-biologische laboratoria.
3. Plaats de spinzuilen in opvangbuisjes, breng de DNA-oplossing uit stap 2 over op de zuil, centrifugeer 30 sec bij 13,000 x g en verwijder het doorstroomvolume.
4. Voeg 500 μl wasbuffer toe aan de zuil. Centrifugeer 1 min bij 13,000 x g en verwijder het doorstroomvolume.
5. Voeg 200 μl wasbuffer toe aan de zuil. Centrifugeer 1 min bij 13,000 x g om de zuil volledig te drogen.
6. Plaats de spinzuil in een nieuw 1,5 ml Eppendorf-buisje en voeg 50 μl nuclease-vrij water (Ambion Product # AM9937) toe aan de zuil. Elueer door 1 min te centrifugeren bij maximale snelheid.
7. Concentreer de DNA-bevattende oplossing na elutie tot ongeveer 15 μl. Deze stap zorgt ervoor dat de oplossing 0,5 μg gelineariseerd DNA in 3 μl bevat, wat de aanbevolen concentratie is voor de volgende in vitro cRNA-transcriptiereactie.

3. In Vitro cRNA-synthese

1. Kies de juiste mMessage mMachine Kit (Ambion Product #1340, #1344) op basis van de promotersequentie op het plasmide (SP6, T7). Voeg in een totaal reactievolume van 10 μl 3 μl gelineariseerd DNA uit de vorige stap en 1 μl transcriptiebuffer toe aan vooraf gealiquoteerde 5 μl-monsters van de NTP-cap mix. Het vooraf aliquoteren van de NTP-cap mix is noodzakelijk om frequente vries-dooi-cycli te vermijden, wat kan leiden tot degradatie van de nucleoside-trifosfaten. Voeg tot slot 1 μl van het juiste RNA-polymerase toe, meng kort en centrifugeer de reactiemix kort (spin-down).
2. Incubeer de reactiemix gedurende 1 tot 2 uur bij 37 °C. De incubatietijd mag 2 uur niet overschrijden, omdat dit kan leiden tot een lagere opbrengst of kwaliteit van het cRNA.
3. Voeg 15 μl ijskoude 3 M LiCl-oplossing uit de kit toe, 15 μl koud nuclease-vrij water, meng kort (niet vortexen), centrifugeer het monster kort bij 11.000 x g gedurende 10 sec, en bewaar het bij -20 °C gedurende ten minste 30 min om precipitatie van het cRNA mogelijk te maken.
4. Koel de centrifuge vooraf af tot 4 °C en centrifugeer na de precipitatie ten minste 15 min bij 13.000 x g.
5. Verwijder het supernatant voorzichtig en volledig van de lichtbruine pellet aan de onderkant van de buis en voeg 150 μl 70% ethanol van RNA-kwaliteit toe, gekoeld tot -20 °C. Centrifugeer bij 4 °C gedurende 5 min bij 13.000 x g.
6. Verwijder het supernatant volledig en droog de resterende cRNA-pellet kort (1-2 min) in een centrifugale evaporator (bijv. Eppendorf Concentrator model 5301) bij kamertemperatuur.
7. Los de pellet op in 12 μl koud nuclease-vrij water. WAARSCHUWING: Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd terwijl het cRNA-monster op ijs bewaard wordt.
8. Bepaal de cRNA-concentratie met behulp van een spectrophotometer (bijv. Eppendorf BioPhotometer).
9. Controleer de integriteit van het cRNA via agarosegelelektroforese. WAARSCHUWING: Deze crosscheck is noodzakelijk, aangezien zelfs gedeeltelijk gedegradeerd RNA een niet-nul UV-absorptie geeft. Gebruik voor cRNA-elektroforese een grondig gereinigde elektroforesekamer die opnieuw is gevuld met TAE-buffer en een vers bereide 1% agarosegel. Indien RNAse-contaminatie in de elektroforesekamer of buffer wordt vermoed, vul de kamer dan gedurende 1 uur met 0.1 M HCl voor reiniging en bereid de TAE-buffer met nuclease-vrij water.
10. Bewaar het cRNA bij -20 °C tot gebruik. cRNA kan ten minste één jaar bewaard worden bij -20 °C.

