Angiogenese in het ischemische Rat Lung

Samenvatting

De long is doorbloed door zowel de systemische bronchiale arterie en longslagaders. In de meeste long ziekten is de kleinere systemische vasculatuur die robuust neovascularisatie toont. Beëindiging van pulmonale bloedstroom bevordert stevige bronchiale angiogenese. Wij bieden chirurgische details van het induceren van linker longslagader ischemie dat bronchiale neovascularisatie bevordert.

Samenvatting

De volwassen long geperfundeerd door zowel de systemische bronchiale slagader en de hele veneuze terugstroom die door de longslagaders. In de meeste long ziekten is de kleinere systemische vasculatuur die beantwoordt aan een behoefte voor verbeterde longperfusie en toont robuust neovascularisatie. Pulmonale vasculaire ischemie geïnduceerd door pulmonale obstructie is te leiden tot een snelle systemische arteriële angiogenese in de mens en in verschillende diermodellen. Hoewel de histologische beoordeling van het tijdsverloop van bronchiale arterie proliferatie bij ratten werd zorgvuldig beschreven door Weibel ^1, mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze georganiseerde groei van nieuwe schepen zijn niet duidelijk. Wij chirurgische gegevens induceren linker longslagader ischemie in de rat die leidt tot bronchiale neovascularisatie. Kwantificering van de mate van angiogenese een extra uitdaging door de aanwezigheid van de twee vasculaire bedden in de longen. Methodenfunctionele angiogenese gebaseerd op gelabelde microsferen injecties bepalen voorzien.

Inleiding

Systemische angiogenese in de longen is goed herkend. In ziekten zoals astma ^2, interstitiële longfibrose ^3, kanker ⁴ en chronische pulmonaire embolie ^5, de systemische vasculatuur in en rond de longen prolifereert en rond het longparenchym. Echter diermodellen deze differentiële activering van de systemische plaats van de pulmonale circulatie bestuderen weinig. Misschien is de meest reproduceerbaar model van systemische neovascularisatie in de longen van de volwassen zoogdier voorvallen na inductie chronische pulmonale ischemie. De reactie naar links longslagader obstructie in mensen ^5-7, honden ^{8, 9} varkens, schapen ^{10, 11} cavia's, ratten ^{1, 12, 13} en ¹⁴ muizen is de snelle verspreiding van de bronchiale arterie als intercostale arteriën. De mechanismen die verantwoordelijk zijn voor systemische neovascularisatie van de long na pulmonale ischemie zijn grotendeels onbekend en zijn niet uitgebreid bestudeerd. Het tijdsverloop van bronchiale angiogenese in de rat na linker pulmonale obstructie is nauwkeurig beschreven in het werk van histologische Weibel ^1. Breiden dit werk in de rat heeft ons laboratorium gericht op zowel de groeifactoren belangrijk in dit proces en de fysiologische resultaten van deze neovasculatuur in de longen. Resultaten tonen de CXC chemokine CINC-3 verheven vroeg na ischemie en behandelen ratten met een neutraliserend antilichaam tegen CXCR2, de receptor voor CINC-3, verzwakt angiogenese ^13. De nieuw ingestelde bronchiale vasculatuur 14 dagen na het begin van pulmonale ischemie werd aangetoond dat abnormale aanzienlijk verhoogde permeabiliteit eiwit ^15. Linker longfunctie niet normaal tonen verminderde diffusiecapaciteit en een afname in longvolume ^15. Hoewel de neovasculatuur kunnen contributed het behoud van longweefsel tijdens chronische pulmonaire ischemie lijkt niet normaal en kan bijdragen aan een aanhoudende daling in longfunctie.

