Geoptimaliseerde Systeem voor cerebrale perfusie Monitoring in het Rat Stroke Model van intraluminale midden cerebrale slagader occlusie

Samenvatting

Cerebrale perfusie controle is aangetoond dat de nauwkeurigheid van ischemische beroerte modellen te verbeteren. Technische moeilijkheden beperken vaak het gebruik van dit essentieel instrument voor cerebrovasculaire onderzoek. In deze video wordt een geoptimaliseerd systeem getoond op een of meerdere locaties hemodynamische bewaking verkrijgen tijdens intraluminale middelste cerebrale slagader occlusie in ratten.

Samenvatting

De translationele potentieel van pre-klinische takt onderzoek is afhankelijk van de nauwkeurigheid van de experimentele modellering. Cerebrale perfusie monitoring in diermodellen voor acute ischemische beroerte maakt het mogelijk om succesvol arteriële occlusie te bevestigen en subarachnoïdale bloeding uit te sluiten. Hersendoorbloeding monitoring kan ook worden gebruikt om intracraniale collaterale circulatie, die ontstaan ​​als een krachtige determinant van een beroerte uitkomst en een mogelijke therapeutische doelwit bestuderen. Ondanks een erkende rol van Laser Doppler perfusie controle in het kader van de huidige richtsnoeren voor experimentele cerebrale ischemie, een aantal technische moeilijkheden bestaan ​​die grens het wijdverbreide gebruik ervan. Een van de belangrijkste problemen is het verkrijgen van een veilige en langdurige bevestiging van een diepe penetratie Laser Doppler probe aan het dier schedel. In deze video laten we zien onze geoptimaliseerde systeem voor cerebrale perfusie controle tijdens voorbijgaande midden cerebrale slagader occlusie door intraluminale gloeidraad in de rat. Wij ontwikkelden in-huis een eenvoudige methode om een ​​op maat gemaakte houder voor twin-vezel (deep-penetratie) Laser Doppler sondes, die multi-site toezicht mogelijk te maken als dat nodig is te verkrijgen. Een continue en langdurige controle van cerebrale perfusie kan gemakkelijk worden verkregen over de schedel intact.

Inleiding

Translationeel onderzoek op hemodynamische factoren die van invloed beroerte pathofysiologie en therapie moet worden uitgevoerd, omdat deze belangrijke kwestie wordt vaak paradoxaal genoeg verwaarloosd door fundamenteel onderzoek studies ^1.

Cerebrale perfusie monitoring is een essentieel, maar onderbenut, tool voor nauwkeurige ischemische beroerte modelleren ^2. Afgezien van de bevestiging van de arteriële schip occlusie en uitsluiting van subarachnoïdale bloeding ^3, kan continue cerebrale perfusie bewaking levert bruikbare gegevens over de mate en de consistentie van de perfusie tekort, de functionele status van intracraniële collaterale vaten en de hemodynamische effect van nieuwe therapeutische benaderingen.

Een recente studie van onze groep blijkt dat multi-site hemodynamische bewaking kan worden gebruikt om intracraniale collaterale circulatie te beoordelen en kan infarctgrootte en functionele tekorten ⁴ voorspellen. Deze experimentele bevindingen zijn Consistent met klinische studies waaruit bleek dat de functionele prestatie van cerebrale collaterale circulatie is voorspellend voor klinische resultaten herseninfarct patiënten ^{5, 6.} Om deze reden zijn cerebrale collateralen wordt aanbevolen omdat het potentiële therapeutische doel in de acute fase van ischemische beroerte ^7.

Laser-Doppler (LD) instrumenten zijn de meest voorkomende instrument dat wordt gebruikt om de cerebrale perfusie in experimentele ischemische beroerte en het gebruik ervan wordt aanbevolen door recente richtlijnen over dit thema ⁸ te meten. LD instrumenten meten microvasculaire perfusie in een kleine corticale volume, de diepte van het opgetekende signaal afhankelijk van de breedte van vezels scheiding met twee vezel LD probes waardoor een diepere penetratie in vergelijking met enkele vezel LD probes ^9. Bloedstroom wordt uitgedrukt in arbitraire perfusie units (PU) die aangeeft relatieve dan absolute cerebrale bloedstroom. Kalibratie van PU wordt meestal uitgevoerd using motiliteit normen, volgens instructies van de fabrikant. LD flowmetrie maakt een continue dynamische monitoring en het genereren van kwantitatieve gegevens binnen dezelfde sessie.