4. Het verkrijgen van eierstokmateriaal van Xenopus laevis-vrouwtjes via partiële ovariectomie

Dit protocol is goedgekeurd door de verantwoordelijke staatsautoriteit (Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin, De Senaat van Berlijn, Duitsland).

1. Voer de kikker minimaal 12 uur voor de operatie niet om braken te voorkomen.
2. Bereid een oplossing voor van 2 g van het lokale anestheticum tricaine (MS-222) opgelost in 1 L water, bijgesteld naar pH 7.0 met 5 mM HEPES-buffer. WAARSCHUWING: Draag altijd nitrilhandschoenen bij het hanteren van MS-222 en bereid de oplossing voor in een chemische veiligheidskast.
3. Dompel de kikker onder in de tricaine-oplossing (max. 10 min) totdat het dier geen rechtingsreflexen meer vertoont. Om de ongevoeligheid te controleren, probeer de kikker in uw handen op zijn rug te draaien en let op afweerbewegingen.
4. Haal de kikker met de hand uit de tricaine-oplossing en spoel het dier af met koud kraanwater om het anestheticum te verwijderen.
5. Plaats de kikker met de rug naar boven op een bed van ijs, bedekt met een nat keukenpapiertje om beschadiging van de huid van de kikker door direct contact met ijs te voorkomen. Houd de huid van het dier tijdens de gehele operatie nat om uitdroging te voorkomen. Plaatsing op ijs verlengt de duur van de anesthesie.
6. Maak met een scherpe schaar een kleine abdominale incisie (8-10 mm lengte) aan weerszijden van de middellijn van de kikker, links of rechts. WAARSCHUWING: Wees voorzichtig om de zijlijn niet te beschadigen. Vervolgoperaties moeten aan afwisselende zijden worden uitgevoerd om een goed herstel van het onderliggende eierstokweefsel mogelijk te maken. Meestal moeten drie weefsellagen worden gepenetreerd (de buitenste huid, een dunne laag wit bindweefsel - de fascia - en een spierlaag).
7. Grijp na het openen van de abdomen delen van de ovariale lobben met botte pincetten en trek deze voorzichtig naar buiten. Als richtlijn worden er ongeveer 3-5 cm aan eierstokmateriaal uit de eierstok verwijderd door middel van een incisie. In geval van beschadiging van kleine bloedvaten en bloedingen, oefen druk uit met een steriele plastic staaf of koel de wond met ijs totdat de bloeding stopt.
8. Sluit de incisie chirurgisch met een onderbroken hechting met 4.0 Ethicon Vicryl hechtdraad (Johnson & Johnson #V633H). Gebruik chirurgische instrumenten voor het hechten en knoop twee of drie knopen afzonderlijk langs de incisie. WAARSCHUWING: Het is belangrijk dat bij elke knoop de drie weefsellagen in één stap worden gehecht.
9. Plaats de kikker na de operatie in een licht hellend waterbekken (30 L), dat net genoeg water bevat om de bodem te bedekken zodat de neusgaten van het dier boven het waterniveau blijven om ademhaling mogelijk te maken. Bedek het dier tijdens de ontwaakperiode (ongeveer 1-2 uur) met een nat keukenpapiertje om uitdroging van de gevoelige huid te voorkomen.
10. Wanneer het dier weer actief is, vul dan het waterbekken en houd de kikker 3-4 dagen gescheiden van de andere dieren om het herstel en de wondgenezing te bewaken.
11. Spaar de kikker na de operatie ten minste 3 maanden voor volgende operaties om een volledig herstel van het dier en het eierstokweefsel mogelijk te maken. Als richtlijn kunnen er maximaal 6-8 operaties per kikker worden uitgevoerd.

5. Enzymatische isolatie van individuele oocyten

1. Knip het eierstokmateriaal met een schaar in kleinere stukjes en breng het weefsel over naar Oocyte Ringer Solution zonder Ca²⁺ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES, pH 7.4) met collageenase (20 mg/ml, type 1A van Clostridium hystolyticum, Sigma #C9891) en trypsineremmer (10 mg/ml, Type III-O van kippenei-eiwit, Sigma #T2011).
2. Schud de digestie-oplossing voorzichtig gedurende 2,5 uur bij 18 °C. Volg daarna de voortgang van de digestie in intervallen van 15 min totdat de meeste oocyten gescheiden zijn van het folliculaire weefsel.
3. Was de oocyten meerdere keren in een 50 ml Falcon-buis met Oocyte Ringer Solution zonder Ca²⁺ totdat de oplossing voldoende vrij is van weefselresten.
4. Bewaar de oocyten bij 18 °C in Oocyte Ringer Solution met Ca²⁺ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES, pH 7.4) inclusief gentamicine (50 μg/ml).