Misschien wel een van de meest curieuze aspecten van dit model heeft betrekking op de ruimtelijke verdeling van prolifererende bloedvaten. Ondanks de afgifte van groeifactoren in het longparenchym door ischemie, de neovasculatuur afkomstig zijn relatief grote upstream bronchiale arteriën. De normale bronchiale arterie ontstaat als een kleine tak van de aorta en binnendringt de luchtwegen boom aan de carina. Aldus het mechanisme waarmee groeifactoren induceren de beginfase van arteriogenese is niet duidelijk. Wij stellen voor dat de rat, met een vasculaire anatomie vergelijkbaar met de mens, een unieke kans om de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor systemische angiogenese tijdens pulmonale ischemie te bestuderen. Hoewel volledige obstructie van de linker longslagader is een zeldzame gebeurtenis in de menselijke proefpersonen,verhoogde bronchiale vascularisatie blijkt eveneens worden geïnduceerd bij patiënten ongeacht de plaats en de grootte van pulmonale obstructie ^16. Zo hebben we een gedetailleerde beschrijving van de chirurgische benadering naar links longslagader in ratten en een middel om de omvang van angiogenese kwantificeren ligeren.

Protocol

Alle protocollen uitgevoerd op ratten zijn goedgekeurd door de Johns Hopkins University Animal Care en gebruik Comite en in overeenstemming met de NIH richtlijnen. Indien mogelijk moet het dier chirurgisch voorbereid in een gebied gescheiden van de chirurgische ruimte om verontreiniging van de operatieplaats te minimaliseren.

1. Anesthesie / analgesie

1. Place rat (Sprague Dawley mannelijke ratten, 125-150 g, Harlan, Indianapolis, IN) in een inductiekamer doordrenkt met 3% isofluraan.
2. Plaats verdoofde rat op een operatie boord aan neuskegel en ventilator met 3% isofluraan anesthesie. Steriele techniek voor alle procedures. Drapeer rat aan steriel operatieveld te garanderen.

2. Intubatie

1. Immobiliseer appendages in liggende positie met behulp van chirurgische tape.
2. Verwijder rat uit neuskegel, uit te breiden tong met gevoerde tang.
3. Gebruik 14 gauge intracath met afgestompte metalen stilet als gids. Schuif achter omngue, in trachea.
4. Verwijder metalen stilet het verlaten van wit kunststof intracath in de luchtpijp. Zorg ervoor dat de rat ademt en lucht stroomt door de buis.
5. Vervang neuskegel met directe adapter katheter, sluit rat ventilator (90 ademhalingen / min; 8 ml / kg ademvolume; Knaagdieren Ventilator Model 683, Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts).
6. Breng Puralube (Butler Schein, Dublin, OH) veterinaire zalf op de ogen.

3. Thoracotomie

1. Plaats rat de goede kant omlaag, immobiliseren appendages met behulp van chirurgische tape.
2. Shave linkerkant ribbenkast gebied.
3. Verwijder overtollig vacht met kleine vacuüm.
4. Maken steriel veld afvegen met alcohol gevolgd door povidonjood swabstick (Dynarex Corporation, Orangebur, NY). Herhaal dit proces nog twee keer (voor een totaal van drie scrubs).
5. Maak dwarse incisie met een steriele ontleden schaar of steriel scalpel in het centrum van het veld.
6. Blunt ontleden door layers van weefsel en vet tot ribben (laatste laag is dun membraan dat ribben).
7. Tel ribben staat in ³ intercostale ruimte te bepalen.
8. Met behulp van steriele 45 ° Graefe tang, maken stompe incisie tussen de 3 ^e en 4 ^e rib.
9. Plaats rib afscheiders, trek voorzichtig het creëren van open leegte met volledige visualisatie van long-, plaats tape op hechtingen open te houden.