Onder de technische problemen die momenteel het gebruik van LD is een belangrijk probleem het verkrijgen van een veilige en langdurige bevestiging van een diepe penetratie Laser Doppler probe aan het dier schedel. Dit is essentieel voor langdurige bewaking en als er meerdere sondes worden gebruikt voor verschillende cerebrale arteriële gebieden, zoals we presteren in ons laboratorium.

In het bijzonder wordt langere operatietijd wordt vereist als probes zijn bevestigd aan de schedel met boorgaten of craniale schroeven, terwijl een zwakke signaal en onveilige bevestiging treedt op als enkele vezel (laag-penetratie) LD probes zijn aan de schedel eenvoudige chirurgische lijm. Twin fiber (diepe penetratie) LD probes een hoger en meer consistent signaal, maar groter dan enkele vezel probes en kan niet oponthechte de schedel met chirurgische lijm alleen.

In deze video laten we zien onze geoptimaliseerde systeem voor cerebrale perfusie controle tijdens voorbijgaande midden cerebrale slagader occlusie door intraluminale gloeidraad in de rat. We beschrijven een eenvoudige methode om een ​​efficiënte, custom made, goedkope houder voor een of meerdere dubbele vezel (diepe penetratie) LD probes kunnen worden gebruikt voor langdurige controle van hersendoorbloeding de schedel intact verkrijgen.

De chirurgische procedure voor tijdelijke mCaO in de rat te zien in de video-artikel van Uluc en medewerkers ¹⁰ en wordt niet in deze video.

Protocol

1. Hoe de Probe Houder (Single Site of Multi-site) Zorg

1. De benodigde materialen zijn natuurlijke rubber, plastic buizen en een metalen stilet. De probe houder kan worden aangepast aan de grootte van het dier, het aantal en de grootte van de Laser Doppler probes en de cerebrale vasculaire gebied dat moet worden gecontroleerd.
2. Snijd de natuurlijke rubber van de gewenste grootte (ongeveer 10 mm x 10 mm voor 300 g rat).
3. Markeer de positie van de probe (s) en de bregma de natuurlijke rubber, volgens de gewenste stereotactische coördinaten van midden cerebrale slagader occlusie, de typische coördinaten voor ischemische kern worden verwacht bregma -1 mm, 5 mm lateraal van de middellijn, voor een perifere ischemische borderzone grondgebied, kan de verwachte coördinaten zijn op bregma +2 mm, 2 mm lateraal van de middellijn.
4. Markeer duidelijk de positie van de bregma met een X, dit is het symbool voor het bevestigen van de sondehouder de schedel.
5. Plaats de stilet in een plastic buis (de grootte moet overeenkomen met de grootte van de sonde).
6. Plaats de stylet in de natuurlijke rubber op het punt waar de sonde moet worden geplaatst; druk de stylet in de rubber totdat de plastic buis is ingebracht in de rubber ook.
7. Trek de stilet.
8. Als er meerdere sondes nodig zijn, herhaalt u de stappen 1,5-1.7 voor andere probe posities.
9. Optioneel voor meerdere probes: wikkel een band rond de plastic buizen een betere stabilisatie van de probes waarborgen.
10. Optioneel: voer chemische sterilisatie van verschillende probe houders voor toekomstig gebruik.

2. Pre-operatieve voorbereiding

1. MCaO beroerte model wordt meestal uitgevoerd als een survival operatie. In dit geval, zoals getoond in onze video (overlevingstijd 24 uur na de operatie) gebruikt de chirurg een aseptische techniek gesteriliseerde instrumenten en benodigdheden.
2. Verdoof de rat met isofluraan (3% induction fase 1,5% onderhoud).
3. Plaats de rat in buikligging op de operatietafel.
4. Voorzichtig scheren het hoofd van de rat.
5. Breng een antiseptische oplossing voor een gaasje en desinfecteer de huid.
6. Toedienen lidocaïne 2% 5 mg / kg subcutaan in de craniale gebied.

