Giant liposoombereiding for Imaging en patch-clamp elektrofysiologie

Samenvatting

Reconstructie van functionele membraaneiwitten in gigantische liposomen van gedefinieerde samenstelling is een krachtige aanpak in combinatie met patch-clamp elektrofysiologie. Echter, kunnen conventionele reus liposoom productie onverenigbaar met eiwitstabiliteit. We beschrijven protocollen voor het produceren gigantische liposomen uit pure lipiden of kleine liposomen die ionkanalen.

Samenvatting

De reconstitutie van ionenkanalen in chemisch gedefinieerde lipidemembranen voor elektrofysiologische opname is een krachtige techniek om de functie van deze belangrijke eiwitten te identificeren en te onderzoeken. Echter, klassieke bereidingen, zoals vlakke dubbellagen, beperken de manipulaties en experimenten die worden uitgevoerd op de gereconstitueerde kanaal en zijn membraan omgeving. De meer cel-achtige structuur van reusachtige liposomen traditionele patch-clamp experimenten toelaat zonder dat de controle van het lipide-omgeving.

Electroformation is een efficiënt middel om grote liposomen> 10 micrometer diameter die berust op de toepassing van wisselspanning een dunne, geordende lipide film afgezet op een elektrodeoppervlak. Aangezien de klassieke protocol gaat de lipiden worden afgezet uit organische oplosmiddelen, is niet compatibel met minder robuuste membraaneiwitten zoals ionkanalen en worden gewijzigd. Onlangs, protocols ontwikkeld om grote liposomen electroform uit gedeeltelijk gedehydrateerde kleine liposomen, die we hebben aangepast aan eiwit-bevattende liposomen in ons laboratorium.

Wij presenteren hier de achtergrond, uitrusting, technieken en valkuilen van electroformation van reusachtige liposomen van kleine liposoom dispersies. We beginnen met de klassieke protocol, die eerst moet worden beheerst voordat de meer uitdagende protocollen die volgen. We tonen het proces van gecontroleerde gedeeltelijke dehydratatie van kleine liposomen met dampevenwicht met verzadigde zoutoplossingen. Tenslotte tonen we het proces electroformation zelf. We zullen eenvoudige, goedkope apparatuur die kan worden gemaakt in huis om hoogwaardige liposomen en beschrijven visueel onderzoek van het preparaat bij elke fase om de beste resultaten te beschrijven.

Inleiding

Giant liposomen (vaak grote unilamellaire blaasjes of GUVs) zijn voornamelijk gebruikt in de fysica en fysische chemie van lipide bilagen, inclusief studies dubbellaag vervorming, laterale phase coëxistentie ("vlotten"), membraanfusie, etc ^1-4 bestuderen. Ze hebben een grove cel-structuur: bolvormige schil van membraan rond een waterige interieur dat gemakkelijk anders dan het omringende waterige buffer kan worden gemaakt. Ze worden per definitie ≈ 1-100 micrometer diameter, zodat ze kunnen worden afgebeeld met verschillende lichtmicroscopie benaderingen. Ze kunnen strak met osmotische gradiënten of mechanisch aangebrachte spanning worden gemaakt, zodat tijdens het algemeen zacht, hun eigenschappen kunnen worden gemanipuleerd voor eenvoudig gebruik. Met name het regelen van de "stijfheid" van het liposoom is het eenvoudig om "liposoom toegevoegd" of uitgeschakelde patches voor elektrofysiologie vormen. In het verleden werd ionkanaal reconstitutie grotendeels uitgevoerd in vlakke lipide bilayers. Nu de mogelijkheid om patches van grote liposomen en gebruik de aanzienlijke trilling van conventionele methoden ontwikkeld voor elektrofysiologie (fluorescentiemicroscopie micropipet aspiratie, snelle perfusie en temperatuur, etc.) met grote liposomen steeds aantrekkelijker voor reconstitutie studies ^5,6.

