Een semi-automatische micro-electro-fluidisch methode om on-demand motoriek induceren in Caenorhabditis elegans Is beschreven. Deze methode is gebaseerd op het verschijnsel van neurofysiologische wormen reageren op milde elektrische velden ("electrotaxis") in microkanalen. Microfluïdische electrotaxis dient als een snelle, gevoelige, low-cost, en schaalbare techniek voor het screenen op factoren die van invloed neuronale gezondheid.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Microfluïdische-based Electrotaxis voor On-demand Kwantitatieve analyse van
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De nematode Caenorhabditis elegans is een veelzijdige modelorganisme voor biomedisch onderzoek vanwege het behoud van ziektegenen en trajecten alsmede het gemak van de teelt. Verschillende C. elegans ziektemodellen gemeld, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson (PD), die de degeneratie van dopaminerge (DA) neuronen 1 omvat. Zowel transgenen en neurotoxische chemicaliën zijn gebruikt om DA neurodegeneratie en beweging defecten daaruit in wormen induceren, waardoor onderzoek naar de basis van neurodegeneratie en schermen voor genen en neuroprotectieve verbindingen 2,3.
Schermen in lagere eukaryoten, zoals C. elegans een doelmatige en economische manier op verbindingen en genen die neuronale signalering te identificeren. Conventionele schermen worden meestal handmatig uitgevoerd en gescoord door visuele inspectie, dus ze zijn tijd-consuming en gevoelig voor menselijke fouten. Bovendien, de meeste nadruk op celniveau analyse terwijl het negeren locomotievorm is een bijzonder belangrijke parameter voor bewegingsstoornissen.
We hebben een nieuwe microfluïdische screening systeem (figuur 1), dat controleert en kwantificeert C. ontwikkeld locomotion elegans 'met elektrisch veld stimuli binnen microkanalen. We hebben aangetoond dat een gelijkstroom (DC) veld robuust kan induceren on-demand voortbeweging naar de kathode ("electrotaxis") 4. Verwisseling van de polariteit van het veld zorgt ervoor dat de worm snel achteruit zijn richting ook. We hebben ook aangetoond dat defecten in dopaminerge en andere sensorische neuronen weg zwemmen respons 5. Daarom kunnen afwijkingen in neuronale signalering worden bepaald met beweging als read-out. De respons beweging kan nauwkeurig worden gekwantificeerd aan de hand van een reeks parameters zoals zwemmen snelheid, lichaam buigen frequentie en omkering tijd.
4. Deze bevindingen leidden ons naar een nieuwe microfluïdische apparaat om passief te sorteren wormen naar leeftijd en fenotype 6 ontwerpen.
We testten ook de reactie van wormen gepulseerde gelijkstroom en wisselstroom (AC) elektrische velden. Gepulseerde DC velden van verschillende duty cycles effectief gegenereerd electrotaxis in beide C. elegans en zijn neef C. briggsae 7. In een ander experiment, symmetrisch wisselvelden met frequenties van 1 Hz tot 3 kHz geïmmobiliseerde wormen in het kanaal 8.
Uitvoering van het elektrische veld in een microfluïdische omgeving maakt een snelle en geautomatiseerde uitvoering van de electrotaxis assay. Deze benadering belooft high-throughput genetische en chemische schermen voor factoren vergemakkelijkeninvloed neuronale functie en leefbaarheid.
Protocol
1. Fotolithografie voor Master Mold Fabrication
- Baden een 3 inch siliciumwafel in aceton gedurende 30 seconden en vervolgens methanol gedurende 30 sec. Spoelen met dH 2 0 water gedurende 5 minuten.
- Droog het oppervlak van de wafer met een N2 klap pistool. Verwarm de wafer op een hete plaat bij 140 ° C gedurende 2 minuten.
- Plasma oxideren van het oppervlak van de siliciumwafel (1 min, 50 W).
- Spin-coat oppervlak van de wafer met 3 ml SU-8 100 fotolak (40 sec; 1750 rpm).