6. cRNA-injectie

1. Voor de expressie van Na⁺,K⁺- of H⁺,K⁺-ATPase injecteert u de oocyten met 50 nl cRNA-oplossing die 25 ng α-subeenheid en 5 ng β-subeenheid cRNA bevat, met behulp van een elektrisch aangedreven Nanoject II injectiepomp (Drummond Scientific Inc.) en 3,5" hematocrietbuisjes (Drummond #3 000-203-G/X). WAARSCHUWING: De hoeveelheid mRNA kan variëren afhankelijk van het doeleiwit en moet mogelijk worden aangepast voor maximale expressie middels Western blotting.
2. Injecteer 18-22 oocyten voor elke fluxconditie (bijv. bij een specifieke Rb⁺-concentratie). Hiervan zal 50% worden geanalyseerd onder "+flux"-condities (bijv. een bepaalde Rb⁺-concentratie) en 50% onder "-flux"-condities (bijv. met de gekozen Rb⁺-concentratie en een specifieke inhibitor van het enzym in verzadigende concentratie, zoals 10 mM ouabaïne voor Na⁺,K⁺-ATPase of 10 μM SCH28080 bij pH 5,5 voor H⁺,K⁺-ATPase).
3. Breng de oocyten na injectie afzonderlijk over naar 96-wellplaten die halfgevuld zijn met Oocyte Ringer Solution met Ca²⁺ en 50 μg/ml gentamicine bij 18 °C.
4. Dek de 96-wellplaat af met Parafilm om overmatige verdamping te voorkomen.
5. Incubeer de oocyten gedurende 2-7 dagen (afhankelijk van het eiwit van belang) bij 18 °C. Indien opslag van oocyten gedurende meer dan 3 dagen noodzakelijk is, wordt aanbevolen om de incubatiebuffer in de microwells elke 3 dagen te verversen.
6. Voor elke set fluxgegevens (bijv. een [Rb⁺] titratie-experiment) moeten ongeveer 10 niet-geïnjecteerde (of geïnjecteerde met 50 nl nuclease-vrij water) controle-oocyten worden geanalyseerd onder "+flux"- en "-flux"-condities. Incubeer daarom een voldoende aantal controlecellen op dezelfde wijze als de cRNA-geïnjecteerde oocyten voorafgaand aan de fluxanalyse.

Voorbehandeling van oocyten die heterologe ATPase tot expressie brengen

Na⁺ ladingsprocedure

Voor functionele metingen van Na⁺/K⁺-ATPase is het belangrijk om de intracellulaire Na⁺-concentratie te verhogen¹³, als volgt:

1. Breng de oocyten over naar Na⁺ Loading Buffer (110 mM NaCl, 2,5 mM Na-citraat, 2,5 mM MOPS, 2,5 mM TRIS, pH 7,4) voor 45 min op ijs.
2. Incubeer de oocyten voor het daaropvolgende herstel gedurende ten minste 30 min op ijs in Post Loading Buffer "PLB" (100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 5 mM BaCl₂, 5 mM NiCl₂ en 2,5 mM MOPS, 2,5 mM TRIS, pH 7,4).
3. Bewaar de oocyten in PLB op ijs tot gebruik.

7. Pre-blokkeren van endogene Na⁺,K⁺-ATPase

LET OP: Aangezien Xenopus-oocyten een endogene Na⁺,K⁺-ATPase tot expressie brengen, is het belangrijk om deze endogene pomp vóór Rb⁺-fluxexperimenten te blokkeren, als volgt:

1. Blokkeer nu de endogene Na⁺,K⁺-ATPase door de oocyten gedurende 15 min bij kamertemperatuur te incuberen in Post Loading Buffer met 100 μM ouabaïne.