4. Links longslagader Ligatie

1. Met 90 ° Graefe tang, terug te gaan linker long met de rechter hand.
2. Met behulp van Dumont patroon # 5 rechte pincet, pak links longslagader en luchtweg met de linkerhand. Links longslagader legt op de top van de luchtwegen. Zorg ervoor dat pincet direct loodrecht op de tafel. Bovendien is het meest effectief ophalen linker longslagader / linker hoofdstam bronchus de meest distale positie (het dichtst bij parenchym). Opzij Duw de ventilatie linker long met deze linkerhand manoeuvre.
3. Gebruik Dumontpatroon # 5 45 ° gebogen tang naar links longslagader te scheiden van de linker hoofdstam bronchus op hun natuurlijke grenzen. Deze scheidingslijn verschijnt dun en wit tussen de twee afzonderlijke structuren.
4. Scheid direct onder slagader zonder tussenkomst van het vaartuig; soepel schuift u de tang tips bij elkaar gehouden langs de scheiding.
5. Ga verder tot tips van tang hebben zichtbaar gescheiden van de linker longslagader en de linker hoofdstam bronchus. Slechts een klein punt van tip moet volledig door. Als bloed kan worden gevisualiseerd op het uiteinde van de forceps, dan is het niet volledig door ligatie en moet niet worden geprobeerd. Eenmaal door de ruimte, zal de linker longslagader leggen op de curve van de forceps. Houd deze positie.
6. Voorzichtig los rechte stompe pincet greep (linkerhand) en pak stuk van een pre-cut hechtdraad (~ 2-3 cm; polypropyleen hechtdraad grootte 6-0; Myco Medical, Cary, NC).
7. Open gebogen tang wiegt links longslagader en grab hechtdraad. Trek hechtdraad door de ruimte tussen de linker en rechter longslagader hoofdstam bronchus in een opwaartse beweging ten opzichte van de curve van de forceps.
8. Bind beneden het afsluiten van de linker long met een platte knoop, zorgvuldig knip rest van hechtdraad.
9. Sluiten ribben met stompe tang om rib en hechtdraad twee keer vast te houden met polypropyleen (blauw monofilament) size 4-0 bevestigd aan een 19 mm, 3/8 cirkel achteruit snijden naald (Myco Medical, Cary, NC) in een hemostat, zorg dat u hechtdraad huid (alleen ribben).
10. Vul een losse platte knoop, de longen opblazen, plaats op positieve eind-expiratoire druk (PEEP; twee-vijf cmH ₂ O), strak hyperinflate longen dan stevige knoop, en maak een andere volledige knoop voor knippen rest van hechtdraad. Uit PEEP en visualiseren gedurende 30 seconden zodat de longen niet instorten. Breng 5 druppels Bupivicaine (APP Pharmaceuticals, Schaumbur, IL).
11. Dichtbij de huid door het plaatsen van weefsel lijm op de wond en samen duw huid met behulp van back end van katoen tip applicator. Bupivicaine geven (2,0 mg / kg subcutaan) op de plaats van incisie vervolgens elke 8 uur gedurende 24 uur of totdat het dier hervat normale activiteit. Als subcutane laag in dit gebied is zeer dun, is het niet gemakkelijk te hechten op zichzelf. Wanneer het weefsel lijm wordt aangebracht en de huid wordt samengedrukt sluit ook de onderhuidse laag.
12. Schakel isofluraan gas, maar blijven de rat ventileren voor 1-2 minuten op lucht in de ruimte tot vrijwillige beweging terugkeert. Koppel de tracheale tube van de ventilator en ervoor te zorgen dat de rat spontaan ademt voordat u deze verwijdert.
13. Veeg Puralube van de ogen met een wattenstaafje en monitor beweging en herstel. Injecteer buprenorfine hydrochloride (0,05 mg / kg intraperitoneaal, Butler Schein, Dublin OH). Verder levering van analgetische elke 12 uur gedurende 48 uur na de operatie.

5. Linker halsslagader Canulatie

Om de omvang van de bronchiale perfus beoordelenion van het ischemische linker long op gewenste tijdstippen na linker longslagader ligatie injecteren gelabelde microsferen door de linker halsslagader in de aortaboog. Bereid ratten zoals hierboven 1-2.