3. Probe plaatsen en bevestigen In de loop der Intact Skull

1. Sla rechtsaf paramediane incisie in de huid (voor rechts mCaO) en ontleden het subcutane weefsel van de craniale fascia (Galea aponeurotica) te bereiken.
2. Sla rechtsaf paramediane incisie in de craniale fascia en het uitvoeren van stompe dissectie van de schedel te bereiken; opstellen van een schedel gebied dat groot genoeg is voor de toepassing van de sonde houder.
3. Let op: geen behoefte voor het boren of bot dunner.
4. Breng Merbromin oplossing te desinfecteren en drogen de schedel oppervlak.
5. Gebruik een föhn (set voor koude lucht) versneld te drogen de schedel oppervlak.
6. Op dit punt, de schedelnaden en de bregma duidelijk zichtbaar.
7. Pas de sonde houder door het snijden van de randen met een steriele schaar.
8. Breng een kleine hoeveelheid van chirurgische lijm (Cyanoacrylaat, veterinaire-toegelaten) aan het oppervlak onder de sonde houder, zorgvuldig vermijden van de inferieure opening van de plastic buisjes (let op: indien een aanzienlijke hoeveelheid lijm blijft tussen het optische oppervlak van de sonde en de schedel, kan dit produceren een laag-signaal en kan de sonde beschadigd na meerdere toepassingen).
9. Breng de sonde houder aan de schedel oppervlak zorgvuldig afstemmen van de bregma met de X landmark. Druk zachtjes op de sonde houder.
10. Gebruik een föhn (set voor koude lucht) versneld te drogen de chirurgische lijm.
11. Zet de probe houder door koppelverkoop een chirurgische draad rond de sonde houder en de kop van het dier, wees voorzichtig zijn om de chirurgische draad plaats deze boven de mandibula, het vermijden van de submandibulaire regio en ee nek.
12. Optioneel: Vul de plastic buis (buizen) van de probe houder met een optische gel (bijvoorbeeld een gemeenschappelijke echografie of elektrocardiografie gel), hetgeen de kwaliteit van het signaal te verhogen LD.
13. Plaats de probe (s) in de probe houder en controleer de actuele meting van de LD flowmeter. Gebruik de LD stromingsmeter volgens instructies van de fabrikant.
14. Bevestig de sonde (s) binden ze rond het hoofd van het dier, wees voorzichtig zijn om de chirurgische draad plaats deze boven de mandibula, het vermijden van de submandibulaire regio en de nek.

4. Cerebrale Perfusie Monitoring Tijdens mCaO

1. Plaats de rat in rugligging, zorgvuldig vermijden van maximale aandrijfkracht krachten op de sonde (s) of probe houder.
2. Start cerebrale perfusie monitoring tijdens mCaO.

5. Verwijderen van de sonde (s) en sondehouder

1. Snijd de hechtingen rond de probe (s), de probe houder en de kop van het dier.
2. Voorzichtig bot ontleden craniale zachte weefsels en de huid rond de natuurlijke rubber basis van de probe houder.
3. Verwijder de sonde houder.
4. Breng een antiseptische oplossing aan de schedel oppervlak.
5. Hecht het craniale huid.

6. Post-operatieve Zorg

1. Dien 2,5 ml zoutoplossing subcutaan tegen uitdroging en houdt het dier warm met een verwarmingselement na het stoppen gasvormige anesthesie.
2. Om te overleven chirurgie: bieden preventieve analgesie met Ketoprofen 4 mg / kg subcutaan en herhaal dezelfde dosis bij 12 uur post-operatief
3. Onder onze experimentele omstandigheden werd euthanasie uitgevoerd op 24 uur na de operatie door _CO2 inhalatie.

Resultaten

Transient mCaO (60 min) werd geïnduceerd door toevoeging van een siliconen gecoat filament in de externe halsslagader. Het filament werd vervolgens doorgedrukt het uiteinde van de interne halsslagader tot de oorsprong van de MCA, onder LD monitoring. Halsslagader en pterygopalatin slagader werden tijdelijk afgesloten tijdens de chirurgische inbrengen van het filament. Een schematische weergave van de chirurgische procedure is weergegeven in figuur 1A.

De craniale coördinaten voor het positioneren van de twee LD probes zijn gekozen volgens de onderliggende arteriële gebied. Voorlopige experimenten met gelatine-inkt perfusie (Figuur 1B) was de ischemische kern wordt in de centrale MCA territorium (bregma -1 mm, 5 mm middellijn, Probe 1), terwijl de collateralen wordt verwacht in het gebied tussen de borderzone corticale takken van middelste en anterieur cerebrale slagaders (bregma +2 mm, 2 mm van middellijn; Probe 2).

Cerebrale hemodynamiek werd bestudeerd met multi-site Laser Doppler probes tijdens de gehele duur van de chirurgische procedure, dat wil zeggen vóór, tijdens en na mCaO (figuur 2). De hersendoorbloeding deficit mCaO kleiner en toonden een hogere mate van variabiliteit in Probe 2 in vergelijking met Probe 1, suggereert interindividuele verschillen in de functionele performantie van intracraniale collateralen onder ischemische aandoeningen. De multi-site Laser Doppler controle maakt het ook mogelijk om de cerebrale hemodynamische veranderingen te bestuderen tijdens de occlusie van proximale extra-craniale cerebrale slagaders (arteria carotis communis, interne halsslagader, pterygopalatin slagader).