Giant liposomen door veel strategieën. In feite, reuze liposomen spontaan door een zwelling proces bij een gedroogde lipidefilm gehydrateerd ^4,7,8. De wens om sneller te bereiden grotere, meer uniforme liposomen leidde onderzoekers tot andere benaderingen, leider onder hen electroformation ^1,9. Electroformation steunt ook op hydratatie van droge lipide film, maar versnelt het proces de toepassing van een oscillerend elektrisch veld over de lipide film. Het veld wordt via twee elektroden, hetzij platina draden of indium-tin-oxide (ITO) gecoate objectglaasjes, gescheiden door water ofbuffer en waarop de lipiden worden afgezet. Door het versnellen van de zwelling van liposomen, bereikt men een hogere opbrengst van de grotere liposomen. Zo heeft electroformation uitgegroeid tot de standaard methode om gigantische liposomen produceren ^4.

Het mechanisme van electroformation niet volledig begrepen, en de meeste protocollen empirisch ontwikkeld (bijvoorbeeld ^10,11). Toch kunnen we een beetje over wat te verwachten bij het overwegen van de theorie en enkele empirische resultaten te leren. Het wordt algemeen aangenomen dat electroformation gebeurt door een elektro-osmotische stroming van buffer tussen afzonderlijke lipide bilagen gestapeld in de afgezette film lipide ^10,11. Elektrostatische koppeling thermische fluctuaties van de lipide bilagen is waarschijnlijk ook betrokken ^12. Deze hypotheses kwalitatief voorspellen plafonds voor het elektrische veld frequentie en kracht die kan worden gebruikt ^10,12. In het bijzonder wordt voorspeld dat oplossingen hoge geleidbaarheid ( dwz fysiologische zoutoplossingen) verminderen de elektrohydrodynamische krachten die het liposoom electroformation kunnen initiëren ^12. Elektro debieten algemeen af met toenemende zoutconcentratie en vaak piekte op een elektrisch veld oscillatiefrequentie (bijv. zij in een andere geometrie, Green et al.. ^13). Zo hogere veldsterktes en hogere frequenties zijn redelijk voor hoge geleidbaarheid oplossingen, binnen de grenzen ^10.

Echter, membraaneiwitten waarschijnlijk onverenigbaar met de gebruikelijke methode van aanbrengen van lipiden op elektroden voor electroswelling procedure, namelijk in organische oplosmiddelen worden vervolgens afgedampt in een dunne lipide film verlaten. Er zijn twee belangrijkste wegen rond deze moeilijkheid: om eiwitten te nemen na het gigantische liposoomvorming, of aan te passen hoe de lipiden worden afgezet. Onze benadering bouwt voort op anderen ^5,11 om de lipiden en gereconstitueerd deponerenstitueerde membraaneiwit samen uit een suspensie van kleine of grote "proteoliposomen". We beschrijven de langdurige en meer uitdagende proces van het produceren proteoliposomen uit gezuiverde eiwitten en lipiden elders (Collins en Gordon, in review). Hier beschrijven we het protocol in de afwezigheid van eiwit, maar het is hetzelfde als eiwit is opgenomen, we zijn waaruit blijkt dat proteoliposomen die het ionkanaal TRPV1 kunnen worden omgezet in GUVs en gebruikt voor patch-clamp elektrofysiologie. In elk electroformation benadering visueel onderzoek van het monster tijdens de lipide lipide depositieproces is essentieel voor het succes.