1. Snijd middellijn langs de hals, bot ontleden om luchtpijp en linker halsslagader (microsfeer injectieplaats) te onthullen.
2. Breng de katheter gevuld met gehepariniseerde zoutoplossing, stompe punt van PE20 leidingen (Becton Dickinson, Sparks MD) in vat aangesloten op 25 g naald, 4-weg kraan, 1 ml spuit.
3. Place fles microsferen (15 urn polystyreen crimson fluorescerende microbolletjes, 1 x 10 ⁶ bollen / ml, Invitrogen, Eugene, OR) in water sonicator gedurende 30 sec.
4. Verwijder fles, vortex en het opstellen van 0,5 ml (500.000 microsferen) in een 1 ml Hamilton glazen injectiespuit (Hamilton Company, Reno, NV) door middel van een 20 g naald.
5. Bevestig Hamilton injectiespuit tot 4-wegkraan en bezielen microsferen met injectiepomp (tarief: 500 pl / min; Genie Plus, Kent Wetenschappelijk, Torrington, CT).
6. Verwijderen Hamilton spuit en inrichting flush met 1 ml zoutoplossing heparized 500 ul / min.
7. Voer volle borst thoracotomie en exsanguinate de rat door het beëindigen van de vena cava inferior.
8. Verwijder de linker long en andere weefsels van belang.
9. Om microsferen extraheren van weefsel neemt de gehele linker long van de rat na leegbloeden en plaats het in 2 M KOH (4-6 ml). Leg ze in een 55 ° C waterbad en laat het een nacht voor weefsel spijsvertering. Voeg Tween 80 (0,25%) tot de korrels wassen vortex (10 sec) en gecentrifugeerd (2000 rpm, 20 ° C gedurende 10 min). Verwijder het supernatant, voeg 2-ethoxyethylacetaat (1 ml), vortex en laat het 1 uur. Vortex de suspensie en centrifuge (2000 rpm; (20 ° C gedurende 10 min) Verwijder de 2-ethoxyethylacetaat waterige laag die de fluorescentie in een cuvette en meten met een Hitachi F-2500 fluorescentiespectrofotometer (excitatie 612/emission 618. ; Digilab, Holliston, MA).

Resultaten

Vasculaire cast: Resultaten van de effecten van linker longslagader ischemie in de rat zijn afgebeeld in figuur 1. Afgebeeld is een methacrylaat cast van de bronchiale bloedvaten en de uitgebreide vascularisatie van de linker luchtwegen boom 28 dagen na LPAL. Deze cast verkrijgen werd de systemische vasculatuur geïnjecteerd met een mengsel methacrylaat (rood), retrograde in de dalende aorta en de trachea werd gecannuleerd en ingespoten met een witte siliconen gebaseerd materiaal. Deze vasculaire cast ee...

Discussie

Links longslagader ligatie bij alle proefdieren leidt tot robuuste systemische neovascularisatie van de ischemische long. We hebben ingediend de details van de chirurgische benadering in een rat model. De resultaten van vasculaire gieten, histopathologie en in vivo labeling tonen dat bronchiale arteriën prolifereren en perfuseren het longparenchym. Aldus kan de mechanismen van bronchiale angiogenese worden bestudeerd in een diermodel dat de menselijke toestand van chronische pulmonaire embolie parallel. Bovendi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagentia:	Vennootschap
buprenorfinehydrochloride, Puralube	Butler Schein
bupivicaine	APP Pharmaceuticals
Povidonjood swabstick	Dynarex Corporation
polypropyleen hechtdraad size 6-0, 3/8 cirkel achteruit snijden naald	Myco Medische
PE20 leidingen	Becton Dickinson
15 pm crimson polystyreen fluorospheres	Invitrogen
1 ml Hamilton glazen injectiespuit	Hamilton Company
Uitrusting:
Genie Plus injectiepomp	Kent Wetenschappelijke
Fluorescentiespectrofotometer	Digilab
Knaagdieren Ventilator Model 683	Harvard Apparatus
			Tabel 1. Tabel van specifieke reagentia en apparatuur.