- Pre-bak de gecoate wafer op een hete plaat bij 65 ° C gedurende 10 min, waarna uitloop de temperatuur tot 95 ° C gedurende 2 minuten. Handhaaf deze instelling voor een extra 1 uur.
- Lijn een fotomasker met het gewenste kanaal ontwerp. Expose de weerstaan om 550-600 mJ / cm 2 van UV-licht (350-400 nm). Fotomaskers kunnen worden ontworpen in AutoCAD en afgedrukt op een transparant met een hoge resolutie afdrukken.
- Post-bak de wafer op een hete plaat bij 65 ° C gedurende 1 min en 95 ° C gedurende 10 min, t rampingHij temperatuur als voorheen.
- Dompel de wafer in SU-8 developer oplossing voor 10-15 minuten. Controleer de voltooiing van de ontwikkeling door spoelen met isopropanol. Als een witte neerslag ontstaat, blijven ontwikkelen. De master vorm wordt getoond in figuur 2A.
2. Zachte lithografie voor Microchannel Fabrication
- Meng 35 ml polydimethylsiloxaan (PDMS) elastomeer basis met 3,5 ml PDMS verharder.
- Plaats de gefabriceerde meester mal (patroon naar boven) en een lege silicium wafer in petrischalen bekleed met aluminiumfolie.
- Giet 20 ml PDMS pre-polymeer in de master-mal schotel en 15 ml in de tweede schaal. Elimineer luchtzakken onder de wafers door zachtjes te drukken op hen met een wegwerp houten applicator.
- Bedek beide gerechten en gereserveerd voor een dag om te genezen. Als alternatief voor een snellere uitharding, verwijder luchtbellen uit de PDMS gebruik van een vacuüm ontgasser en dan laat de gerechten op een hete plaat bij 80 ° C gedurende 2hr.
- Verwijder de folie en schil de PDMS van de wafers.
- Gebruik Harris Uni-Core (2,5 mm) om vloeistof toegangspoorten slaan aan beide einden van het kanaal. Snijd het kanaal en blanco PDMS in vergelijkbare grootte reepjes.
- Laad het kanaal, de lege PDMS strip en een glasplaatje (75 × 25 mm 2) in een plasma oxidator, waarschijnlijk gelegen in een cleanroom. Blootstellen aan zuurstof plasma gedurende 40 sec bij 40 W vermogen.
- Plak het kanaal stuk en glasplaatje aan weerszijden van het lege strip. Gereserveerd voor 2 uur om de hechting te voltooien.
- Plaats het geheel op een hete plaat bij 120 ° C. Bevestig kunststof buis (binnendiameter 1/32 "diameter 3/32"), elk ten minste 6 inch lang, aan de geperforeerde reservoirs met PDMS prepolymeer. Aanbrengen van een vloeibare plastic connector aan een of beide buizen te spuiten beslag laten, of in de handel verkrijgbare hulpstukken.
- Sta het PDMS veiligstellen van de slang te genezen. Plaats 3 "lengtes van 22 gauge geïsoleerde koperdraad in each reservoir, tussen de inlaat buis en het kanaal, en veilig met PDMS pre-polymeer. Het eindproduct is weergegeven in figuur 2B.
3. Electrotaxis Experiment
- Plaats de microkanaal op het podium (bij voorkeur XY-verplaatsbare) van een microscoop met een gemonteerde camera is aangesloten op een monitor (figuur 1).
- Sluit de voeding of uitgangsdraden versterker naar de elektroden van de microchannel's. Een eenvoudige DC voeding voldoende is als alleen een DC-signaal wordt gewenst, maar een versterker aangesloten op een functie generator maakt gebruik van gepulste DC-en AC-signalen ook.