Onze aanpak kan dan de gespecialiseerde toepassing om ionkanaal reconstitutie relevant zijn. In de tijd omdat wij eerst dit protocol ontwikkeld en nu is ook aangetoond hoe de wijze welke lipiden worden afgezet op elektroden electroformation invloed op de samenstelling van de verkregen heterogeniteit GUVs. Baykal-Caglar et al.. ¹⁴ bleek dat GUVs gevormd uit zorgvuldig gedroogde liposomen hadden een 2,5 keer kleiner variaties in de mengbaarheid overgangstemperatuur van GUVs gevormd uit mengsels van verschillende fosfolipiden en cholesterol. Hun werk geeft aan dat lipiden, en in het bijzonder cholesterol, kan neerslaan uit de lipide mengsel bij afgezet uit organische oplosmiddelen, wat resulteert in grote ruimtelijke variatie in de samenstelling van de afgezette lipide film. Dit is vooral in studies van lipide membraan fasegedrag, maar kan ook van cruciaal belang kwantitatieve experimenten ionenkanalen. Protocol Baykal-Caglar et al.. 'S is vergelijkbaar, maar niet identiek aan onze eigen, en de lezers worden aangemoedigd om het te bestuderen als goed.

Dit protocol (zie overzicht, figuur 1) is een van vele die kunnen worden gebruikt. In principe electroformation succes hangt af van het lipidemengsel, hydratatie, temperatuur, andere opgeloste stoffen (vooral ionen), enNatuurlijk is de spanning en frequentie die in formatie. Zoals electroformation beter wordt begrepen, verwachten we ons protocol meer te verfijnen.

Tot slot, is er vaak een steile leercurve in elektrovormen gigantische liposomen. Wij stellen voor het beheersen van het conventionele protocol (afdelingen 1 en 4, en, indien nodig, sectie 5) voor het leren om lipiden storten van liposomaal schorsingen (secties 2-5).

Protocol

1. Afzetting van lipiden uit organische oplosmiddelen: Classical Protocol

1. Verwijderen van lipiden uit opslag bij -20 ° C of -80 ° C, warm tot kamertemperatuur. Let op: lipiden uiterst hygroscopisch en vele zijn gevoelig voor zuurstof. Cover lipiden in droge argon of stikstof gas en in alle stappen te minimaliseren blootstelling aan lucht.
2. Indien nodig, schorsen de lipiden in chloroform of cyclohexaan bij 1-10 mg / ml; mee dat verklaarde concentraties fabrikant zijn meestal nominaal slechts VOORZICHTIG: Draag geschikte handschoenen en andere persoonlijke beschermingsmiddelen bij het ​​gebruik van organische oplosmiddelen.. Verwijder de PPE snel als oplosmiddel wordt gemorst op hen, zoals de meeste materialen zijn nog steeds doorlaatbaar voor deze oplosmiddelen en ze bieden alleen tijdelijke bescherming.
3. Reinig beide zijden van twee 25 x 37,5 mm ITO gecoat glas dia's met ethanol
4. Meng de lipiden de gewenste molaire verhoudingen te bereiken. Voor elke 1 ^cm2 van de oppervlakte van ITO dia's te worden bekleed met lipid, mix ~ 15-20 ug van lipiden. Als bijvoorbeeld zowel 25 x 37,5 mm glijbanen waren volledig worden bekleed, we zouden gebruiken meestal 30 ui 10 mg / ml lipide mengsel. Opmerking: voeg 0,1 mol% Texas Red-DPPE voor fluorescentie beeldvorming en zie hieronder voor waarschuwingen over fluorescente kleurstoffen.
5. Controleer of de ITO gecoate zijde van de glasplaatjes is naar boven door het meten van de oppervlakte weerstand met een ohmmeter of multimeter.
6. Aspireren de lipiden in een solvent-resistente spuit. Let op: geen lijm of kunststof, andere dan PTFE, moeten contact opnemen met het organische oplosmiddel.
7. Met de naald niet helemaal het aanraken van de ITO-oppervlak, langzaam gelden de lipide verplaatsen van de naald heen en weer over de glijbaan. Bedek het oppervlak zo gelijkmatig, op zoek naar een "regenboog glans" op het glasoppervlak.
8. Plaats de dia's snel onder <1 Torr (1 mmHg) vacuüm voor 0,5-1 uur om eventuele sporen oplosmiddel te verwijderen. Los vacuüm met inert gas.
9. Breng een siliconen pakking, met eendunne laag siliconen vacuüm vet aan beide zijden. Laat ten minste 5 mm onbedekt dia blootgesteld aan een uiteinde van de schuif.
10. Ga onmiddellijk door Sectie 4.