8. Elektrofysiologie

1. Prepareer microelektroden door borosilicaatcapillairs (GB150F-8P, Science Products GmbH) uit te trekken met een micropipet-trekker met twee stappen (Model PC-10, Narishige).
2. Vul de glaselektroden van achteren met 3 M KCl. Voor TEVC-experimenten met H⁺,K⁺-ATPase raden wij aan om in plaats daarvan 3M NaCl te gebruiken, wat leidde tot stabielere stroommetingen. Monteer de pipet over de Ag/AgCl-draad van de microelektrodehouders van de two-electrode voltage-clamp opstelling.
3. Plaats de glasmicroelektroden en twee agarbruggen (deze moeten worden gemaakt met NaCl/agar in plaats van de gangbare KCl/agar), die de Ag/AgCl-referentie-elektroden met de badoplossing verbinden, in de meetkamer (Warner Instr., model RC-10) die is voorgevuld met meetbuffer (bijv. PLB met 10 μM ouabaïne voor Na⁺,K⁺-ATPase).
4. Zet de voltage-clamp versterker (Turbo TEC-10CX, NPI Electronics, Tamm, Germany) in de "OFF"-stand.
5. Controleer de weerstand van elke glaselektrode afzonderlijk (beide moeten in het bereik van 0,5-2 MΩ liggen).
6. Controleer de offset-potentialen van de spanning- en stromelektrode op het betreffende TEVC-versterkerdisplay. In geval van afwijking van nul wordt de offset bijgesteld met de overeenkomstige offset-regelaars van de versterker.
7. Plaats een oöcyt in het midden van de kamer en penetreer het membraan voorzichtig met de stroom- en spanningselektrode.
8. Controleer de potentiaalmeting van de versterker. De meting voor de potentiaal van de spanningselektrode geeft nu de waarde voor het rustpotentiaal van de cel.
9. Zet de versterker in de VC (voltage-clamp) modus.
10. Klem de cel met behulp van de pCLAMP-software (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) op een vooraf gedefinieerd membraanpotentiaal. Dit kan de waarde van het eerder gemeten rustpotentiaal zijn (voor metingen onder condities van nul membraanstroom) of elke gewenste testpotentiaalwaarde. Let op de amplitude en stabiliteit van de lekstroom (in afwezigheid van K⁺/Rb⁺/Li⁺), die - als algemene richtlijn - -200 nA bij -30 mV niet mag overschrijden.
11. Perfundeer de oöcyt gedurende een bepaalde tijd (bijv. 3 min voor Na⁺,K⁺-ATPase) met Rb⁺-bevattende oplossing (gebruik verzadigende concentraties uit fluxmetingen onder niet-geklemde condities om een maximale stroom te bereiken) en registreer de pompstroom met de pCLAMP-software in de continue registratiemodus. Zorg ervoor dat de Rb⁺-opname daarna volledig wordt gestopt door de cel 30 sec. te perfunderen met Rb⁺-vrije oplossing.
    1. Stop het two-electrode voltage-clamp experiment, verwijder de oöcyt uit de meetkamer en ga over naar wasstap 4 van de paragraaf "Rb⁺ opname-experimenten" om de Rb⁺-opname te analyseren met atoomabsorptiespectrofotometrie.
12. Voer offset-stroomsubtractie uit en evalueer het tijdintegraal van de pompstroom met behulp van het programma Clampfit uit het pCLAMP-pakket.

9. Metingen van de Rb⁺-opname

1. Snijd een gele pipetpunt van een 200 μl pipet af en smelt deze tot een diameter van ongeveer 2 mm. Het gebruik van dergelijke punten zorgt voor een minimale overdracht van de oplossing wanneer de oocyten tussen incubatie- of wasschalen worden verplaatst. Smelt de punt kort met de vlam van een pocketaansteker. Deze polijststap voorkomt schade aan de oocyten.
2. Bereid voor elke te meten oocyt een 1,5 ml Eppendorf-buisje voor, gevuld met 1 ml Millipore-water. Zet drie Petrischalen klaar met Rb⁺-vrije wasbuffer (bijv. PLB) en één met Millipore-water.
3. Overbreng vijf gepreïncubeerde oocyten gelijktijdig naar een Petrischaal van 3,5 cm gevuld met Rb⁺ flux-buffer (concentraties van 0 tot 15 mM Rb⁺) en incubeer gedurende 3 min (Na⁺,K⁺-ATPase) of 15 min (H⁺,K⁺-ATPase) onder temperatuurcontrole (bijv. 21 °C in een geconditioneerde ruimte of op een warmteplaat).
4. Overbreng de oocyten gelijktijdig naar de eerste schaal met Rb⁺-vrije wasbuffer (in het geval van Na⁺,K⁺-ATPase kan PLB worden gebruikt). Het is essentieel om de afwijkingen tussen de incubatietijden kleiner dan 5 sec te houden. Spoel voorzichtig.
5. Verplaats de oocyten naar de tweede en derde schaal met Rb⁺-vrije wasbuffer en spoel voorzichtig.
6. Overbreng de oocyten naar de schaal met Millipore-water en spoel voorzichtig.
7. Overbreng elke oocyt individueel naar een van de voorbereide Eppendorf-buisjes gevuld met 1 ml Millipore-water.
8. Homogeniseer de oocyt door herhaaldelijk op en neer te pipetteren met een 200 μl pipetpunt totdat de oplossing homogeen troebel is.