- Bevestig eindbuis de microchannel om een wegwerpspuit. Dompel de monding van de inlaatbuis in M9 fysiologische buffer en voorzichtig streven vloeistof in het kanaal door een onderdruk in de spuit (manueel of met behulp van een injectiepomp). Wanneer de inlaat en uitlaat pijpen zijn beide gevuld met M9, koppel de spuit from de buis. Niveau beide buizen dezelfde hoogte hydrostatisch aangedreven stromen voorkomen.
- Breng een gelijkspanning aan het kanaal en ervoor zorgen dat de weerstand (R = V / I) is ongeveer 0,6 MQ (voor een 50 mm lang, 0,3 mm breed en ~ 0,1 mm diep microchannel).
- Als u tevreden bent met de integriteit van het kanaal, volgt u de bovenstaande stappen om wormen te laden van een verdunde suspensie in het kanaal.
- Koppel de spuit en hydrostatisch manipuleren de stroming door het aanpassen van de buizen 'relatieve hoogte. Gebruik deze methode om een worm te plaatsen in het midden van het kanaal en dan leg beide buizen plat op dezelfde hoogte.
- Zet de voeding aan op de juiste spanning: 4-12 V / cm voor L3 stadium dieren, 4-10 V / cm voor L4S en 2-4 V / cm voor jonge volwassenen. Activeert het elektrische signaal en laat 1 min van de pre-exposure voor de worm te acclimatiseren aan het veld. De worm moet beginnen richting de kathode. Wanneer de minuut voorbij is, gebruikt u de camera om de opname te starten.
- Voor AC en polsslagd DC experimenten, kan de maximale responsieve elektrisch veld van boven en de frequentie en de duty cycle van het signaal worden aangenomen kan worden gemoduleerd zoals gewenst 7, 8.
- Als experiment is voltooid, verwijdert alle vloeibare (en wormen) uit het kanaal, spoelen met dH 2 0, en laat het apparaat op een hete plaat bij 125 ° C om te drogen.
- Uittreksel motorische gegevens van opgenomen video's handmatig met NIH ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) of aangepaste MATLAB-gebaseerde worm tracking software.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een vertegenwoordiger van video electrotaxis een wildtype jonge volwassen nematode en zijn positie en snelheid uitgangen van de worm tracking software wordt in aanvullende Video 1 en figuur 3. De bewegingsanalyse software zelf is de richting van het veld polariteit en het tijdstip van ompoling niet herkennen, maar eerder, moet deze informatie worden verkregen van de bron video. Dit kan worden gedaan met behulp van een audio-of visuele cue in de video of het opschrijven van experimentele...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Profiterend van de gedrags-fenomeen voor het eerst beschreven door Gabel en collega's en voortbouwend op de dielectrophoretic manipulatie werk van Chuang en collega's 11,12, onze microfluïdische gebaseerde electrotaxis test biedt een eenvoudige, robuuste en gevoelige methode om neuronale activiteit sonde in wormen met beweging als een uitgang. De analyse van de parameters verplaatsing mogelijk kwantitatieve vergelijking tussen de verschillende genotypen. De nauwkeurigheid van microkanaal fabricage en ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De microfluïdische electrotaxis assay technologie is octrooi aangevraagd in de Verenigde Staten van Amerika en Canada.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Canada Onderzoek Stoelen Program, Canadese Institutes of Health Research, en Ontario ministerie van Onderzoek en Innovatie bedanken door middel van hun Early Onderzoekers Award Programma voor financiële steun.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
| Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
| Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
| SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
| SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
| 92x16mm Petri Dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Bevat elastomer base en verhardingsmiddel | |
| Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
| Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
| Hotplate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
Referenties
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic. 17 (19), 2997-3009 (2008).
- Su, L. J., Auluck, P. K., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment. Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).
- Salam, S., Ansari, A., et al. A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans. , Submitted (2013).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrical sorting of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. Biomicrofluidics. 5 (4), 044116(2011).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control. Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702(2010).
- van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genet. 4, e1000027(2008).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).
- Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).
- Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement. BMC Genet. 6, 5(2005).
- Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -M. D. i, Hersen, P. Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis. PLoS One. 6 (2), e16637(2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