2. Kleine liposoombereiding voor Controlled Uitdroging

1. Bereid het lipide mengsel in stap 1,1-1,4.
2. Droog de lipiden met een stroom van argon of stikstof gas in een 10-15 mm diameter cultuur buis. Voor kleine hoeveelheden lipiden, ≤ 0,5 mg, de resulterende film kan gehydrateerd worden direct na het onder vacuüm voor 0,5-1 uur om resterende oplosmiddel te verwijderen, gaat u naar stap 2.5. Grotere hoeveelheden lipiden hebben de neiging om organische oplosmiddelen, zelfs onder vacuüm val in een dikke gel, en zijn beter voorbereid door vriesdrogen; zie stappen 2,3-4.
3. Suspendeer het gedroogde lipide film in cyclohexaan, deksel met Argon en sluit de fles hermetisch Plaats de buis in een koude blok en invriezen bij -80 ° C gedurende 1 uur minimum.
4. Leg de koude blok en lipide monster in een vacuümsysteemstaat het bereiken van 100 mTorr. Solliciteer vacuüm, het zal "stal" op ongeveer 1 Torr als oplosmiddel sublimeert af. Zodra oplosmiddel wordt volledig verwijderd (~ 1 uur) vacuüm zal dalen tot onder dit niveau. Los vacuüm met inert gas en sluit de buis of hydrateren onmiddellijk.
5. Terwijl de lipiden zijn onder vacuüm, ontgassen hydratatie buffer met behulp van vacuüm en spoelen ^15-17.
6. Hydrateren de lipiden met ontgaste buffer bij uiteindelijke concentratie 1-10 mg / ml. Laat de lipiden te hydrateren langzaam. Na 30 min-1 uur, vortex te breken resterende klonten. Wacht een extra 0,5-1 uur voor volledige hydratatie. Gebruik een osmoticant, zoals sorbitol of sucrose tot 200 mM, volledige dehydratie in volgende stappen te voorkomen.
7. Bereid 100-200 nm diameter liposomen door extrusie. Zie fabrikant extrusie-protocol voor meer informatie. Merk op dat de buffer moet minder dan ~ 25 mM ionsterkte of speciale electroformation voltage protocollen vereist in paragraaf 4.