Stroke resultaat werd vastgesteld 24 uur na reperfusie door infarctvolume, berekend op 19 opeenvolgende secties gekleurd met cresyl violet (figuur 3), en Garcia functionele neuroscore ^11. Immunohistochemie op specifieke markers assohorende met ischemische hersenletsel werd uitgevoerd, om een ​​topografische verdeling van neuronaal verlies (microtubule geassocieerd proteïne 2, MAP2) en ischemische penumbra (heat shock protein-70, Hsp70) ten opzichte krijgen tot de multi-site hemodynamische bewaking van intracraniale verkeer (Figuur 4).

Figuur 1. Cerebrale perfusie monitoring tijdens de intraluminale mCaO bij de rat. A. Schematische weergave van de chirurgische procedure voor transiënte mCaO. Een silicone beklede filament werd gebruikt om de oorsprong van de MCA af te sluiten, na te zijn ingebracht in de externe halsslagader en geduwd door de interne halsslagader. Proximale cervicale slagaders werden ofwel geligeerd (externe halsslagader) of tijdelijk afgesloten (pterygopalatin slagader en gemeenschappelijke halsslagader) tijdens de proceduredure. B. Een vertegenwoordiger hersenen wordt getoond na gelatine-inkt kleuring. Transcardiale perfusie van gelatine-inktoplossing uitgevoerd 60 min na het begin van ischemie zonder reperfusie. De normaal doorbloed brein werd gekleurd door gelatine-inkt en verscheen als grijs-gekleurd met zwart gebeitst schepen, terwijl de ischemische (niet-geperfundeerde) gebied bleef onbesmet (roze-gekleurd). Craniale coördinaten voor het positioneren van de twee probes LD getoond. Probe 1 = 1 mm uit bregma, 5 mm van middellijn; Probe 2 = +2 mm van bregma, 2 mm van middellijn.

Figuur 2. Cerebrale hemodynamische opnamen met behulp van multi-site Laser Doppler probes. Een typisch hemodynamische patroon dat functioneel actief intracraniële collateralen suggereert onder ischemische omstandigheden wordt getoond. In dit dier LD traceringen vertoonde eener perfusie tekort in Probe 2 kanalen, in vergelijking met 1 kanaal, zowel tijdens CCA occlusie en MCA occlusie Probe. MCA-O = midden cerebrale slagader occlusie. CCA-O = gemeenschappelijke occlusie van de halsslagader. PU = perfusie-eenheden.

Figuur 3. Representatieve hersencoupes voor de berekening van infarctvolume Histologische coronale secties (50 um, n = 19 met 250 pm interval; bregma +2,5 mm tot -3,0 mm). Worden gefixeerd in 4% paraformaldehyde en gekleurd met cresyl violet 0,1%. Infarct volume wordt berekend met behulp van ImageJ software voor beeldverwerking, gecorrigeerd voor inter-hemisferische asymmetrie als gevolg van hersenoedeem, en uitgedrukt in mm ^3. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken

Figuur 4. Immunokleuring van moleculaire markers van neuronaal verlies en penumbra Representative opeenvolgende hersencoupes getoond die werden gekleurd met cresyl violet 0,1% (A) of immunogekleurd met markers van neuronaal verlies (microtubule geassocieerd proteïne 2, MAP2; B). Ischemische penumbra en (heat shock protein-70, Hsp70, C).

Discussie

We ontwikkelde een eenvoudige en goedkope systeem voor een veilige bevestiging van een of meerdere twin-vezel (diepe penetratie) LD sondes naar de intacte schedel van ratten tijdens de mCaO procedure. Zij blijkbaar een triviaal probleem het verkrijgen van een betrouwbare bevestiging van de LD probe de schedel is eigenlijk een groot probleem in deze experimentele opstelling, omdat de voorwaarde voor een soepele signaaldetectie en een succesvolle controle van cerebrale perfusie.

Invasieve procedures, zoals boorgaten en botschroeven, meestal verlengt de chirurgische tijd invoeren experimentele variabelen die betrekking hebben craniotomie, en dit kan ontmoedigen onderzoekers en onthouden te gebruiken LD monitoring. Anderzijds is het gebruik van enkele vezel (lage penetratie) probes, die dunner en relatief eenvoudiger om te verlijmen op de schedel oppervlak geeft lage kwaliteit signaal en niet betrouwbaar kan worden gebruikt bij volwassen ratten zonder boren of dunner de schedel.