10. Voorbereiding van de AAnalyst 800 met gebruik van het THGA-oven-systeem

1. Draai de kraan van het benodigde inerte gas (argon) open en plaats een passende holle kathodelamp (enkel-element HCL's voor Li⁺ of Rb⁺; Photron, Melbourne, Australië) in een willekeurige socketpositie.
2. Start de WinLab32-besturingssoftware (Perkin Elmer) en schakel de betreffende holle kathodelamp in. Perkin Elmer Lumina holle kathodelampen worden automatisch herkend en verschijnen in de selectielijst. Niet-compatibele holle kathodelampen moeten handmatig worden ingevoerd.
3. Houd rekening met een opwarmtijd van ongeveer 10-15 min voor equilibratie van de lampen.
4. Controleer door middel van visuele inspectie of de THGA-buis (transversely-heated graphite atomizer tube, Perkin Elmer, #B3000641) in goede staat is. THGA-ovens moeten elke 300 shots worden vervangen (gemiddelde levensduur opgegeven door de fabrikant), maar kunnen vaak een groter aantal monsters verdragen.
5. Selecteer de "THGA furnace"-techniek in WinLab32.
6. Bereid ten minste vijf kalibratiemonsters voor met Rb⁺/Li⁺-concentraties tussen 10 en 50 μg/L (bijv. door passende verdunning van een 1 M RbCl- of LiCl-oplossing) en één blanco probe met enkel Millipore-water. Opmerking: Zouten moeten van de hoogst beschikbare zuiverheid zijn ("puriss." of uit commercieel beschikbare kalibratiestandaarden voor AAS-doeleinden).
7. Kies het juiste initialisatiebestand (genoemd "method"-bestand, dat een referentie biedt naar kalibratieparameters en instrumentinstellingen laadt, bijv. de AAS-detectiegolflengte; de golflengten voor Rb⁺ en Li⁺ zijn respectievelijk 780 nm en 670,8 nm) en voer vervolgens de posities en concentraties van de kalibratiemonsters in. Selecteer hiervoor de passende autosampler (monsterplaat met 88 of 148 bemonsteringsposities voor het AAnalyst 800-apparaat).
8. Meet de kalibratielijn.
9. Overbreng nu elk oocyt-homogenaat naar individuele 1,2 ml polypropyleen monsterbekers (Perkin Elmer, #B0510397) en plaats deze reageerbuisjes in de tray van de autosampler.
10. Maak een bestand met monsterinformatie aan om de probes in de autosamplerposities te identificeren, stel vervolgens het monstervolume in op 20 μl en start het instrument.
11. Controleer na voltooiing van de run (of tijdens visuele inspectie elk uur bij lange series monsters) op probes waarbij de gemeten hoeveelheid Rb⁺ het maximum van de kalibratielijn overschrijdt. Verdun in dat geval de betreffende monsters op passende wijze en meet ze opnieuw.

11. Opmerkingen voor het meten van grote aantallen monsters (boven de 50)

• Voor een run van het instrument die de hele nacht duurt, wordt aanbevolen om het reservoir van de autosampler te vullen met Millipore-water om verdamping van homogenaten in de reageerbuisjes te voorkomen.
• Het wordt aanbevolen om tussen elke 20 monsters een reageerbuisje met 2% HNO₃ te plaatsen om verstopping van de injectiecapillaire van de autosampler te voorkomen.