3.Afzetting van lipiden door de gecontroleerde Uitdroging van Kleine liposomen

1. Opgelet: Ons protocol vereist lipiden in evenwicht met damp verzadigde zoutoplossingen urenlang worden geplaatst. We raden het uitvoeren van het protocol in een inerte atmosfeer gas, met een handschoen doos of soortgelijke behuizing.
2. Let op: Als voorbereiding monsters bevattende eiwitten, vermijd volledige uitdroging. Hydrateren de sfeer in een afgesloten ruimte met een beker warme water, of een sonicator gebaseerde luchtbevochtiger. Gebruik een hygrometer om te zorgen voor ten minste 30% relatieve vochtigheid. Gebruik sorbitol of sucrose in de kleine liposoom buffer als extra voorzorgsmaatregel om totale uitdroging te voorkomen.
3. Bereid een verzadigde zoutoplossing van passende relatieve vochtigheid. Target vochtigheid afhankelijk van de osmolariteit van de vesicle preparaat. Voor preparaten met fysiologische osmolariteit, gebruiken 30-45% relatieve luchtvochtigheid, terwijl een lage osmolariteit vesiclepreparaten adequaat uitgedroogd kan zijn inevenwicht met 75-90% RH (zie ook tabel 1).
4. Zet de verzadigde zoutoplossing en teveel zout in een goed afsluitbare container met een interieur plank. Commerciële voedsel containers voor yoghurt en muesli werken heel goed. Vervang de plank na het vullen, en zorg ervoor dat vocht is 5-10 mm onder de plank.
5. Schoon ITO gecoate glaasjes zoals in deel 1. Gebruik de multimeter om te bepalen welke kant is geleidend, en het etiket van de niet-geleidende kant met de naam monster.
6. Vet beide zijden van de silicone (USP klasse VI) pakking (s) met een of meerdere gaten.
7. Plaats de dia's geleidende kant naar boven op de bank, en de toepassing van de siliconen pakking (s) aan elke dia waaraan lipide zal worden toegepast, zorg ervoor dat er minstens 5 mm van de glijbaan aan de ene kant aan te sluiten op de electroformation apparaat. Strijk de pakking om een ​​goede afdichting te garanderen.
8. Verdun het blaasje voorbereiding op een zoutarm isosmotic buffer om ~ 1-2 mg / ml. Wij vinden dat hogere concentraties produceren slechte resultaten.
9. Toepassing lipide om de dia in 1-10 pl druppels. Kleinere druppels produceren in het algemeen betere resultaten.
10. Plaats de dia op het interieur plank boven de verzadigde zoutoplossing en sluit de verpakking goed. Voeg bij kamertemperatuur gedurende 3 uur tot O / N. De houder kan worden geplaatst bij 4 ° C, maar merk op dat voor sommige zouten, de RV sterk afhankelijk van temperatuur, en dat kou evenwichtstijdstip toenemen.
11. De resulterende film mogen een lichte regenboog glans aan het, maar in ieder geval zou moeten verschijnen bijna uitgedroogd. Zeer osmotische starten oplossingen kunnen onmogelijk volledig drogen aan een lipide film te zijn, dit geen nadelige invloed op de resultaten.

4. Electroformation van Giant Liposomen

1. Lipide films, vooral gevormd uit gedehydrateerde liposomen zijn gemakkelijk zorgvuldig hydraat elk putje verdreven. Door een 27 G injectienaald aan de rand van de pakking en langzaam toepassen buffer. Buffers kunnenonder water, ≤ 200 mM sucrose, ≤ 1 M sorbitol en ≤ 5 mM HEPES. Meer dan 10 mM zout oplossing kan alternatieve electroformation spanning protocollen nodig. Overvulling elke pakking goed met ~ 10%.
2. Opmerking: zodra de lipiden zijn gehydrateerd, gaat snel door de resterende stappen, omdat lipide films direct beginnen te delamineren. Opbrengst en grootte worden gemaximaliseerd als electroformation begint onmiddellijk.
3. In een vloeiende beweging, breng dan een tweede ITO glijbaan, geleidende gezicht in, naar de top van de pakking. Zorg ervoor dat u ten minste 5 mm overhang hebben buiten de pakking en tegenover de eerste overhang. Druk voorzichtig om een ​​goede afdichting te garanderen.
4. Reinig de twee overhangen met ethanol en controleer of zijden tegenover de pakking zijn geleidend met uw multimeter.
5. De kamer kan verder worden beveiligd met parafilm of lichte trekveer clips indien gewenst.
6. Sluit de electroformation kamer met een spanningsbron door het veiligstellen van aluminium of koperen staven, "EMI Gasket schuim "of geleidende kleefband voor geleidende oppervlakken van de beide schuiven. We gebruiken EMI gasket schuim. plannen voor een jig en klem worden getoond in Figuur 5.
7. Controleer of er geen kortsluiting tussen de contacten, en dat de contacten correct verbinden aan de ITO oppervlakken, met behulp van de multimeter.
8. Verwarm de kamer 10 ° C boven het hoogste smeltpunt van een van de onderhavige lipiden, bijv. DPPC, warmte tot 52 ° C minimaal, 10 ° C boven de smelttemperatuur van keten 42 ° C.
9. Voor zoutarme buffers, breng dan een 10 Hz sinus, ~ 0,7 V _rms voor elke millimeter ruimte tussen de twee ITO gecoate oppervlakken, voor 60-90 minuten. Voor hoge zout buffers, moeten andere spanning protocollen worden gebruikt (zie referenties).