We gebruikten eenvoudige en goedkope materialen, zoals natuurlijke rubber, plastic buizen en een metalen stilet. Een maat sondehouder kunnen in enkele minuten en aan de experimentele omstandigheden. Deze probe houders zijn geschikt voor een of meer diep-penetratie LD sondes, voor de klassieke single-site monitoring op de ischemische kern of voor meerdere controle ter plaatse in verschillende arteriële gebieden in hetzelfde halfrond of over de twee hersenhelften. Veel probe houders kunnen worden geproduceerd, chemisch gesteriliseerd en opgeslagen voor toekomstig gebruik. Veterinaire goedgekeurde chirurgische lijm (cyanoacrilate), versneld door koude lucht, wordt gebruikt om de probe houder tegen het oppervlak van de intacte rat schedel volgens de gewenste craniale coördinaten. Tenslotte wordt de probe set-up verder plaats bevestigd overeenkomende hechtingen.

De totale tijd van deze LD sonde set-up, na het beheersen van deze techniek, is ongeveer 10 minuten.

Zoals in deze video we routinematig controleren hersendoorbloeding in het centrale gebied MCA (LD probe 1: ischemische core) en in de perifere MCA territorium (LD probe 2: voornamelijk een bijschaduw gebied). In onze recente studie toonden we aan dat de variabiliteit van de bloedstroom veranderingen in LD probe 2 (gemiddeld 52% ± 16% SD, ten opzichte van de basislijn) is hoger dan LD probe 1 (gemiddeld 31% ± 6% SD, vergeleken met de baseline) en kan worden gebruikt om een beroerte uitkomst ⁴ voorspellen.

Wij kunnen een aantal trouble-shooting adviezen voor onderzoekers die willen graag onze in eigen huis ontwikkelde systeem te gebruiken. Aan het begin van het experiment voorzichtig zeer goed drogen schedel oppervlak (met Merbromin koude lucht) alvorens de probe houder voortijdig loslaten te voorkomen. Bovendien moet u de lijm op de natuurlijke rubber, vermijden van contact met het open uiteinde van de kunststofbuis en het optische oppervlak van de LD probe, slechte signaal en mogelijke schade aan de probe te voorkomen. Wanneer binding van de hechting om het hoofd van het dier voorzichtig om luchtwegobstructie voorkomen (dit wordt voorkomen door het positioneren van de hechtdraad over de onderkaak bot). Na het plaatsen van en het veiligstellen van de sondes, wees voorzichtig niet om de tractie te probe kabels bij het draaien van het dier in rugligging voor cervicale chirurgie; deze stap vereist meestal twee personen, een persoon die houder is van het dier en een tweede persoon die de sonde kabels en voorzichtig plaats ze naar de gewenste positie. Tot slot wordt uiteindelijk besmet bloed van de twin-vezel LD sonde gemakkelijk worden beheerd volgens de reinigingsinstructies van de fabrikant.

Onze geoptimaliseerde systeem voor cerebrale perfusie monitoring, zoals in deze video, zou zorgen voor een eenvoudiger, sneller en betrouwbaarder alternatief voor de probe set-up-systemen die momenteel door commerciële bedrijven worden verkocht op dit gebied. Bovendien geloven we dat het gebruik van dit systeem door andere onderzoekers de tap versterkeny van cerebrale hemodynamiek in het experimentele slag veld leiden tot de ontwikkeling van een nieuwe generatie van cerebrale zekerheid therapeutica.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
			Uitrusting
MoorVMS-LDF 2-kanaals Laser Doppler Monitor	Moor Instrumenten
VP12 sonde	Moor Instrumenten
			Reagens / Materiaal
Doccol silicium gecoate monofilamentgrootte 4-0, diameter met coating 0.39mm	Doccol Corporation	403956PK10
Natuurlijke rubber, bijvoorbeeld gemeenschappelijke fopspenen voor baby's			Meervoudigleveranciers
Metalen stilet, bijv. van spinale naald 18 GA x 90 mm			Meerdere leveranciers
Plastic buizen, bijv. van ader set voor intraveneuze infusie 25 GA x 20 mm			Meerdere leveranciers
Niet-resorbeerbaar hechtdraad, bekleed, gevlochten zijde			Meerdere leveranciers
Cyanoacrylaat chirurgische lijm			Meerdere leveranciers
Isofluraan (100% v / v) voor diergeneeskundig gebruik			Meerdere leveranciers