Aanbevolen THGA-AAS temperatuurprotocol voor rubidium

Stap	Temperatuur (°C)	Opwarmtijd (sec)	Vasthoudtijd (sec)	Argongasstroom (ml/min)
Drogen 1	110	1	20	250
Drogen 2	130	5	30	250
Pyrolyse	300-600	10	20	250
Atomisatie	1700-1800	0	5	0
Schoonmaak	2400	1	2	250

Aanbevolen THGA-AAS temperatuurprotocol voor lithium

Stap	Temperatuur (°C)	Opwarmtijd (sec)	Vasthoudtijd (sec)	Argongasstroom (ml/min)
Drogen 1	110	1	30	250
Drogen 2	130	15	30	250
Pyrolyse	900	10	20	250
Atomisatie	2200	0	5	0
Schoonmaak	2450	1	3	250

Data-analyse

1. Bereken voor elke meetconditie de gemiddelde Rb⁺-opname. De AAS-spectrofotometer geeft waarden in μg/L, die moeten worden omgerekend naar pmol/oocyten/min.
2. Trek voor kinetische analyses (schijnbare KM-waarden) de achtergrond-Rb⁺-opname af, bepaald met niet-geïnjecteerde controle-oocyten uit dezelfde batch bij de gegeven RbCl-concentratie.
3. Zet de gegevens uit met Origin-software en pas een fit van een Hill-functie of Michaelis-Menten-functie toe op de data. In deze vergelijkingen is [S] de substraatconcentratie, nH de Hill-coëfficiënt en K_0.5 de substraatconcentratie die nodig is voor een half-maximale activatie.

Resultaten

Kwantificering van Rb⁺ opname door K+⁺- (of Rb⁺)-tegengetransporteerde P-type ATPases door AAS in de Xenopus een oöcyt-expressiesysteem maakt een betrouwbare bepaling van enzymkinetische parameters mogelijk.

Bepaling van de transportstoichiometrie van de Na⁺/K⁺-ATPase

Voor de electrogene Na⁺/K⁺-ATPase kunnen Rb⁺-fluxen worden bepaald in twee-elektrode voltage-clamp experime...

Discussie

De beschreven methode om de hoeveelheid Rb⁺ (of Li⁺) te meten die in individuele Xenopus eicellen wordt opgenomen die Na⁺,K⁺- of H⁺,K⁺-ATPase tot expressie brengen, is een veelzijdige, flexibele en nauwkeurige techniek gebleken om de kinetische of thermodynamische parameters van transport voor kation-tegentransporterende P-type ATPasen^1,4,5,7,8 te bepalen. Het is een veilige en betrouwbare alternatief voor radioactieve tracer flux assay...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4.0 Ethicon Vicryl hechtmateriaal	Johnson Johnson	V633H
Collagenase type 1A van Clostridium hystolyticum	Sigma Aldrich	C9891
High-Pure PCR Product Purification Kit	Roche Applied Science	11732676001
Nuclease-vrij water	Ambion	AM9937
mMessage mMachine Kit SP6/T7	Ambion	1340, 1344
Ouabain octahydraat	Sigma Aldrich	O3125
Tricain (ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat zout)	Sigma Aldrich	A5040
Trypsine-remmer type III-O uit kippeneiwitje	Sigma Aldrich	T2011
SCH28080	Sigma Aldrich	S4443
AAnalyst 800	Perkin Elmer	0993-5256
WinLab32TM	Perkin Elmer
BioPhotometer	Eppendorf	6131 000.012
Boorsilicaat capillairen	Science Products	GB150F-8P
Hematocrietbuizen 3.5"	Drummond Scientific	3 000-203-G/X
Hollow Cathode Lamp Lithium	Photron	P929LL
Hollow Cathode Lamp Rubidium	Photron	P945
Micropipet Puller	Narishige	Model PC-10
Oocyte Recording Chamber RC-10	Warner Instr.	W4 64-0306
Nanoject II injectiepomp	Drummond Scientific	3-000-204
pCLAMP software	Molecular Devices
Polypropyleen monsterbeker (1,2 ml)	Perkin Elmer	B0510397
Speedvac - Concentrator model 5301	Eppendorf	5301 000.210
THGA-buis	Perkin Elmer	B3000641
Turbo TEC-10CX Versterker	NPI Electronics	TEC-10CX