5. Imaging en probleemoplossing

1. Beeld het liposoom met een omgekeerde microscoop uitgerust met een filter kubus Rhodamine of Texas Red kleurstoffen. De liposoom moet bolvormig zijnvoornamelijk unilamellair op het oog, en vrij van gebreken, zoals "strings" opknoping van het liposoom.
2. Als de liposomen te klein, minder vet.
3. Als er veel of weinig defecten liposomen kan dit door gel-fase lipiden. Overwegen om de electroformation temperatuur.
4. Als er maar weinig of geen gigantische liposomen gevormd bij allen van gedroogde kleine liposomen, verminderen de osmotische sterkte van het liposoom buffer, of verhoging van de osmotische sterkte van de electroformation buffer. Een inschakelstroom van buffer in de geconcentreerde interstitiële bufferoplossing kan veroorzaken delaminatie van de gedeponeerde lipidefilm.
5. Als blaasje opbrengst, kwaliteit, of grootte is slecht, en u opgenomen zouten of pH buffers in de electroformation of liposoom buffers, overwegen alternatieve electroformation spanning protocollen. Bijvoorbeeld, Pott, et al.. ^11, raden een drie stappen protocol met behulp van een 500 Hz sinus, het verhogen van de spanning van 50-1,300 Vpp / m meer dan 30 min., houden gedurende 90 minuten, den verminderen van de frequentie 50 Hz gedurende 30-60 minuten. Platina of titanium elektroden nodig zijn in dit geval, maar dit zal niet wezenlijk veranderen protocol.

Resultaten

In onze voorbeelden hebben we liposomen bereid uit een mengsel van ongeveer 55 mol% POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-fosfocholine), 15 mol% POPS (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-fosfoserine , 30 mol% cholesterol, en 0,1 mol% Texas Red-gelabelde 1,2-dipalmitoyl-sn-fosfoethanolamine (TxR-DPPE). Deze samenstelling werd gekozen als ongeveer vertegenwoordiger van dorsale wortel ganglion lipiden ^18. We merken op dat 15 mol% opgeladen lipide (hier POPS) ligt in de buurt van de grens v...

Discussie

Electroformation van reusachtige liposomen heeft zich ontwikkeld tot een flexibele techniek die compatibel is met diverse lipiden, preparaten en buffers. Zorgvuldige controle van het lipide afzetting is het meest essentieel voor het succes. We hebben eenvoudige hulpmiddelen gepresenteerd aan gecontroleerde afzetting van lipiden uit kleine liposoompreparaten een eenvoudig proces te maken. De relatieve vochtigheid is essentieel voor juiste dehydratatie van de oorspronkelijke liposomen, en de optimale waarde afhankelijk va...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Digital Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A of soortgelijk	Je kunt elk multimeter gebruiken, maar vermijd oude analoog ohmmeters die veel meer stroom aan de weerstand onder test toepassen.
	Fluke	117 of 177	Je kunt elk multimeter gebruiken, maar vermijd oude analoog ohmmeters die veel meer stroom aan de weerstand onder test toepassen.
Functiegenerator	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A of soortgelijk	De meeste functiegeneratoren werken voor eenvoudige protocollen. Dit programmeerbare model is nuttig voor geavanceerde elektroformatie protocollen. Zorg ervoor dat de generator 10 V piek-naar-piek in een 50 Ω lading kan aandrijven
ITO gecoate glazen platen	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 of soortgelijk	Breek deze in twee om twee platen te maken, 25 mm x 37 mm
Temperatuurregelaar	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 of soortgelijk
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Siliconenrubber plaat	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Gebruik USP Grade VI silicone voor zijn hoge zuiverheid
EMI afdichting	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 of soortgelijk	Gedistribueerd door Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Er zijn andere fluorescent gelabelde lipiden beschikbaar, maar TxR-DHPE is een van de helderste en meest fotostabiele.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P of 850457C	Lipiden kunnen worden besteld als poeders (P) of in chloroform (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667